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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Antiserums gegen das steroidbindende Globulin.
Es ist bekannt, dass unter den als ss-Globuline bezeichneten Plasmaproteinen ein Eiweisskörper vorkommt, der eine besondere Affinität zu Steroidhormonen besitzt und deshalb als steroidbindendes ss-Globulin bzw. testosteronbindendes Globulin bezeichnet wird. Es wurde bereits vorgeschlagen (DE-OS 2221261), dieses auch als ss1-AP-Glykoprotein bezeichnete Protein aus Plazenten oder aus dem Blut von Schwangeren zu isolieren, Es ist jedoch bisher nicht gelungen, dieses ss-Globulin in reiner Form darzustellen. Das hat insbesondere den Nachteil, dass bei der Gewinnung von Antiserum, das gegen dieses Protein gerichtet ist, die Verunreinigungen, auch wenn sie in noch so geringer Konzentration vorkommen, in den immunisierten Tieren ebenfalls zur Antikörperbildung führen und dadurch unspezifische Reaktionen der Antiseren bedingen.
Es wurde nun ein neues Derivat des steroidbindenden ss-Globulins gefunden, welches im folgenden "steroidbindendes Globulin" genannt wird und das in sehr reiner Form hergestellt werden kann. Dieses neue Derivat des steroidbindenden ss-Globulins entspricht in seinen biologischen Eigenschaften weitgehend dem ursprünglichen steroidbindenden ss-Globulin und ermöglicht es, von damit immunisierten Tieren ein Antiserum hoher Spezifität zu gewinnen. Das neue Derivat des steroidbindenden ss-Globulins kann durch Behandlung dieser Substanz mit dem Enzym Neuraminidase erhalten werden.
Das neue steroidbindende Globulin ist ein Glykoprotein mit einer besonderen Affinität zu Steroid-
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2, 6%Neuraminsäure-Gehalts derjenigen entspricht, wie sie für das steroidbindende ss-Globulin erstellt werden kann. Das neue Globulin wird durch ein gegen das steroidbindende ss-Globulin gerichtetes Antiserum präzipitiert. Die elektrophoretische Beweglichkeit entspricht der eines Gammaglobulins. Das in
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8dodecylsulfathaltigen Polyacrylamidgel wandert das neue Protein im elektrischen Spannungsfeld mit oder etwa schneller als Albumin, woraus sich ein Molekulargewicht von 65000 : 5000 ableiten lässt.
Nach Inkubation des Proteins vor der Auftrennung in einer 1%igen Natriumdodecylsulfat1ösung wird eine Wanderungsstrecke der Proteinzone gemessen, die mit humanem Plazentenlaktogen vergleichbar ist, wodurch ein Molekulargewicht von < 20000 kalkulierbar ist. Demnach ist ein Molekularaufbau aus vier Untereinheiten, die ein Molekulargewicht von jeweils etwa 16000 besitzen, anzunehmen.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäss ein Verfahren zur Herstellung eines Antiserums gegen das steroidbindende Globulin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Tiere nach bekannten Methoden mit einem steroidbindenden Globulin, welches a) eine besondere Affinität zu Steroidhormonen,
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N-acetyl-Neuraminsäure, und 0, 1 ¯ 0,1% Fucose, c) die Präzipitierbarkeit mit gegen steroidbindendes ss-Globulin gerichteten Antiseren, d) eine elektrophoretische Beweglichkeit entsprechend dem Gammaglobulin, e) eine Sedimentationskonstante von 4, 1 : ! : 1, 0 S, gemessen in Phosphatpuffer bei PH=6, 8, f) eine Sedimentationskonstante von 1, 1 : ! : 0, 3 S, gemessen in 1%iger Natriumdodecylsulfatlösung, und g) ein Molekulargewicht von 65000 : ! :
5000 aufweist, immunisiert und aus dem Blut der Tiere das
Serum gewinnt.
