DE2445677C2 - Hochmolekulares alpha-Globulin und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Description

2. Verfahren zur Anreicherung des hochmolekularen a-Globjlins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Organextrakte oder Hämolysate von Erythrozyten oder daraus gewonnene Lösungen, die dieses Protein enthalten, mindestens einer der folgenden Maßnahmen unterworfen werden und die bezüglich des hochmolekularen «-Globulins angereicherte Fraktion gewonnen wird:

a) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer Acridinbase im pH-Bereich 5—9 von wasserlöslichen Derivaten einer Chinolinbase im pH-Bereich 5-7.

b) fraktionierte Zugabe von Neutralsalzen,

c) Euglobulinfällung in salzarmer, schwach saurer Lösung,

d) präparative Zonenelektrophorese.

e) Gelfiltration oder Ultrafiltration zur Abtrennung von Proteinen mit Molekulargewichten um 1 Mio_M

f) Adsorption an und Elution von basischen Ionenaustauschern.

3. Verfahren nach Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet, daß als Organextrakt ein Extrakt aus menschlichen Plazenten verwendet wird.

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Die Erfindung betrifft ein hochmolekulares a-GIobulin und Verfahren zu dessen Herstellung

Es ist bereits bekannt, daß unter den Plasmaproteinen hochmolekulare a-GIobuline wie z. B. das «j-Makroglobulin, das 9,5 S-ai-Glykoprotein. das «-Lipoprotein und der Anaphylatoxin-Inaktivator vorkommen. Aus Organgeweben läßt sich das «-Globulin Ferritin extrahieren.

Es wurde nun ein weiteres, bisher nicht bekanntes hochmolekulares «-Globulin gefunden, das sich Von den vorher beschriebenen in Wesentlichen Eigenschaften unterscheidet. Dieses als »hochmolekulares «^Globulin« bezeichnete a-GlobUÜn kann normalerweise im Plasma von gesunden Personen nicht nachgewiesen werden, jedoch kann es aus Örgangeweben odef Bluizellen isoliert werden. _

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein hochfnöle-

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65 kulares «-Globulin, das zu etwa 92 ± 5% aus einem Proteinanteil, ferner zu 6,6 ± 2,0% aus Kohlenhydraten, davon Hexosen 2,6 ± 0,6%, Hexosamin (berechnet als N-Acetyl-Hexosamin) 1,8 ± 0,6%, Fucose

0,15 ± 0,05% und Neuraminsäure (berechnet als N-Acetyi-Neuraminsäure) 2.0 ± 0,8% (nach der Bestimmungsmethode von H. E Schultze et al. 1958) besteht

Das in Phosphatpuffer bei pH 6,8 gelöste erfindungsgemäße Protein zeigt in der Ultrazentrifuge nach Extrapolation auf das Lösungsmittel Wasser und die Konzentration c = 0 eine Sedimentationskonstante von 19 ±2 S. Die Sedimentationsgleichgewichtsmethode nach Yphanthis ergibt ein Molekulargewicht von 1 000 000 ± 300 000. Nach Inkubation des Proteins in einer l%igen Natriumdodezylsulfatlösung und einer anschließenden elektrophoretischen Auftrennung in einem dodezylsulfathaltigen Polyacrylainidgel erfolgt eine Aufspaltung des Moleküls in Untereinheiten, deren Molekulargewichte etwa zwischen 12 000 und 35 000 liegen. Es hat eine elektrophoretische Beweglichkeit entsprechend den «i-Globulinen. Das hochmolekulare «-Globulin wird durch ein gegen diese Substanz gerichtetes Antiserum präzipitieru

Gegenstand der Erfindung sind ferner Verfahren zur Anreicherung des hochmolekularen α-Globulins, dadurch gekennzeichnet, daß Organextrakte oder Hämolysate von Erythrozyten, die dieses Protein enthalten, unter Zugrundelegung folgender Kriterien fraktioniert werden:

