DE2445677A1 - Hochmolekulares alpha-globulin und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Description

• Hochmolekulares cL-Globulin und Verfahren zu dessen Herstellung Die Erfindung betrifft ein hochmolekulares ol-Globulin und Verfahren zu dessen Herstellung.
• Es ist bereits bekannt, dass unter den Plasmaproteinen hochmolekulare α-Globuline wie z.B. das α2-Makroglobulin, das 9,5 S-α1-Glykoprotein, das α-Lipoprotein/vorkommen. Aus Organgeweben lässt sich das α-Globulin Ferritin extrahieren.
• Es wurde nun ein-weiteres, bisher nicht bekanntes hochmolekulares α-Globulin gefunden, das sich von den vorher beschriebenen in wesentlichen Eigenschaften unterscheidet. Dieses als '?hochmolekulares $-Globulin" bezeichnete α-Globulin kann normalerweise in Plasma von gesunden Personen nicht nachgewiesen werden, jedoch kann es aus Organgeweben oder Blutzellen isoliert werden.
• Gegenstand der Erfindung ist demnach ein hochmolekulares α-Globulin, das zu etwa 92 + 5% aus einen Proteinanteil, ferner zu 6,6 # 2,0% aus Kohlenhydraten, davon Hexosen 2,6 # 0,6%, Hexosamin (berechnet als N-Acetyl-Hexosamin) 1,8 # 0,6%, Fucose 0,15 j 0,05% und Neuraminsäure (berechnet als Il-Acetyl-und der Anaphylatoxin-Inaktivator Neuraminsäure) 2,0 + 0,8% (nach der Bestimmungsmethode von ll.E. Schultze et al. 1958) besteht.
• Das in Phosphatpuffer bei pH 6,8 gelöste erfindungsgemasse Protein zeigt in der Ultrazentrifuge nach Extrapolation auf das Lösungsmittel Wasser und die Konzentration c = 0 eine Sedimentationskonstante von 19 + 2 S. Die Sedimentationsgleichge wichtsmethode nach Yphanthis ergibt ein Molekulargewicht von 1.000.000 + 300.000. Nach Inkubation des Proteins in einer 1%igen Natriumdodezylsulfatlösung und einer anschliessenden elektrophoretischen Auftrennung in einem dodezylsulfathaltigen Polyacrylamidgel erfolgt eine Aufspaltung des Moleküls in Untereinheiten, deren Molekulargewichte etwa zwischen 12.000 und 35.000 liegen. Es hat eine elektrophoretische Beweglichkeit entsprechend den α1-Globulinen. Das hochmolekulare dL-Globulin wird durch ein gegen diese Substanz gerichtetes Antiserum präzipitiert.
• Gegenstand der Erfindung sind ferner Verfahren zur Herstellung des hochmolekularen d-Globulins, dadurch gekennzeichnet, dass Organextrakte oder Hämolysate von Erythrozyten, die dieses Protein enthalten, unter Zugrundelegung folgender Kriterien fraktioniert werden: Das hochmolekulare α-Globulin wird mit wasserlöslichen organischen Basen wie Protamin oder kationischen Detergenzien oder Verbindungen der Acridin- oder Chinolinreihe aus schwach sauren, neutralen bis schwach alkalischen Lösungen abgeschieden.
• Wegen der relativ einfachen Abtrennbarkeit des Fällungsmittels werden wasserlösliche Derivate einer Acridinbase, beispielsweise -2-Äthoxy-6,9-diamino-acridinlactat im Bereich von pE Terten 5-9, oder wasserlösliche Derivate einer ChinolinbaseJ beispielsweise Bis-(2-methyl-4-aminodinolyl-6)-carbamidhydrochlorid im Bereich von pH-Werten 5-7, bevorzugt, um das hochmolekulare α o<-Globulin a-us seinen Lösungen zu präzipiteren.
