DE2616984A1 - Verfahren zur anreicherung eines plazentenspezifischen glycoproteins - Google Patents

Verfahren zur anreicherung eines plazentenspezifischen glycoproteins

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Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT Marburg / Lahn
Aktenzeichen: Ma 257 UOE J6/b 012 Datum: 13.April 1976
"Verfahren zur Anreicherung eines plazentenspezifischen Glycoproteins"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung eines in der meschlichen Plazenta vorkommenden von H.Bohn 1972 im wässrigen Plazentenextrakt gefundenen als PP1- bezeichneten Plazentaproteins sowie damit antigenverwandter Proteine.
Wie von H.Bohn in Archiv für Gynäkologie, Bd 212, Seite 155 bis 175, 1972, beschrieben, kann mit Hilfe von Antiseren, die durch Immunisierung von Plazentenfraktionen gewonnen worden waren, im Extrakt von Plazenta eine Reihe löslicher Antigene immunologisch nachgewiesen werden. Für das mit PP^. bezeichnete Protein konnte gezeigt werden, dass es offensichtlich plazentaspezifisch ist, denn die Nachweisversuche dieses Proteins mit immunologischen Standardtechniken in einer Reihe von embryonalen und adulten menschlichen Organen oder auch im Humanplasma sowie Erythrozytenlysaten führten zu keiner positiven Reaktion.
In der elektrophoretischen Wanderung in Agar zeigt sich PPg als ß,-Globulin. In einem Polyacrylamidgel wandert es im Vergleich zu Albumin = 100 mit einer relativen Beweglichkeit von 75. Aufgrund seines Verhaltens bei der Gelfiltration auf juervernetztem Dextran wurde ein Molekulargewicht für PP^ von ^?twa 50.000 abgeleitet. Das PP5 ist selbst im Plazenten-
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extrakt in relativ niedriger Konzentration vorhanden, sodass seine Reindarstellung trotz aufwendiger Verfahren d.er biochemisch präparativen Techniken bisher nicht möglich war, insbesondere weil diese Verfahren nicht hinreichend selektiv sind.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass PP,- durch Immunadsorption soweit angereichert werden kann, dass in einer anschliessenden Reinigung nach konventionellen Fraktionierungsmethoden oder auch in einem weiteren Immunadsorptionsverfahren, in welchem die restlichen Serumproteine und Plazentenproteine entfernt werden können, das reine PP,- erhalten werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Anreicherung des Proteins PP1. aus dessen Lösungen, vorzugsweise aus dem wässrigen Extrakt von Plazenten.
Es liegt im Sinne der Erfindung, dass danach nicht nur PP,-sondern auch mit dem PP,- antigenverwandte Proteine isoliert bzw. angereichert werden können. Umgekehrt sind serologisch mit PPn verwandte Antikörper zur adsorptiven Gewinnung sowohl von PP1- als auch von damit antigenverwandten Proteinen einsetzbar.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine PPn. enthaltende Proteinlösung, vorzugsweise den wässrigen Extrakt von Plazenten -im besonderen menschlichen Plazenten-, bei einem pH-Wert zwischen 4 und 9 mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Antikörper gegen das PP1. in Berührung bringt, den Träger, der das PP5 gebunden enthält, von der flüssigen Phase abtrennt und zur Ablösung des PP5 mit einem wässrigen Medium vom pH-Wert 2-4 oder mit einer Lösung eines Protein— bindungen dissoziierenden Stoffes bei einem pH-Wert von
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4-9, vorzugsweise etwa pH 7, behandelt.
Als Ausgangsmaterial dient bevorzugt die menschliche Plazenta, aus der man etwa 1 - 2 mg PP1. pro Plazenta durchschnittlicher Größe (ca.500 - 600g) extrahieren kann. Zur Herstellung des wässrigen Extraktes werden zerkleinerte Plazenten mit Wasser oder einer geeigneten Salzlösung behandelt und die flüssige Phase gewonnen.
Geeignete Salze für die Salzlösung sind möglichst inerte Salze, wie sie als Bestandteile von Lösungen für die Extraktion von Geweben bekannt sind. Verwendet werden dazu Neutralslze und PufferSubstanzen, insbesondere Kochsalz oder Tris-hydroxymethylaminomethan, ferner Alkalisalze der Phosphor- oder Citronensäure. Zweckmässig liegen die Salzkonzantrationen bei 0,1 bis 5 %.
Bei dem erfindunsgemässen Verfahren kann das PP^ aus üblicherweise verwendeten Plazentenextrakten, in denen es in einer Konzentration von etwa 0,1 - 0,4 mg pro 100 ml vorliegt bis zu einer Konzentration von etwa 100-1 000 mg/100 ml angereichert werden. Die spezifische Anreicherung liegt bei etwa 25.000 - 50.000.