Das hf>. hmolekulare «-Globulin wird mit wasserlöslichen organischen Basen wie Protamin oder kationischen Detergenzien oder Verbindungen der Äcridin- oder Chinolinreihe aus schwach sauren, neutralen bis schwach alkalischen Lösungen abgeschieden. Wegen der relativ einfachen Abtrennbarkeit des Fällungsmittels werden wasserlösliche Derivate einer Acridinbase. beispielsweise 2-Ätnoxy-6.9-diamino-acridinlactat im Bereich von pH-Werten 5-9. oder wasserlösliche Derivate einer Chinolinbase, beispielsweise Bis-(2-methyl-4-aminodinolyl-6)-csrbamidhydrochlorid im Bereich von pH-Werten 5 —7. bevorzugt um das hochmolekulare «-Globulin aus seinen Lösungen zu präzipiteren. Die Fällungsmittel werden zu den Eiweißlösungen mit einem Gehalt von i—7% in Form ihrer wäßrigen Lösung zugesetzt, wobei das Derivat der Acridinbase \ >rzugsweise in einer Konzentration von 03 — 5%, das der Chinolinbase vorzugsweise um etwa 1% vorliegt. Die Menge der zur Fällung verwendeten Acridinbase beträgt etwa 3—11 g pro Liter, die der Chinolinbase etwa 1—4 g pro Liter der das hochmolekulare «-Globulin enthaltenden Lösung. Auch das 3.6-Diamino-10-methyl acndinium-chlorid, 5-Aminoacridin, α, yTrimethvlenglykoldi(2 metbvl-4 amino)-6-chinol>l ätherdiacetat und Di η-butyl malonsäure-N-N-di (2 methyl-4-aminochinolyl-6)-diacetat sind für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.

Mit Ammoniumsulfat fällt das hochmolekulare nc-Globulin büi einer Sättigung zwischen 45 und 70%. A.us salzarmen lösungen wird es im schwach sauren pri-Bereich, insbesondere bei pH 5,5 ± 1,5 als Euglobu^ litt präzipitiert In der präpärativen Zonenelektrophorese wandert es als «i-GiobuHn, womit ein weiteres Fraktionierungskriterium aufgezeigt Ist. Entsprechend seinem Molekulargewicht kann es durch Maßnahmen, die zur Abtrennung von Proteinen mit hohem Molekulargewicht von denen mit niedrigem Molekulargewicht geeignet sind, gewönnen werden, insbesondere

durch Methoden der Gelfiltration oder durch Ultrafiltration. Durch eine ausgewählte Kombination der genannten Methoden, die einerseits zur Anreicherung des hochmolekularen «-Globulins, andererseits zur Abtrennung dieses Proteins von den übrigen Plasmaproteinen führen, kann die Isolierung der erfindungsgemäß gefundenen Substanz erfolgen. Demzufolge ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung in den einzelnen Anreicherungsschritten für das hochmolekulare «-Globulin und in den durch Kombinationen der Maßnahmen zur Anreicherung sich ergebenden Verfahren zur Reinigung des hochmolekularen α-Globulins zu sehen.

Das Verfahren zur Anreicherung ist gekennzeichnet durch die Anwendung mindestens einer der folgenden Maßnahmen auf Organextrakte oder Hämolysate von

® Erythrozyten oder daraus gewonnene Lösungen, die das

hochmolekulare «-Globulin enthalten, und die anschließende Gewinnung der bezüglich des «-Globulins angereicherten Fraktion:

a) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer Acridinbase im pH-Bereich 5 bis 9, vorzugsweise pH 5 bis pH 7, oder von wasserlöslichen Derivaten einer Chmolinbase im pH-Bereich 5—7,

b) fraktionierte Zugabe von Neutralsalzen,

c) Euglobulinfällung in salzarmer, schwach saurer Lösung,

d) präparative Zonenelektrophorese,

e) Gelfiltration oder Ultrafiltration zur Abtrennung von Proteinen mit Molekulargewichten zwischen 10 000 und 1 Mio,

f) Adsorption an und El.,tion ν .ι basischen Ionenaustauschern.

Vorzugsweise werden zur Reinigung mehrere Maßnahmen der Anreicherung miteinander kombiniert.

Ohne daß daraus eine Einschränkung herzuleiten wäre, soll im folgenden eine Möglichkeit beispielhaft aufgezeigt werden, wie das hochmolekulare α-Globulin aus einem Organgewebe gewonnen werden kann.