Das erfindungsgemäss eingesetzte, neue steroidbindende Globulin kann dadurch erhalten werden, dass steroidbindendes ss-Globulin zuerst aus Körperflüssigkeiten oder Gewebeextrakten, die dieses Protein in messbaren Konzentrationen enthalten, beispielsweise aus menschlichen Seren, vorzugsweise aus dem Blut von Schwangeren, Retroplazentarserum oder Plazentenextrakten isoliert, danach mit Neuraminidase behandelt und in einem abschliessenden Reinigungsschritt, vorzugsweise durch Chromatographie, an einem
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Anionenaustauscher oder durch eine entsprechende Massnahme, z. B. durch eine Elektrophorese, in reiner
Form dargestellt wird.
Die Isolierung des steroidbindenden ss-Globulins erfolgt durch eine ausgewählte Kombination von
Methoden, die einerseits zur Anreicherung des steroidbindenden ss-Globulins, anderseits zur Abtrennung dieses Proteins von den übrigen Plasmaproteinen führt. Ohne dass daraus eine Einschränkung herzuleiten wäre, sollen im folgenden Möglichkeiten beispielhaft aufgezeigt werden, die ein zur Herstellung des Derivats des steroidbindenden ss-Globulins geeignetes Ausgangsmaterial liefern.
Dazu werden zerkleinerte Plazenten mit Wasser oder einer verdünnten Salzlösung, vorteilhaft mit einer etwa 0, 5% igen Kochsalzlosung, extrahiert. Aus dem Extrakt wird durch Zusatz einer wässerigen
Lösung eines wasserlöslichen Derivats einer Acridinbase, vorteilhaft mit Diaminoäthoxyacridinlaktat, das bis zu einer Konzentration von 0, 25 bis 0, 55, vorteilhaft von 0, 4% der Lösung zugegeben wird, bei schwach saurem bis neutralem pH-Wert im Bereich von PH=5 bis PH=7, vorteilhaft bei PH=6, eine Vorfällung abgetrennt, die das gewünschte Protein nicht oder nur in Spuren enthält.
Anschliessend wird im alkalischen PH-Bereich von PH=7 bis PH=9, vorteilhaft bei PH=8, 5, aus dem Überstand der ersten Fällung das steroidbindende ss-Globulin durch Zusatz einer wässerigen Lösung eines wasserlöslichen Derivats einer Acridinbase, vorteilhaft wieder mit Diaminoäthoxyacridinlaktat, das bis zu einer Konzentration von 0, 55 bis 1, 1%, vorteilhaft von 0, 8%, der Lösung zugesetzt wird, präzipitiert. Der Niederschlag wird nach dessen Suspension in Wasser und anschliessender Erniedrigung des PH-Wertes mit Hilfe von schwachen Säuren in Lösung gebracht und durch Zugabe von geeigneten Adsorptionsmitteln, z. B. Aktivkohle, vom Fällungsmittel befreit und durch Zentrifugation abgetrennt.
Besonders einfach erfolgt die Abtrennung des Fällungsmittels vom Protein durch Aufschwemmung der Fällung in einer chloridhaltigen wässerigen Lösung, vorteilhaft in einer etwa 5% eigen Kochsalzlösung, wobei das Fällungsmittel präzipitiert und danach durch Filtration oder Zentrifugation entfernt wird, während die Proteine in Lösung gehen. Zur weiteren Anreicherung des steroidbindenden ss-Globulins wird eine Fällung mit geeigneten Salzen, vorteilhaft mit Ammoniumsulfat, in der Weise durchgeführt, dass die Konzentration des Salzes das steroidbindende ss-Globulin aus der Lösung verdrängt. Hiezu ist bekannt, dass Globuline von Ammoniumsulfat bei dessen Sättigungskonzentration von etwa 50% präzipitiert werden.
Nach Wiederauflösen des durch Zentrifugation oder Filtration gewonnenen Präzipitats wird zu der Lösung ein niedriger Alkohol, vorteilhaft Äthanol, bis zu einer Konzentration zugesetzt, bei der das steroidbindende ss-Globulin noch nicht niedergeschlagen, eine Reihe von Verunreinigungen jedoch als Fällung abgeschieden werden kann.