Der für die Anreicherung des PPc benötigte Antikörper, der in bekannter Weise an einen festen Träger gebunden werden kann, wird durch Immunisierung von Tieren mit PP_ erhalten. Solange das Reinprotein nicht zur Verfügung steht, wird der für die Immunisierung von Wirbeltieren, insbesondere Kaninchen, mit einer durch Fällungsverfahren in Bezug auf PP5 angereicherten Plazentenfraktion hergestellt: beispielsweise nach der von H. Bohn 1972 beschriebenen Methode.
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Bei der Immunisierung mit derartigen Rohfraktionen werden Antiseren mit multispezifischen Antikörpern erhalten. Die nicht spezifisch gegen PP1- gerichteten Antikörper werden mit geeigneten Antigenen aus Blutserum und Plazentenfraktionen behandelt, wonach mit Hilfe der resultierenden Antigen-Antikörperreaktion die unspezifischen Antikörper entfernt werden können.
Die Gewinnung der Immunglobulinfraktion, in der sich PPc" Antikörper befinden, erfolgt in bekannter Weise. Das danach erhaltene Anti-PP^ wird entsprechend bekannten Verfahren an geeignete Träger gebunden. Solche Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Ann. Rev. Biochem. 40, 1971, Seite 259, Naturwissenschaften 58 (1971), Seite 389 oder Nature 314 (1967), Seite 1302. Besonders geeignete Träger sind hochpolymere Kohlenhydrate, wie Cellulose oder Agar, synthetische Harze, wie Polyacrylamid oder Co-Polymere aus Äthylen/Maleinsäure-Anhydrid; auch Glaspartikel können als Träger verwendet werden.
Besonders bevorzugt als Trägermaterial ist eine gereinigte Agarose in Form von kleinen Kügelchen mit einem Durchmesser von 20 - 200 μΐη an die nach der oben zuletzt genannten Methode die Antikörper gegen PP1- kovalent gebunden werden können.
Für die Isolierung des PP5 aus Lösungen, im Besonderen aus Plazentaextrakten, die ausserdem andere Proteine und Kohlehydrate enthalten, wird die PP5-Lösung mit dem den Antikörper tragenden Adsorbens in Berührung gebracht, wobei der pH-Wert auf >4 eingestellt wird, um eine Denaturierung der Proteine zu vermeiden, empfiehlt es sich, den pH-Wert nicht höher als 9 zu wählen. Die Salzkonzentration der Lösung ist nicht kritisch. Jedoch sollten Bedingungen vermieden werden, die geeignet sind, die Bindung von Antigenen an Antikörper zu lösen. Vorteilhaft enthält die wässrige Lösung neutrale Salze
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und/oder Puffersubstanzen, wie sie allg. in biochemischen Reaktionen verwendet werden/ insbesondere Natriumchlorid/ Phosphatpuffer, Tris-Hydroxymethylaminomethan oder andere bekannte Puffersubstanzen, wie sie beispielsweise in Biochem. J5. 472, (1966)/ beschrieben sind. Die Konzentration dieser Substanzen liegt zweckmässig im Bereich zwischen 0,01 und 2 Mol/l- Das Verhältnis Proteinlösung!Adsorbens ist zweckmässig im Bereich 1:1 - 10:1, vorzugsweise 2:1. Das Adsorbens sollte mit der Proteinlösung 0,1 bis 5 Stunden in Berührung bleiben, damit genügend Zeit zur Verfügung steht, die Antigen-Antikörper-Bindung zu knüpfen.
Die Adsorption und die Elution des PPj- kann sowohl im sogenannten batch-Verfahren als auch in einer Chromatografie-Säule durchgeführt werden. Hierzu wird das Adsorbens von der Lösung abgetrennt, im batch-Verfahren durch Zentrifugierung oder Filtration mehrfach mit einer neutralen Salzlösung gewaschen, um überschüssige Salze und unspezifisch adsorbierte Verunreinigungen zu eliminieren. In dem Säulenverfahren wird die Lösung durch gründliches Spülen mit Pufferlösung aus der Säule entfernt.
Die Elution des PP5 vom Antikörper-haltigen Träger kann auf bekannte Weise durch Maßnahmen erfolgen, die die Auflösung von Antigen-Antikörper-Bindungen bewirken. Beispielsweise kann die Elution durch Behandlung des Trägers mit einem wässrigen Medium vom pK-Wert< 4, vorzugsweise zwischen 2 und 4 erfolgen. Die entsprechende Lösung sollte Salze und geeignete Puffersubstanzen in geeigneter Konzentration, vorzugsweise 0,2 8 Mol/l enthalten.
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Im batch-Verfahren empfiehlt es sich, die Dispersion des Adsorbens in dieser Lösung 0,1 - 2 Stunden lang zu belassen, wobei das PP^ vom Immunadsorbens desorbiert wird. Im Säulenverfahren lässt man die Elutionslösung durch die Säule hindurchfliessen. Nach Abtrennung des Adsorbens wird der pH-Wert der das PP ς enthaltenden Lösung auf etwa neutral (pH 6-8) gestellt. Die angereicherte PP^-Lösung kann gewünschtenfalls einer weiteren Reinigung unterworfen werden.