Dazu werden beispielsweise menschliche Plazenten zerkleinert und mit Wasser oder einer verdünnten Salzlösung, vorteilhaft mit einer etwa O,4°/oigen Kochsalzlösung extrahiert Zweckmäßig verwendet man auf 1 kg Plazenten etwa 1— 5 Ltr. Extraktionslösung. Die nicht gelösten Anteile werden durch Zentrifugation oder Filtration von dem Extrakt abgetrennt. Der schwach saure Plazentenextrakt wird sodann in dem pH-Bereich 5 bis 7 mit einem wasserlöslichen Derivat einer Acrindinbase. vorteilhaft mit 2-Äthoxy-6.9-Diaminoacndinlactat, bis zu einer Konzentration von 0.7 ± 0.4% versetzt oder mit einem wasserlcHhi hen Derivat einer Chinolinbase. vorteilhaft mit Bis {2-methyl-4-aminochinolyl-6)-carbamidhydrochlord His /u einer Konzentration von 0,25 ± 0.15%. Die dabei entstehende Fällung enthält u. a. das hochmolekulare flt-Globulin. Durch Suspension des Präzipitats in einer Salzlösung, deren Anionen mit den zur Fällung verwendeten Basen schwer lösliche Salze bilden, wird das Fällungsmittel von dem ausgefällten Protein abgetrennt Im Falle der Verwendung des Acridirt*Deri-Vats erfolgt die Suspension in einer Halogenid, Vorteilhaft Chlorid, beispielsweise etwa 5% NaGl enthältenden wäßrigen Lösung vom pH'Wert 5—8, wobei das Fällungsmittel als Halogenid bzw. Chlorid ausfällt und das Protein in Lösung geht Das Ghinöüri'Derivat kann beispielsweise als Sulfat gefällt werden. Die Freisetzung des Proteins aus dem Basen-Protein-Komplex kann jedoch auch durch pH-Verschiebung, vorzugsweise in den alkalischen Bereich erreicht werden und anschließend die Ausfäl-Jung der Basen durch Zusatz entsprechender Anionen vorgenommen werden.

Das unlösliche Fällungsmittel Salz wird, z. B. durch Zentrifugation oder Filtration, abgetrennt. Der Oberstand wird durch eine Salzfraktionierung bezüglich des

ίο hochmolekularen «-Globulins angereichert. Dazu wird die Lösung der Proteine mit so viel eines für die Fällung von Eiweißkörpern verwendeten Salzes versetzt, daß das «-Globulin gerade noch nicht präzipitiert In einer zweiten Stufe wird nach Abtrennung der sich zuerst ausbildenden Fällung die Salzkonzentration in der Proteinlösung so weit erhöht, daß der erfindungsgemäße Eiweißkörper sich im Niederschlag anreicherL Vorteilhaft wird als Salz Ammoniumsulfat verwendet, das zuerst bis zu annähernd 40—50%iger Sättigung der Eiweißlösung zugegeben wird und nach Abtrennung der sich dabei ausbildenden Fällung bis zu etwa 60 — 70% Sättigung in die Lösung eingebracht wird. Der Niederschlag, der sich bei der höheren Salzkonzentration bildet, wird z. B. durch Zentrifugation oder Filtration, gewonnen und in Wasser aufgelöst.

Es folgt nun eine abermalige Fällung eines Anteils der Proteine dieser Lösuⁿg einschließlich de.» hochmolekularen α-Globulins durch Zusatz eines wasserlöslichen Derivats einer Acridin- oder Chinolinbase unter Bedingungen, wie sie bereits oben beschrieben werden. Zur Freisetzung dar ausgefällten Proteine erfolgt wiederum die Abtrennung des Fällungsmittels z. B. durch ein Halogenid.

Zur weiteren Fraktionierung der gelösten Proteine werden Methoden angewandt, die Proteine mit Molekulargewichten > 100 000 in definierien Bereichen anzureichern irr. Stande sind. Besonders geeignet sind hierfür Maßnahmen der Gelfiltration, beispielsweise säulenchromatographische Schritte unter Verwendung von mit Epichlorhydrin vernetzten Dextranen wie Sephadex® G-150 der Firma Pharmacia, Uppsala.