Es hat sich als zweckmässig erwiesen, etwa 25% Äthanol zuzufügen, wobei die Zugabe des Äthanols zur Vermeidung von Denaturierungserscheinungen unterhalb Raumtemperatur, vorzugsweise bei einer Temperatur um 0 : 4 C erfolgt. Durch Fraktionierungsmethoden, die Proteine mit Molekulargewichten zwischen 50000 und 150000 in definierten Bereichen anzureichern imstande sind, kann das steroidbindende ss-Globulin weitergereinigt werden. Besonders geeignet sind hiefür Massnahmen der Gelfiltration, beispielsweise Säulenchromatographie-Schritte unter Verwendung von mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran, beispielsweise Sephadex G-150 der Firma Pharmacia, Uppsala. Die Gelfiltration kann gewünschtenfalls auch im Anschluss an eine Dialyse gegen eine verdünnte Pufferlösung, z. B. gegen O.
Olmolare Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäure-Pufferlösung von PH=7, 5 bis 8, 5, vorzugsweise PH=8, 0, durchgeführt werden. Zur Elution kann beispielsweise O. lmolarer Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäurepuffer vom PH-Wert 8 dienen, der pro Liter 1 Mol Natriumchlorid enthält. Bei diesem Elutionsverfahren wird das steroidbindende ss-Globulin in dem Bereich der Molekulargewichte von etwa 100000, häufig unmittelbar nach dem 7-S-Gammaglobulin des Plasmas, eluiert.
Unter Ausnutzung der elektrischen Eigenschaften des steroidbindenden ss-Globulins lassen sich zu
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von Diaminoäthyl-Austauschern auf der Basis von vernetztem Dextran, im Handel als DiaminoäthylSephadex der Firma Pharmacia, Uppsala, erhältlich, im PH-Bereich von etwa 4, 5 bis 9 adsorbiert und ist davon durch Elution mit Pufferlösungen steigender Ionenstärke zu gewinnen. Vorteilhaft werden zwei Fraktionierungen an basischen Ionenaustauschern ausgeführt, einmal durch Adsorption und fraktionierte Elution des steroidbindenden ss-Globulins bei schwach saurem PH-Wert, beispielsweise PH=5, 0, und ein zweites Mal in neutralem bis schwach alkalischem PH-Bereich, beispielsweise PH=7, 0.
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Besonders geeignet als Reinigungsoperation ist die präparative Zonenelektrophorese, die in Kombination mit Molekularsiebverfahren gute Erfolge zeigt.
Auch das zonenelektrophoretische Verfahren mit Hilfe von Trägersubstanzen wird vorteilhaft in zwei verschiedenen PH-Bereichen durchgeführt, einmal im alkalischen PH-Bereich, beispielsweise PH=8, 6, wobei die Zone des ss-Bereiches der Plasmaproteine gewonnen wird und das andere Mal im schwach sauren PH-Bereich, beispielsweise PH=5, wobei die entsprechende, das steroidbindende ss-Globulin enthaltende Zone herausgeschnitten wird. Die Reihenfolge dieser Massnahmen ist dabei nicht zwingend.
Wird die Elution des Proteins aus dem Trägermaterial der Elektrophorese mit einem flüchtigen Puffer, beispielsweise Ammoniumhydrogencarbonat, vorgenommen, lässt sich eine Gefriertrocknung des Verfahrensproduktes direkt anschliessen.
Bei Verwendung von Plasma als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von steroidbindendem ss-Globulin kann genauso verfahren werden wie beim Plazentenextrakt. Es erscheint lediglich die Vorfällung mit Acridinsalzen im schwach sauren PH-Bereich nicht erforderlich.
Zur Gewinnung des neuen Derivats des steroidbindenden ss-Globulins wird die nach den oben beschriebenen oder vergleichbaren Reinigungsoperationen erhaltene Substanz in einem Puffer gelöst, dessen PH-Wert den angenähert optimalen Bedingungen der Neuraminidase für die Abspaltung der Neuraminsäure aus dem Substrat durch Neuraminidase entspricht.
Die Inkubation des steroidbindenden ss-Globulins mit Neuraminidase wird so lange durchgeführt, bis der Neuraminsäuregehalt dieses Proteins auf 0, 5 t 0, 5%, also weniger als 1%, abgesunken ist.