• Die Fällungsmittel werden zu den Eiweißlösungen mit einem Gehalt von 1-7% in Form ihrer wässrigen Lösung zugesetzt, wobei das Derivat der Acridinbase vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5-596, das der Chinolinbase vorzugsweise um etwa 1% vorliegt. Die Menge: der zur Fällung verwendeten Acridinbase beträgt etwa 3 - 11 g pro Liter, die der Chinolinbase etwa 1 - 4 g pro Liter der das hochmolekulare CL -Globulin enthaltenden Lösung. Auch das 3,6-Diamino-IO-methylacridinium-chlorid, 5-Aminoacridin, α,γ-Trimethylenglykol-di (2-methyl-4-amino)-6-chinolylätherdiacetat und Di-n-butylmaonsäure-N-N-di-(2-methyl-4-aminochinolyl-6)-diacetat sind für das erfindungsgemässe Verfahren geeignet.
• Mit Ammoniumsulfat fällt das hochmolekulare d-Globulin bei einer Sättigung zwischen 45 und 70. Aus salzarmen Lösungen wird es im schwach sauren pH-Bereich, insbesondere bei pH 5,5 + 1,5 als Euglobulin präzipitiert. In der präparativen Zonenelektrophorese wandert es als &1-Globulin, womit ein weiteres Fraktionierungskriterium aufgezeigt ist. Entsprechend seinem Molekulargewicht kann es durch Maßnahmen, die zur Abtrennung von Proteinen mit hohem Molekulargewicht von denen mit niedrigem Molekulargewicht geeignet sind, gewonnen werden, insbesondere durch Methoden der Gelfiltration oder durch Ultrafiltration. Durch eine ausgewählte Kombination der genannten Methoden, die einerseits zur Anreicherung des hochmolekularen g -Globulins, andererseits zirAbtrennung dieses Proteins von den übrigen Plasmaproteinen führen, kann die Isolierung der erfindungsgemäss gefundenen Substanz erfolgen. Demzufolge ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung in den einzelnen Anreicherungsschritten für das hochmolekulare dAGlobulin und in den durch kombinationen der Maßnahmen zur Anreicherung sich ergeben den Verfahren zur Reinigung des hochmolekularen α-Globulins ZU sehen.
• Das Verfahren zur Anreicherung ist gekennzeichnet durch die Anwendung mindestens einer der folgenden Maßnahmen auf Organextrakte oder Hämolysate von Erythrozyten oder daraus gewonnene Lösungen, die das hochmolekulare c>-Globulin enthalten, und die anschliessende Gewinnung der bezüglich des d-Globulins angereicherten Fraktion: a) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer Acridinbase im pH-Bereich 5 bis 9, vorzugsweise pH 5 bis pH 7,oder von wasserlöslichen Derivaten einer Chinolinbase im pH-Bereich 5 - 7, b) fraktionierte Zugabe von Neutral salzen, c) Euglobulinfällung in salzarmer, schwach saurer Lösung, d) präparative Zonenelektrophorese, e) Gelfiltration oder Ultrafiltration zur Abtrennung von Proteinen mit Molekulargewichten zwischen.?0.000 und 1 Mio.
• f) Adsorption an und Elution von basischen Ionenaustauschern.
• Vorzugsweise werden zur Reinigung mehrere~Maßnahlmen der Anreicherung miteinander kombiniert.
• Ohne dass daraus eine Einschränkung herzuleiten wäre, soll im folgenden eine Möglichkeit beispielhaft aufgezeigt werden, wie das hochmolekulare oLGlobulin aus einem Organgewebe gewonnen werden kann.