Zur Elution können in der Biochemie gebräuchliche Pufferlösungen, denen zur Erhöhung des Fraktionierungseffektes Neutralsalze zugesetzt werden können.

beispielsweise 0,01 bis 0.1 M Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäurepuffer mit Zusatz von 0 bis 5 M NaCl von annähernd neutralem bis basischem pH-Wert, dienen. Bei diesem Elutionsverfahren wird das «-Globulin im Bereich der hochmolekularen Anteile der

so Proteine, in dem auch das bekannte Gewebsprotein Ferritin anzutreffen ist. eluiert. Es werden nun unter Zuhilfenahme immunologischer Nachweisverfahren ditjenigen Fraktionen ausgesondert und gesammelt, die das erfindungsgemäße hochmolekulare i% Globulin enthalten. Zur Abtrennung nicht gewünschter Begleitproteine kann die Lösung einer abermaligen Salzfraktionierung unterworfen werden mit dem Ziel, das hochmolekulare α-Globulin zuerst in Lösung zn belassen und anschließend in reiner Form zu präzipitie ren. Bei Verwendung von Ammoniumsulfat ist dies zu erreichen, wenn die vereinten, chromatographisch erhaltenen Fraktionen bis zu 25—30 öewichtsprozem ten mit dem Salz versetzt werden und das dabei auftretende Präzipitat Verworfen wird. Wird nun die

Vom Niederschlag durch Zentrifugation oder Filtration befreite Lösung mit zusätzlich etwa 20 bis 13% Ammoniumsulfat versetzt, entsteht eine Fällung, die die f^auptmenge des hochmolekularen «^Globulins enthält

Pie Fällung wird durch Zentrifugation oder Filtration gewonnen und in möglichst wenig Wasser aufgelöst. Anschließend wird die Proteinlösung durch Dialyse oder eine andere vergleichbare Maßnahme von vorhandenen Salzen befreit. Der pH-Wert der Lösung wird schwach sauer, vorteilhaft auf etwa pH 5,0, eingestellt, mit der Folge, daß das hochmolekulare α-Globulin aufgrund seiner Euglobulin-Eigenschaft ausfällt.

Als weitere besonders geeignete Reinigungsoperation hat sich die präparative Zonenelektrophorese erwiesen. Hierzu wirrl die Euglobulinfällung in einem für die Durchführung einer Elektrophorese von Proteinen geeigneten Medium, vorzugsweise in einer alkalischen Pufferlösung, beispielsweise einem Natriumdiäthylbarbituratpuffer vom pH 8,6, Ionenstärke = 0,1, gelöst und in einer Apparatur zur präparativen Elektrophorese, wie sie beispielsweise von N. Heimburger und R. Schmidtberger in Behringwerke-Mitteilungen Heft 43, S. 83 ff„ insbesondere auf S. 110-120 beschrieben >vird, eingetragen. Bei dem Gerät handelt es sich um die horizontale Anordnung einer Triigerebktrcpiiorese in einem offenen Trog, in welchem das Trägermaterial zur Abführung der bei der Elektrophorese auftretenden Joule'schen Wärme auf unter 10° C gekühlt wird. Als Trägermaterial dienen gegenüber Proteinen indifferente Substanzen, vorteilhaft Polyvinylchlorid, oder dessen Copolymerisate in Form eines feinem Granulats. Es ist empfehlenswert, die Elektrophorese im alkalischen pH-Bereich, vorteilhaft bei etwa pH 8,6, bei einer lonenstärke von 0,08—0,12, und bei einer Feldstärke von 4—6 Volt/cm vorzunehmen. Bei Verwendung von 0,1 M Natriumdiäthylbarbituratpuffer vom pH-Wert 8,6 wandert das hochmolekulare α-Globulin im elektriichen Feld in dem als «i-Zone klassifizierbaren Bereich der Piasmaproteine. Für die Gewinnung des hochmolekularen ft-Globulins wird diese Zone herausgeschnitten und vom inerten Trägermaterial mit Hilfe von Wasser oder wäßrigen Salzlösungen, beispielsweise einer 05 bis l°/oigen Kochsalzlösung, eluiert. In einem letzten Reinigungsschritt kann das Eluat vorteilhaft nach einer vorherigen Konzentrierung, beispielsweise auf einem Ultrafilter, einer Gelfiltration unterworfen v/erden, bei dem die Chromatographiesäule mit perlförmig aufgearbeiteter Agarose. beispielsweise mit Sepharose® 6 B der Firma Pharmacia, Uppsala, ge'jllt ist und die einen Fraktionierungsbereich für Proteine bei ΙΟ⁵ bis 4 · 10⁶ Molekulargewichtseinheiten aufweist.