Für die Behandlung von steroidbindendem ss-Globulin sind Glykoprotein-N-acetylneuraminylhydrolasen, klassifiziert unter EC. 3. 2. 1. 18, sogenannte Neuraminidasen vorzugsweise mikrobiellen Ursprungs, geeignet, insbesondere bakterielle Neuraminidasen wie die entsprechenden Enzyme aus Vibrio cholerae, Pneumokokken oder Clostridium perfringens. Bei Verwendung einer Neuraminidase aus Vibrio cholerae wird die Inkubation im pH-Bereich 5 bis 7, vorzugsweise bei PH=5, 5, in einem in der Enzymologie gebräuchlichen Puffer, vorteilhaft in einer Pufferlösung aus Trishydroxymethylaminomethan oder Natriumacetat, durchgeführt. Dabei werden auf 100 mg Protein 50 bis 500 Einheiten Neuraminidase zuge-
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säuregehalts des Proteins, nämlich auf etwa 0, 5%, zeigen wie 5 h bei 20 C.
Wie jedem Enzymologen bekannt, sind Reaktionen dieser Art unter den verschiedensten Bedingungen durchzuführen, so dass auch mit einer andern, niedrigeren als angegebenen Konzentration an Neuraminidase bei entsprechend längerer Inkubationsdauer, insbesondere bei etwas erhöhten Temperaturen und Zusatz von Aktivatoren des Enzyms, der gleiche Effekt, nämlich die Entfernung der Neuraminsäure aus dem steroidbindenden ss-Globulin, erreicht werden kann, mit andern Worten, das neue Derivat dieses Proteins hergestellt werden kann. Einige Neuraminidasen werden durch Erdalkaliionen aktiviert. Besonders geeignet für die Aktivierung der Neuraminidase aus Vibrio cholerae sind bekanntlich Calciumionen, die in Form von wasserlöslichen Salzen, wie Calciumchlorid, in einer Konzentration von 0, 1 bis 1 mg/ml der Inkubationslösung zugesetzt werden können.
Die Menge der einzusetzenden Neuraminidase ist durch folgende Definition der Einheiten gegeben :
Eine Neuraminidase-Einheit ist die Menge des Enzyms, die benötigt wird, um 1 pg N-Acetylneuraminsäure aus humanem al-Glykoprotein in 0, 05molarem Natriumacetatpuffer vom PH-Wert 5, 5 mit dem Zusatz von 9 mg/ml Kochsalz und 1 mg/ml Calciumchlorid in 15 min bei 37 C freizusetzen (E. Mohr und G.
Schram, Z. Naturf. 15b, S. 568,1960).
Das durch die Neuraminsäure-Abspaltung gegenüber dem Ausgangsmaterial stärker basisch gewordene Proteinderivat wird weniger an basische Anionenaustauscher gebunden und ist deshalb durch eine Chromatographie an beispielsweise Diaminoäthyl-Ionenaustauscher von restlichen Verunreinigungen und auch von eventuell noch vorhandenem unverändertem Ausgangsmaterial zu befreien.
Die Ladungseigenschaft des neu gewonnenen Derivats erlaubt die Abtrennung der Verunreinigungen auch auf elektrophoretischem Weg. Die das Derivat des steroidbindenden ss-Globulins enthaltenden Eluate können konzentriert, dialysiert und ohne Denaturierungserscheinungen lyophilisiert werden.
Das steroidbindende Globulin liefert in der elektrophoretischen Analyse eine einheitliche Linie, in der Ultrazentrifugen-Analyse eine einheitliche Bande. Es reagiert mit Antiserum gegen das steroidbindende
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j-Globulin wie das ursprüngliche Protein. Es bindet wie das ursprüngliche Protein Steroide, insbesondere Testosteron und Östradiol.
Das erfindungsgemäss verwendete, neue steroidbindende Globulin ermöglicht durch Immunisierung mit dem reinen Antigen die Gewinnung spezifischer Antiseren für Bestimmungsmethoden des steroidbindenden ss-Globulins. Diese Methoden erlauben, Störungen des Steroid-Haushalts bzw. Änderungen im Gehalt des steroidbindenden ss-Globulins in Plasma oder Geweben z. B. im Verlauf von Krankheiten festzustellen und zu verfolgen.