• Dazu werden beispielsweise menschliche Plazenten zerkleinert und mit Wasser oder einer verdünnten Salzlösung, vorteilhaft mit einer etwa 0,4°Migen Kochsalzlösung extrahiert. Zweckmässig verwendet man auf 1 kg Plazenten etwa 1 - 5 Ltr. Extraktionslösung. Die nicht gelösten Anteile werden durch Zentrifugation oder Filtration von dem Extrakt abgetrennt. Der schwach saure Plazentenextrakt wird sodann in dem pH-Bereich 5 bis 7 mit einem wasserlöslichen Derivat einer Acridinbase, vorteilhaft mit 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridinlactat, bis zu einer Konzentration von 0,7 + 0,4% versetzt oder mit einem wasserlöslichen Derivat einer Chinolinbase,vorteilhaft mit Bis- (2-methyl-4-aminochinolyl-6)-carbamidhydrochlorid bis zu einer Konzentration von 0,25 + 0,15%. Die dabei entstehende Fällung enthält u.a. das hochmolekulare cL-Globulin. Durch Suspension des Präzipitats in einer Salzlösung, deren Anionen mit den zur Fällung verwendeten Basen schwer lösliche Salze bilden, wird das Fällungsmittel von dem ausgefällten Protein abgetrennt.
• Im Falle der Verwendung des Acridin-Derivats erfolgt die Suspension in einer Halogenid, vorteilhaft Chlorid, beispielsweise etwa 5% NaCl enthaltenden wässrigen Lösung vom pH-Tert 5-8, wobei das Fällungsmittel als Halogenid bzw. Chlorid ausfällt und das Protein in Lösung geht. Das Chinolin-Derivat kann beispielsweise als Sulfat gefällt werden. Die Freisetzung des Proteins aus dem Basen-Protein-Komplex kann jedoch auch durch pH-Verschiebung, vorzugsweise in den alkalischen Bereich erreicht werden und anschliessend die Ausfällung der Basen durch Zusatz entsprechender Anionen vorgenommen werden.
• Das unlösliche Fällungsmittel Salz wird,z.B. durch Zentrifugation oder Filtration, abgetrennt. Der Überstand wird durch eine Salzfraktionierung bezüglich des hochmolekularen 6 -Globulins angereichert. Dazu wird die Lösung der Proteine mit so viel eines für die Fällung von Eiweisskörpern verwendeten Salzes versetzt, dass das d-Globulin gerade noch nicht präzipitiert. In einer zweiten Stufe wird nach Abtrennung der sich zuerst ausbildenden Fällung die Salzkonzentration in der Proteinlösung so weit erhöht, dass der erfindungsgemässe Eiweisskörper sich im Niederschlag anreichert. Vorteilhaft wird als Salz Ammoniumsulfat verwendet, das zuerst bis zu annähernd 4O5/ciger Sättigung der Eiweisslösung zugegeben wird und nach Abtrennung der sich dabei ausbildenden Fällung bis zu etwa 60-70% Sättigung in die Lösung eingebracht wird.
• Der Niederschlag, der sich bei der höheren Salzkonzentration bildet, wird, z.B. durch Zentrifugation oder Filtration, gewonnen und in Wasser aufgelöst.
• Es folgt nun eine abermalige Fällung eines Anteils der Proteine dieser Lösung einschliesslich des hochmolekularen dGlobulins durch Zusatz eines wasserlöslichen Derivats einer Acridin- oder unter Bedingungen, wie sie bereits oben beschrieben werden.
• Zur Freisetzung der ausgefällten Proteine erfolgt wiederum die Abtrennung des Fällungsmittels/durch ein Halogenid.
• z.B.
• Zur weiteren Fraktionierung der gelösten Proteine werden Methoden angewandt, die Proteine mit Molekulargewichten >100.000 in definierten Bereichen anzureichern im Stande sind. Besonders geeignet sind hierfür Maßnahmen der Gelfiltration, beispielsweise säulenchromatographische Schritte unter Verwendung von mit Epichlorhydrin vernetzten Dextranen wie Sephadex G-150 der Firma Pharmacia, Uppsala.