In ähnlicher Weise ist die Gewinnung des hochmolekularen α-Globulins °uch bei Verwendung von anderen dieses α-Globulin enthaltenden Stoffen wie z. B. Erythnzyten als A'isgangsmaterial durchzuführen. Dabei kann auf einzelne Fraktionierungsschritte verzichtet werden, beispielsweise auf die anfänglich durchgeführte Fällung mit Acridin oder Chinolinbasen und die Präzipitation des hochmolekularen a-Globulins als F.uglobulin Statt dessen ist es hierbei zweckmäßig, a-globulinhaltige Fraktionen durch lonenaustauschchromatfjgraphie vorzugsweise an hasischen Ionenaustauschern zu reinigen.

Das erfindungsgemäße hergestellte hochmolekulare «^Globulin hat antigene Eigenschaften, Eine mit ihm durchgeführte Immunisierung Von Tieren nach bekannten Methoden führen zur Bildung von spezifischen Antikörpern in den immunisierten Tieren. Die spezifisch gegen das hochmolekulare a-GIobulin gerichteten Antiseren können vpji den immunisierten Tieren nach üblichen Verfahren gewonnen werden.

Das erfindungsgemäß hergestellte hochmolekulare «-Globulin hat eine diagnostische Bedeutung dadurch, daß einerseits das Protein als reines Antigen, andererseits das durch Immunisierung mit dem reinen Antigen gewonnene spezifische Antiserum in Bestimmungsmethoden für das hochmolekulare α-Globulin eingesetzt werden können.

Das erfindungsgemäß hochmolekulare a-GIobulin zeichnet sich durch eine Affinität zu Steroiden wie den Steroidhormonen Oestriol, Oestradiol und Cortisol aus.

Der Nachweis der Steroid-Bindung ist mit radioaktiv markierten Steroidhormonen möglich, die mit dem hochmolekularen α-Globulin inkubiert und anschließend mit Antiseren gegen das α-Globulin zur Reaktion gebracht werden. Es zeigt sich dabei, daß der Antigen-Antikörper-Komplex aus dem α-Globulin und dem entsprechenden Antikörper die radioaktiv markierten Steroide gebunden hat.

Die Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen näher erläutert

1500 kg tiefgefrorene menschliche Plazenten werden im Schneidmischer zerkleinert und mit 15001 einer 0,4%igen Kochsalzlösung extrahiert Der Extrakt wird dann, nach Abtrennung des Geweberückstandes durch Zentrifugation, mit 20%iger Essigsäure auf pH 6,0 eingestellt und zur Ausfällung des hochmolekularen α-Globulins mit 3301 einer 3%igen Lösung des 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridinlactats versetzt. Die Abtrennung der Fällung erfolgt durch Zentrifugation. Den Niederschlag versetzt man mit 8001 einer 2,5%!gen NaCI-Lösung, rührt 4 Stunden und zentrifugiert vom abgeschiedenen Chlorid des 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridins ab. Aus dem Überstand wird ein Teil der Begleitproteine durch Zusatz von 25% G/V Ammoniumsulfat abgeschieden. Das hochmolekulare a-GIobulin bleibt in Lösung; es wird daraus durch weitere Zugabe von Ammoniumsulfat (20% G/V) präzip'tieu und dann abzentrifugiert 1000 g der als Zentrifugat erhaltenen feuchten Paste werden in Wasser gelöst und gegen 20 I einer 0,4%igen Kochsalzlösung dialysiert Aus dieser Lösung (3 I) werden die Proteine teilweise bei pH 7,0 durch Zusatz von 1,2 I einer wäßrigen 3%igen Lösung von 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridinlartat ausgefällt. Der Niederschlag wird mit 500 ml einer 5%igen NaCl-Losung versetzt und das abgeschiedene Chlorid des 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacrid!ns abzentrifugiert. Das im Überstand noch verbliebene restliche 2-Äthoxy-6,9-Dia· minoacridin wird durch Zusatz von Bentonit A gebunden Die weitere Fraktionierung der Proteine erfolgt durch Gelfiltration an Sephadex®G-150;aIs Puffer wird dabei eine 0,01 rr, Trishydroxymethylaminomethan-L.aUsäurelösung pH 7.0, difc 0,05% Natriumazid enthält, verwendet. Das hochmolekulare «-Globulin wandert an Sephadex® G-150 wie Ferritin im mchmolekularen Anteil der Proteine. Das hochmolekulare a-GIobulin kann in den Fraktionen mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese nachgewiesen werden. Der Nachweis des hochmolekularen α-Globulins in den einzelnen Fraktionen erfolgt immunologisch im Geküffusionstest, falls man ein Antiserum zur Verfügung hat. Pit Fraktionen, die das hochmolekulare a-Globulirt enthalten, Weiden vereinigt und mit Ammoniumsulfat (AS) weiterfraktioniert, Ein durch Zugabe von 30% Gew7VoI. AS erhaltenes Präzipitat wird verworfen. Der Überstand Wird weiter mit 13,5% Gew/Vol. AS versetzt. Der zweite Niederschlag enthält die Hauptmenge des