Nachstehend wird die Gewinnung des neuen, steroidbindenden Globulins veranschaulicht.
Isolierung des steroidbindenden ss-Globulins aus Plazenten :
10 kg menschliche Plazenten werden in tiefgefrorenem Zustand zerkleinert und mit 10 l einer 0, 5% eigen Natriumchloridlösung extrahiert (1 h bei 5 C). Alle im nachfolgenden beschriebenen Operationen werden,
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10 l der Extraktionslösung werden mit 20% iger Essigsäure auf PH=6, 0 eingestellt und zunächst mit
1500 ml einer 3% igen 6, 9-Diamino-2-äthoxyaeridinlaktat-Lösung ("Acridinsalz-Losung") versetzt. Die inaktive Vorfällung wird durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Der Überstand wird mit 2n Natriumhydroxydlösung auf PH=8 5 eingestellt und mit 3 1 Acridinsalz-Lösung gefällt. Die Fällung, die das steroidbindende Globulin enthält, wird zentrifugiert. Der flüssige Überstand wird verworfen, der Niederschlag wird in 6 l einer 5% igen Natriumchloridlosung suspendiert.
Nach Abzentrifugation der aufgetretenen Fällung wird dem Überstand festes Ammoniumsulfat bis zu einer 50% igen Sättigung zugefügt.
Dabei bildet sich ein Niederschlag, der abzentrifugiert wird.
Die als Zentrifugat erhaltene feuchte, ammoniumsulfathaltige Paste (250 g) wird in 1000 ml Wasser gelöst, gegen deionisiertes Wasser dialysiert und zur Abscheidung eines Teiles der Begleitproteine bei PH=7, 0, einer Leitfähigkeit von 10 mS (Einstellung mit einer 5% igen Kochsalzlösung) und einer Temperatur von 0 C mit Äthanol bis zu einer Konzentration von 25% versetzt. Den dabei entstehenden Niederschlag zentrifugiert man ab und verwirft ihn ; der Überstand, der die Hauptmenge des steroidbindenden ss-Globulins enthält, wird gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Die Weiterreinigung erfolgt durch Gelfiltration an Sephadex G-150 (mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran, hergestellt von der Firma Pharmacia, Uppsala), (Säule 20 x 100 cm) unter Verwendung eines 0,01 m Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffers, PH=7, 0.
Der Nachweis des steroidbindenden ss-Globulins in den Eluaten wird immunologisch mit einem spezifischen Antiserum im Geldiffusionstest durchgeführt. Die positiven Fraktionen, 1400 ml, werden gepoolt und zur weiteren chromatographischen Reinigung an einer Diaminoäthyl-Sephadex-Säule (5 x 20 cm) adsorbiert.
Die Elution der Proteine von der Diaminoäthyl-Sephadex-Säule erfolgt mit 0, 01 m Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer unter Verwendung eines Kochsalzgradienten von 0 bis 2%. Der Nachweis des steroidbindenden ss-Globulins im Eluat wird wieder immunologisch geführt ; die das steroidbindende ss-Globulin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, 900 ml, und mit 35% (Gew./Vol.) Ammoniumsulfat gefällt. Die sich dabei ausbildende Fällung wird durch Zentrifugation gewonnen und der Niederschlag in Wasser aufgelöst, zuerst gegen Wasser und anschliessend gegen 0, 1 m Natriumdiäthylbarbituratpuffer von PH=8, 6 dialysiert. Die weitere Auftrennung der Proteine des Dialysats im elektrischen Feld erfolgt mit der von Heide et al.
(1964) beschriebenen Apparatur und Methode ; als inertes Trägermaterial dient Polyvinylchlorid (Geon X 427 ; Hersteller Goodrich Chem. Comp., Cleveland/Ohio, USA), als Puffer wird eine 0, 1 m Natriumdiäthylbarbituratlösung (PH=8, 6) verwendet. Das steroidbindende ss-Globulin wandert in der ss1-Zone ; es wird daraus mit dem mehrfachen Volumen des Trägers mit 0, 9%iger Kochsalzlösung eluiert und nach Entfernung der Salze durch Dialyse gegen Wasser mit Ammoniumsulfat [35% (Gew./Vol.)] gefällt.