• * Chinolinbase Zur Elution können in der Biochemie gebräuchliche Pufferlösungen, denen zur Erhöhung des Fraktionierungseffektes Neutralsalze zugesetzt werden können, beispielsweise O,ui bis 0, i M Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäurepuffer mit Zusatz von 0 bis 5 M NaCl von annähernd neutralem bis basischem pH-Wert, dienen. Bei diesem Elutionsverfahren wird das -Globu1in im Bereich der hochmolekularen Anteile der Proteine, in dem auch das bekannte Gewebsprotein Ferritin anzutreffen ist, eluiert. Es werden nun unter Zuhilfenahme immunologischer Nachweisverfahren diejenigen Fraktionen ausgesondert und gesammelt, die das erfindungsgemässe hochmolekulare α-Globulin enthalten. Zur Abtrennung nicht gewünschter Begleitproteine kann die Lösung einer abermaligen Salzfraktionierung unterworfen werden mit dem Ziel, das hochmolekulare dL-Globulin zuerst in Lösung zu belassen und anschliessend in reiner Form zu präzipitieren. Bei Verwendung von Ammoniumsulfat ist dies zu erreichen, wenn die vereinten, chromatographisch erhaltenen Fraktionen bis zu 25-30 Gewichtsprozenten mit dem Salz versetzt werden und das dabei auftretende Präzipitat verworfen wird. Wird nun die vom Niederschlag durch Zentrifugation oder Filtration befreite Lösung mit zusätzlich etwa 20 bis 13% Ammoniumsulfat versetzt, entsteht eine Fällung, die die Hauptmenge des hochmolekularen α-Globulins enthält.
• Die Fällung wird durch Zentrifugation oder Filtration gewonnen und in möglichst wenig Wasser aufgelöst. Anschliessend wird die Proteinlösung durch Dialyse oder eine andere vergleichbare Maßnahme von vorhandenen Salzen befreit. Der pH-Wert der Lösung wird schwach sauer, vorteilhaft auf etwa pH 5,0, eingestellt, mit der Folge, dass das hochmolekulare α-Globulin aufgrund seiner Euglobulin-Eigenschaft ausfällt.
• Als weitere besonders geeignete Reinigungsoperation hat sich die präparative Zonenelektrophorese erwiesen. Hierzu wird die Euglobulinfällung in einem für die Durchführung einer Elektrophorese von Proteinen geeigneten Medium, vorzugsweise in einer alkalischen Pufferlösung, beispielsweise einem Natriumdiäthylbarbituratpuffer vom pH 8,6, Ionenstärke = 0,1, gelöst und in einer Apparatur zur präparativen Elektrophorese, wie sie beispielsweise von N- Heimburger und R. Schmidtberger in Behringwerke-Mitteilungen Heft 43, S. 83 ff., insbesondere auf S. 119-120 beschrieben wird, eingetragen. Bei dem Gerat handelt es sich um die horizontale Anordnung einer Trägerelektrophorese in einem offenen Trog, in welchem das Trägermaterial zur Abführung der bei der Elektrophorese auftretenden Joule'schen Wärme auf unter 10°C gekühlt wird. Als Trägermaterial dienen gegenüber Proteinen indifferente Substanzen, vorteilhaft Polyvinylchlorid, oder dessen Copolymerisate in Form eines feinen Granulats. Es ist empfehlenswert, die Elektrophorese im alkalischen pH-Bereich, vorteilhaft bei etwa pX 8,6, bei einer Ionenstärke von 0,08 - 0,12, und bei einer Feldstärke von 4-6 Volt/cm vorzunehmen. Bei Verwendung von 0,1 M Natriumdiäthylbarbituratpuffer vom pH-Wert 8,6 wandert das hochmolekulare α-Globulin im elektrischen Feld in dem als α1-Zone klassifizierbaren Bereich der Plasmaproteine. Für die Gewinnung des hochmolekularen d;Globulins wird diese Zone herausgeschnitten und vom inerten Trägermaterial mit Hilfe von Wasser oder wässrigen Salzlösungen, beispielsweise einer 0,5 bis 7igen Kochsalzlösung, eluiert. In einem letzten Reinigungsschritt kann das Eluat vorteilhaft nach einer vorherigen Konzentrierung, beispielsweise auf einem Ultrafilter, einer Gelfiltration unterworfen werden, bei dem die Chromatographiesäule mit perlförmig aufgearbeiteter Agarose, beispielsweise mit Sepharose 6 B der Firma Pharmacia, Uppsala, gefüllt ist und die einen Fraktionierungsbereich für Proteine bei 105 bis 4 x 106 Molekulargewichtseinheiten aufweist.