hochmolekularen «-Globulins; er wird in Wasser gelöst und gründlich gegen Wasser dialysiert. Aus dieser Lösung wird das hochmolekulare «-Globulin dann durch Einstellung des pH-Wertes auf 5,0 als Euglobulin ausgefällt. Die Weiterreinigung des Proteins erfolgt durch präparative Zonenelektrophorese bei pH 8,6, nachdem die Euglobulinfällung in Natriumdiäthylbarbi· turatpufferlösung ν · pH 8,6 gelöst wurde. Die Auftrennung der Proteine im elektrischen Feld erfolgt mit der von HEIMBURGER beschriebenen Apparatur und Methode.

Als inertes Trägermaterial dient Polyvinylchlorid (Geon® X 427; Hersteller: Goodrich Chem. Company, Cleveland/Ohio, USA); als Puffer wird eine 0,1 m Natriumdiäthylbarbiturat-Lösung (pH 8,6) verwendet. Das hochmolekulare «-Globulin wandert in der «i-Zone und wird daraus mit physiologischer NaCl-Lösung eluiert. Das Eluat wird auf einem Ultrafilter ankonzentriert und zur letzten Reinigung an Sepharose" 6 B (Säule 5· 105 cm) unter Verwendung eines 0,1m Tris-HCl-Puffers pH 8.0 Chromatographie«. Diejenigen Fraktionen, die das hochmolekulare «-Globulin enthalten, werden gesammelt und vereint.

Ausgehend von 1500 kg Plazenten werden auf diese Weise im Durchschnitt mehrerer Aufarbeitungen 1 g des reinen hochmolekularen α-Globulins erhalten.

Beispiel 2

1500 kg tiefgefrorene menschliche Plazenten werden im Schneidmischer zerkleinert und mit 15001 einer 0,4%igen Kochsalzlösung extrahiert. Der Extrakt wird dann, nach Abtrennung des Geweberückstandes durch Zentrifugation. mit 20%iger Essigsäure auf pH 6,0 eingestellt und zur Ausfällung des hochmolekularen α-Globulins mit 3301 einer l%igen Lösung des Bis-(2-methyI-4-AminochinoIyI-6)carbamid-hydrochIorids versetzt. Die Abtrennung der Fällung erfolgt durch Zentrifugalion Der Niederschlag wird in 8001 dest. Wasser suspendiert und durch Zufügen von 2 η NaOH bis pH 9.0 in Lösung gebracht. Das Bis-(2-methyI-4-Aminochinolyl-6)carbamid wird durch Einrühren von 5% (G/V) Ammoniumsulfat als Sulfat ausgefällt und durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt Aus dem Überstand wird ein Teil der Begleitproteine durch Zusatz von 20% (G'V) Ammoniumsulfat abgeschieden. Das hochmolekulare it-Globulin bleibt dabei in Lösung. 1000 g der als Zentrifugat erhaltenen feuchten Paste werden in Wasser gelöst und gegen 201 einer 0.4%igen Kochsalzlösung dialysiert. Aus dieser Lösung (31) wird das hochmolekulare * -Globulin mit einigen anderen Proteinen bei pH 5.5 durch Zusatz von 1,21 einer wäßrigen 0J5%igen Lösung von Bis-(2-methyl-4-Aminochino'yl-öjcarbamid^hydrochlorid ausgefällt- Der Niederschlag wird in 500 frilWasser äüfgenömmert üiid durch Zugabe von NaOH bei pH 9,0 in Lösung gebracht. Anschließend wird das Bis-(2-methyI-4-AminochinolyI-6)carbamid durch Zugabe von 5% (G/V) Ammoniumsulfat ausgefällt und abzentrifugiert. Die weitere Fraktionierung der Proteine mit dem Ziel der Anreicherung und Reinigung des hochmolekularen α-Globulins erfolgt durch Gelfiltration, Ammoniumsulfatfällung, Eüglobinfällung und Zonenelektrophorese wie in Beispiel 1 angegeben.