Die Fällung wird in 500 ml Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer, PH=5, 0, aufgelöst und gegen einen 0, 01 m Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer, PH=5, 0, dialysiert. Anschliessend lässt man die Lösung über eine Diaminoäthyl-Sephadex-Säule (5 x 25 cm) laufen, die mit dem gleichen Puffer (PH 5, 0) equilibriert worden war. Ein Teil der Proteine bleibt zusammen mit dem steroidbindenden ss-Globulin an der Säule adsorbiert und kann dann unter Anwendung eines linearen Kochsalzgradienten von 0 bis 2% eluiert werden. Die Eluate, die das steroidbindende ss-Globulin enthalten, werden vereinigt, neutralisiert und durch Zusatz von 40% (Gew./Vol.) Ammoniumsulfat präzipitiert.
Für die anschliessende präparative
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Zonenelektrophorese bei PH=5,0 ist das Trägermaterial wieder Geon X 427 ; als Puffer wird eine 0, 15 m Natriumazetatlösung von PH=5, 0 verwendet. Das steroidbindende ss-Globulin wandert bei diesem PH anodisch ; es wird mit physiologischer Kochsalzlösung aus der entsprechenden Zone eluiert und nach Neutralisation der Lösung durch Zusatz von 40% (Gew. /Vol.) Ammoniumsulfat ausgefällt.
Steroidbindendes ss-Globulin kann auf die gleiche Weise aus Serum, insbesondere Retroplazentarserum, gewonnen werden. Dazu werden als Ausgangsmaterial für die Fraktionierung wie vorstehend angegeben statt 10 l Gewebeextrakt 5 1 Serum eingesetzt, das mit 5 l destilliertem Wasser verdünnt wird.
Neuraminidasebehandlung des steroidbindenden ss-Globulins :
Zur Abspaltung der Neuraminsäure werden 150 mg steroidbindendes ss-Globulin in 30 ml 0, 01 m Trishydroxymethylaminomethan-Puffer von PH=5, 5, der 0, 2 mg CaC12/ml enthält, gelöst und mit 500 Einheiten Neuraminidase aus Vibrio cholerae 20 h bei 4 C inkubiert.
Anschliessend reinigt man das modifizierte Protein durch Chromatographie an Diaminoäthyl-Sephadex (vernetztes Dextran, Hersteller : Firma Pharmacia, Uppsala) (2, 5 x 20 cm) unter Verwendung eines 0, 01 m Trishydroxymethylamino- methan-HCl-Puffers vom PH=5, 5. Das Derivat des steroidbindenden ss-Globulins wandert dabei ungehindert durch die Säule hindurch, während die im Ausgangsmaterial noch vorhanden gewesenen Verunreinigungen adsorbiert bleiben. Das proteinhaltige Eluat wird in einer Kollodiumhülse (Sartorius-Membranfilter-Gesell- schaft) eingeengt, gründlich gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisiert.
Beispiel zur Herstellung des Antiserums
Zur Herstellung eines spezifischen Antiserums werden Kaninchen mit dem gereinigten steroidbindenden Globulin unter Verwendung von Aluminiumhydroxyd als Adjuvans über einen Zeitraum von sechs Wochen immunisiert.
10 mg steroidbindendes Globulin werden in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und unter Zusatz von 0, 2 g Aluminiumhydroxyd zu einer Suspension verrührt. Die Kaninchen erhalten an fünf aufeinanderfolgenden Tagen je 1 ml dieser Suspension pro Tier i. v. injiziert. Anschliessend lässt man die Tiere neun Tage ruhen. Dann immunisiert man wieder an fünf aufeinanderfolgenden Tagen mit der oben angegebenen gleichen Menge Antigen, lässt die Tiere wieder neun Tage ruhen und injiziert nochmals an fünf aufeinanderfolgenden Tagen je 1 ml der Antigenpräparation. Nach einer erneuten Wartezeit von sieben bis neun Tagen werden die Tiere entblutet. Nach dem Gerinnen des Blutes wird das Serum vom Blutkuchen abgeschleudert und gewonnen.