• In ähnlicher Weise ist die Gewinnung des hochmolekularen -Globulins auch bei Verwendung von anderen dieses o9-Globulin enthaltenden Stoffen wie z.B. Erythrozyten als Ausgangsmaterial durchzuführen. Dabei kann auf einzelne Fraktionierungsschritte verzichtet werden, beispielsweise auf die anfänglich durchgeführte Fällung mit Acridin- oder Chinolinbasen und die Präzipitation des hochmolekularen oL-Globulins als Euglobulin. Stattdessen ist es hierbei zweckmässig, O-globulinhaltige Fraktionen durch Ionenaustauschchromatographie vorzugsweise an basischen Ionenaustauschern zu reinigen.
• Das erfindungsgemäss hergestellte hochmolekulare α-Globulin hat antigene Eigenschaften. Eine mit ihm durchgeführte Immunisierung von Tieren nach bekannten Methoden führt zur Bildung von spezifischen Antikörpern in den immunisierten Tieren. Die spezifisch gegen das hochmolekulare d-Globulin gerichteten Antiseren können von den immunisierten Tieren nach üblichen Verfahren gewonnen werden.
• Das erfindungsgemäss hergestellte hochmolekulare cE-Olobulin hat eine diagnostische Bedeutung dadurch, dass einerseits das Protein als reines Antigen, andererseits das durch Immunisierung mit dem reinen Antigen gewonnene spezifische Antiserum in Bestimmungsmethoden für das hochmolekulare α -Globulin eingesetzt werden können.
• Das erfindungsgemässe hochmolekulare α-Globulin zeichnet sich durch eine Affinitat zu Steroiden wie den Steroidhormonen Oestriol, Oestradiol und Cortisol aus.
• Der Nachweis der Steroid-Bindung ist mit radioaktiv markierten Steroidhormonen möglich, die mit dem hochmolekularen <i-Globulin inkubiert und anschliessend mit Antiseren gegen das 0--Globulin zur Reaktion gebracht werden Es zeigt sich dabei, dass der Antigen-Antikörper-Komplex aus dem α-Globulin und dem entsprechenden Antikörper die radioaktiv markierten Steroide gebunden hat.
• Die Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen näher erläutert.
• Beispiel 1 1500 kg tiefgefrorene menschliche Plazenten werden im Schneidmischer zerkleinert und mit 1500 1 einer 0,4%igen Kochsalzlösung extrahiert. Der Extrakt wird dann, nach Abtrennung des Geweberückstandes durch Zentrifugation, mit 20%iger Essigsäure auf pH 6,0 eingestellt und zur Ausfällung des hochmolekularen N-Globulins mit 330 1 einer 3%igen Lösung des 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridinlactats versetzt Die Abtrennung der Fällung erfolgt durch Zentrifugation. Den Niederschlag versetzt man mit 800 1 einer 2,5%igen NaCl-Lösung, rührt 4 Stunden und zentrifugiert vom-abgeschiedenen Chlorid des 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridins ab. Aus dem Überstand wird ein Teil der Begleitproteine durch Zusatz von 25% G/V Ammoniumsulfat abgeschieden.