Beispiel 3

5 1 gepackte rote Blützellen werden zur Waschung mit 51 physiologischer Kochsalzlösung verführt und

ίο anschließend bei 3500 U/Min, zentrifugiert. Der Waschvorgang wird noch zweimal wiederholt. Die gewaschenen Erythrozyten werden dann durch Zufügen des 5fachen Volumens an destilliertem Wasser hämolysiert. Der pH-Wert des Hämolysates wird mit 1 η F.ssigsäure auf pH 6,8 eingestellt. Danach werden unter sorgfältigem Rühren 2,5 kg Diäthylaminoäthyl-Cellulose (DE-32 der Fa. Serva. Heidelberg) als feuchter Filterkuchen zugegeben. Der Ansatz wird 1 Stunde bei Zimmertemperatur kräftig gerührt. Der mit Protein beladene Ionenaustauscher wird anschließend auf einem Büchner-Filter gesammelt, mit ca. 10 I 0.005 M Phosphatpuf fer pH 6,8 gewaschen und in eine Chromatographie-Säule eingeschlämmt. Die Elution der Proteine erfolgt mit Hilfe eines linearen Salzgradienten (0.005 M Phosphatpuffer pH 6,8 bis 0.4 M Phosphatpuffer pH 6.8 je IC¹), der auf die Säule aufgebracht wird. Das Eluat wird η 500 ml Portionen aufgefangen und in der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese charakterisiert. Diejenige Bande, welche etwas schneller wandert als das Serum-aj-Makroglobulin. wird als das hochmolekulare «-Globulin gefunden. Alle das hochmolekulare «-Globulin enthaltenden Fraktionen werden vereint und mil gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung bis 45% Sättigung (260 g/l) versetzt. Der dabei entstehende Niederschlag

wird abzentrifugiert und verworfen. Der klare Überstand wird unter Rühren mit so viel festem Ammoniumsulfat versetzt, daß eine 60%ige Sättigung (387 g/l) erreicht wird. Dabei fällt das hochmolekulare «-Globulin zusammen mit einigen anderen Erythrozytenproteinen aus, das durch 30 Min. Zentrifugation bei 4000 U/ Min. gewonnen wird. Der Niederschlag wird in 50 ml Wasser gelöst und an einer mit Sepharose 6 B gefüllten und mit 0.1 M Tris-HCI-Puffer pH 8,0+IM NaCI äquilibrierten Säule von 10 cm Durchmesser und 100 cm Länge gelfiitriert. Die hochmolekulare Fraktion, die sich durch ein Absorptionsmaximum der bei 280 nm im Fotometer gemessenen Eluate darstellt, ist das reine hochmolekulare «-Globulin. Die zu diesem Gipfel zählenden Fraktionen werden gemischt, in einen Dialysierschlauch gefüllt und gegen so viel gesättigtes Ammoniumsulfat dialysiert. daß eine 65%ige Sättigung (427 g/i) entsteht Das ausgefallene hochmolekulare «^Globulin wird durch 15 Min. Zentrifugation gewonnenen wenig destilliertem Wasser gelöst undi gegen einS 0,85%ige NaCi-Lösung unter mehrmaligem Wechsel bis zum Schwund der SÖ«-Ionen dialysiert. Es werden 288 mg des hochmolekularen «-Globulins erhalten.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Hochmolekulares
zeichnet du rch

α-Globulin, g e k e η η -

a) einen Proteinanteil von 92 ± 5%, einen Gehalt an Kohlenhydraten von 6,6 ± 2,0, davon Hexosen 2,6 ± 0,6%, Hexosamin (berechnet als N-Acetyl-Hexosamin) I₁S ± 0,6%, Fuccse 0,15 ± 0,05%, Neuraminsäure (berechnet als N-Acetyl-Neuraminsäure)2,0 ± 0,8%,

b) eine Sedimentationskonstante von 19 ± 2 S₁

c) ein Molekulargewicht von 1 000 000 ± 300 000,

d) eine Aufspaltung des Moleküls in Untereinheiten mit einem Molekulargewicht etwa zwischen is 12 000 und 35 000 nach Inkubation des Moleküls in einer l%igen Natriumdodezylsulfatlösung und

e) eine elektrophoretische Beweglichkeit entsprechend den apGlobulinen.