• Das hochmolekulare a-Globulin bleibt in Lösung; es wird daraus durch weitere Zugabe von Ammoniumsulfat (20% G/V) präzipitiert und dann abzentrifugiert. 1000 g der als Zentrifugat erhaltenen feuchten Paste werden in Wasser gelöst und gegen 20 l einer 0,4%igen Kochsalzlösung dialysiert. Aus dieser Lösung (3 1) werden die Proteine teilweise bei pH 7,0 durch Zusatz von 1,2 1 einer wässrigen 3%igen Lösung von 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridin-Lactat ausgefällt. Der Niederschlag wird mit 500 ml einer 5%igen NaCl-Lösung versetzt und das abgeschiedene Chlorid des 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridins abzentrifugiert. Das im Überstand noch verbliebene restliche 2-thoxy-6,9 Dianinoacridin wird durch Zusatz von Bentonit A gebunden. Die weitere Fraktionierung der Proteine erfolgt durch Gelfiltration an Sephadex# G-150; als Puffer wird dabei eine 0,01 m Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäurelösung pH 7,0, die 0,05% Natriumazid enthält, verwendet.
• Das hochmolekulare otGlobulin wandert an Sephadex G-1 50 wie Ferritin im hochmolekularen Anteil der Proteine. Der Nachweis des hochmolekularen &-Globulins in den einzelnen Fraktionen erfolgt immunologisch im Geldiffusionstest. Die Fraktionen, die das hochmolekulare oL-Globulin enthalten, werden vereinigt und mit Ammoniumsulfat (AS) weiterfraktioniert. Ein durch Zugabe von 30% Gew./Vol. AS erhaltenes Präzipitat wird verworfen. Der Überstand wird weiter mit 13,5% Gew./VoL AS versetzt. Der zweite Niederschlag enthält die Hauptmenge des hochmolekularen α-Globulins; er wird in Wasser gelöst und gründlich gegen Wasser dialysiert. Aus dieser Lösung wird das hochmolekulare α-Globulin dann durch Einstellung des pH-Wertes auf 5,0 als Euglobulin ausgefällt. Die Weiterreinigung des Proteins erfolgt durch präparative Zonenelektrophorese bei pH 8,6, nachdem die Euglobulinfällung in Natriumiäthylbarbituratpufferlösung v:pH 8,6 gelöst wurde. Die Auftrennung der Proteine im elektrischen Feld erfolgt mit der von HEIMBURGER beschriebenen Apparatur und Methode.
• Als inertes Trägermaterial dient Polyvinylchlorid (Geone X 427; Hersteller: Goodrich Chem. Company, Cleveland/Ohio, USA); als Puffer wird eine 0,1 m Natriumdiäthylbarbiturat-Lösung (pH 8,6) verwendet. Das hochmolekulare cL-Globulin wandert in der α1-Zone und wird daraus mit physiologischer NaCl-Lösung eluiert.
• Das Eluat wird auf einem Ultrafilter ankonzentriert und zur letzten Reinigung an Sepharoset 6 B (Säule 5 x 105 cm) unter Verwendung eines 0,1 m Tris-HCl-Puffers pH 8,0 chromatographiert. Diejenigen Fraktionen, die das hochmolekulare -Globulin enthalten, werden gesammelt und vereint.
• Ausgehend von 1500 kg Plazenten werden auf diese Weise im Durchschnitt mehrerer Aufarbeitungen 1 g des reinen hochmolekularen ffi -Globulins erhalten.
• Beispiel 2 1500 kg tiefgefrorene menschliche Plazenten werden im Schneidmischer zerkleinert und mit 1500 1 einer 0,4%igen Kochsalzlösung extrahiert. Der Extrakt wird dann, nach Abtrennung des GeweDerückstandes durch Zentrifugation,mit 20%iger Essigsäure auf pH 6,0 eingestellt und zur Ausfällung des hochmolekularen K-Globulins mit 330 1 einer 1%igen Lösung des Bis-(2-methyl-4-Aminochinolyl-6) carbmid-hydrochlorids versetzt. Die Ab trennung der Fällung erfolgt durch Zentrifugation. Der Niederschlag wird in 800 1 dest. Wasser suspendiert und durch Zufügen von 2 n NaOH bis pH 9,0 in Lösung gebracht. Das Bis-(2-methyl-4-Aminochinclyl-6)carbamid wird durch Einriihren von 5% (G/V) Ammoniumsulfat als Sulfat ausgefällt und durch Zentrifugation oder Filtration aD-getrennt. Aus dem Überstand wird ein Teil der Begleitproteine durch Zusatz von 2%o (G/V) Ammoniumsulfat abgeschieden. Das hochmolekulare α-Globulin bleibt dabei in Lösung. 1000 g der als Zentrifugat erhaltenen leuchten Paste werden in Wasser gelöst und gegen 20 1 einer 0,4%igen Kochsalzlösung dialysiert. Aus dieser Lösung (3 1) wird das hochmolekulare t-Globulin mit einigen anderen Proteinen bei pH 5,5 durch Zusatz von 1,2 1 einer wäßrigen 0,5%igen Lösung von Bis-(2-methyl-4-Aminochinolyl-6) carbamid-hydrochlorid ausgefällt. Der Niederschlag wird in 500 ml Wasser aufgenommen und durch Zugabe von NaOS bei pH 9,0 in Lösung gebracht. Anschließend wird das Bis-(2-methyl-4-Aminochinolyl-6) carbamid durch Zugabe von 5% (G/V) Ammoniumsulfat, ausgefällt und abzentrifugiert Die weitere Fraktionierung der Proteine mit dem Ziel der Anreicherung und Reinigung des hochmolekularen α-Globulins erfolgt durch Gelfiltration, Ammoniumsulfatfällung, Euglobulinfällung und Zonenelektrophorese wie in Beispiel 1 angegeben Beispiel 3 5 l gepackte rote Blutzellen werden zur Waschung mit 5 J physiologischer Kochsalzlösung verrührt und anschliessend bei 3500 U/Nin. zentrifugiert. Der Waschvorgang wird noch zweimal wiederholt. Die gewaschenen Erynthrozyten werden dann durch Zufügen des 5-fachen Volumens an destilliertem Wasser hämolysiert. Der pH-Wert des Hämolysates wird mit 1 n Essigsäure auf pH 6,8 eingestellt. Danach werden unter sorgfältigem Rühren 2,5 kg Diäthyläminoäthyl-Cellulose (DE -32 der Fa. Serva, Heidelberg) als feuchter Filterkuchen zugegeben.
• Der Ansatz wird a Stunde bei Zimmertemperatur kräftig gerührt. Der mit Protein beladene Ionenaustauscher wird anschliessend auf einem Büchner-Filter gesammelt, mit ca. 10 1 0,005 M Phosphatpuffer pH 6,8 gewaschen und in eine Chr9matographie-Säule eingeschlämmt. Die Elution der Proteine erfolgt mit Hilfe eines linearen Salzgradienten (0,005 N Phosphatpuffer pH 6,8 bis 0,4 M Phosphatpuffer pH 6,8, je 10 1), der auf die Säule aufgebracht wird. Das Eluat wird in 500 ml Portionen aufgefangen und in der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese charakterisiert. Diejenige Bande, welche etwas schneller wandert als das Serum-α2-Makroglobulin, wird als das hochmolekulare oL-Globulin gefunden. Alle das hochmolekulare &-Globulin enthaltenden Fraktionen werden vereint und mit gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung bis 45% Sättigung (260 g/l) versetzt.
• Der dabei entstehende Niederschlag wird abzentrifugiert und verworfen. Der Klare Überstand wird unter Rühren mit so viel festem Ammoniumsulfat versetzt, dass eine 60%ige Sättigung (387 g/l) erreicht wird Dabei fällt das hochmolekulare α-Globulin zusammen mit einigen anderen Frythrozytenproteinen aus, das durch 30 liin.
• Zentrifugation bei 4000 U/Min. gewonnen wird. Der Niederschlag wird in 50 ml Wasser gelöst und an einer mit Sepharose 6 B gefüllten und mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 8,0 + 1 M NaCl äquilibrierten Säule von 10 cm Durchmesser und 100 cm Länge gelfiltriert. Die hochmolekulare Fraktion, die sich durch ein Absorptionsrnaximum der bei 280 nm im Fotometer gemessenen Eluate darstellt, ist das reine hochmolekulare cL-Globulin.
• Die zu diesem Gipfel zählenden Fraktionen werden gemischt, in einen Dialysierschlauch gefüllt und gegen so viel gesättigtes Ammoniumsulfat dialysiert, dass eine 65%ige Sättigung (427 g/l) entsteht. Das ausgefallene hochmolekulare α-Globulin wird durch 15 Min. Zentrifugation gewonnen, in wenig destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,85°Aige NaCl-Lösung unter mehrmaligem Wechsel bis zum Schwund der SG4-Ionen dialysiert. Es werden 288 mg des hochmolekularen OL-Globulins erhalten.

Claims (11)

Patentansprüche

1. Hochmolekulares -Globulin, gekennzeichnet durch a) einen Proteinanteil von 92 + 596, einen Gehalt an Kohlen hydraten von 6,6 + 2,0, davon Hexosen 2,6 + 0,6%, Hexosamin (berechnet als N-Acetyl-Hexosamin) 1,8 + 0,6%, Fucose 0,15 + 0,05%?Neuraminsäure (berechnet als N-Acetyl-Neuraminsäure) 2,0 + 0,8%, b) eine Sedimentationskonstante von 19 + 2 S -c) ein Molekulargewicht von 1.000.000-+ 300.000, d) eine Aufspaltung des Moleküls in Untereinheiten mit einem Molekulargewicht etwa zwischen 12.000 und 35.000 nach Inkubation des Moleküls in einer 1%igen Natriumdodezyisulfatlösung und e) eine elektrophoretische Beweglichkeit entsprechend den d1-Globulinen.

2. Verfahren zur Anreicherung des hochmolekularen α-Globulins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Organextrakte oder Hämolysate von Erythrozyten oder daraus gewonnene Lösungen, die dieses Protein enthalten, mindestens einer der folgenden Maßnahmen unterworfen und die bezüglich des hochmolekularen ct-Globulins angereicher-te Fraktion gewonnen wird: *werden a) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer Acridinbase im pH-Bereich 5-9 oder von wasserlöslichen Derivaten einer Chinolinbase im pH-Bereich 5-7j b) fraktionierte Zugabe von Neutralsalzen, c) Euglobulinfällung in salzarmer, schwach saurer Lösung, d) präparative Zonenelektrophore se, e) Gelfiltration oder Ultrafiltration zur Abtrennung von Proteinen mit Molekulargewichten um 1 Mio.

f) Adsorption an und Elution von basischen Ionenaustauschern.

3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als wasserlösliches Derivat einer Acridinbase 24(thoxy-6,9-diamino - a,cridinlactat zugesetzt wird.

4) Verfähren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das 2-Äthoxy-6,9-diamino-acridinlactat in einer Konzentration von 0,7 + 0,456 eingesetzt wird.

5) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als wasserlösliches Derivat einer Chinolinbase Bis-(2-methyl-4-Aminodinolyl-6)carbamid-hydrochlorid zugesetzt wird.

6) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Bis-(2-methyl-4-Aminochinolyl-6)carbamid-hydrochlorid in einer Konzentration von 0,25 + 0,15% eingesetzt wird.

7) Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Salzfraktionierung mit Ammoniumsulfat im Bereich von 45-7G,% Sättigung durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Euglobulinfällung in salzarmer Lösung bei pH 5,5 + 1,5 vorgenommen wird.

9. Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Organextrakt ein Extrakt aus menschlichen Plazenten verwendet wird.

1 Verwendung des hochmolekularen oL-Globulins gemäss Anspruch 1 zur Gewinnung von Antiseren nach an sich bekannten Verfahren.

11. Verwendung. des hochmolekularen α-Globulins gemäss Anspruch 1 oder dessen Antiserum als Reagens in Bestimmungsverfahren für das hochmolekulare α-Globulin.