Die Elution des PP5 vom Antikörper-haltigen Träger kann auch mit Hilfe von Proteinbindungen dissoziierenden Stoffen, beispielsweise Harnstoff- oder Guanidinlösungen oder Lösungen von' sogenannten chaotropen Salzen wie NaNO., NaBr, NaCIO4, CF_C00Na, NaSCN oder CCl3COONa erfolgen. Die Konzentration dieser Salze im Elutionsmedium beträgt zweckmässig 2 bis 8 Mol/l. Zur Entfernung der chaotropen Salze aus der Lösung nach der Desorption des PP ~ und zur Abtrennung des Adsorbens kann die Lösung gegen eine Neutralsalzlösung oder Pufferlösung der Konzentration 0,1 bis 1 Mol/l dialysiert werden.
Das nach diesem Verfahren erhaltene PP5 besitzt einen Reinheitsgrad von 50 bis 80 %. Durch weitere Reinigungsverfahren kann es auf über 99% angereichert werden.
Falls eine Weiterreinigung des durch Immunadsorption angereicherten PP1. gewünscht wird, kann diese mit gängigen Fraktionierungsverfahren vorgenommen werden. Bevorzugt werden dabei Fraktionierungsverfahren mit Hilfe eines Molekularsiebs mit dem Ziel, die PPc-Anteile in den Fraktionierungsbereichen von Molekülen mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000 anzureichern- Ein weiteres gängiges anwendbares Verfahren ist die Ionenaustausch-
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Chromatographie. Dabei werden die Ladungseigenschaften des PPf-verwertet, das sich bekanntlich wie ein ß, -Globulin verhält. Eine weitere Möglichkeit zur Rein-Darstellung des PP5 ist in Immunadsorptionsverfahren gegeben, bei denen nicht die Anti-
körper gegen PP5 sondern gegen die zu entfernenden Verunreinigungen als trägergebundene Adsorbentien Verwendung finden. Das PPj- befindet sich nach Anwendung dieses Verfahrens in den nicht gebundenen Anteilen.
Der Fortschritt der Reinigungsverfahren ist in jedem Falle am einfachsten mit Hilfe entsprechender Antiseren überprüfbar. Bei den jeweiligen Fraktionierungsverfahren werden diejenigen Fraktionen gewonnen, die mit dem spezifisch gegen PP^ reagierenden Antiseren eine immunologische Reaktion, insbesondere eine Immunpräzipitation, zeigen.
Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhältliche PP1. ist besonders geeignet, spezifisch dagegen gerichtete Antiseren herzustellen. Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung des erfindungsgemäss erhältlichen PP1- zur Herstellung eines Anti-PP„-Serums. Dabei werden Tiere nach bekannten Methoden mit PP1- immunisiert und aus dem Blut der Tiere das Antiserum gewonnen. Mit Hilfe dieser neuen Antiseren lässt
sich PP5 durch immunologische Methoden, wie beispielsweise dem Hämagglutinationshemmungstest, der Komplimentbindungsreaktion, dem Radioimmunoassay, der Latexagglutination und ähnlichen empfindlichen Methoden, in Körperflüssigkeiten nachweisen.
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So lässt sich zeiyeii, dass FP- während der Schwangerschaft in geringen Konzentrationen im Blut der Schwangeren erscheint. Ferner ist PPj. in der Tumordiagnostik von Bedeutung. Es kann im Blut von Kranken mit trophoblastischen Tumoren nachgewiesen werden, in der Regel bestehen die entsprechenden diagnostischen Mittel in; Wesentlichen aus Anti-PPc und bei bestimmten Verfahren, beispielsweise in radioimmunologischen Testsystemen, .wird ΡΡς selbst als Standardsubstanz mitgeführt. In diagnostischen Mitteln zum Nachweis von gegen PP1. gerichteten Antikörpern ist PP1- der wesentliche Bestandteil des Reagens.
Das nachfolgende Beispiel erläutert das Verfahren..
1. Herstellung des Immunadsorberns
150 ml eines Anti-PP--Serums vom Kaninchen werden gegen 0,02M Phosphatpuffer (pH7,0) dialysiert und zur Abtrennung der Immunglobuline an DEAE-Zellulose chromatographiert. Die Immunglobulinfraktion (1,3g Protein) wird dann mit 258 g besonders gereinigter Agarose in Kugelform
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(Sepharose 4B der Pharmacia Uppsala, Schweden), die mit 16,1 g Bromcyan aktiviert worden war, umgesetzt und so kovalent an diesen Träger gebunden.
Das Verfahren ist beschrieben von Axen R., Porath J., Ernbach S., Nature 214, 1302, (1967).
Mit Hilfe eines auf diese Weise hergestellten Immunadsorbens kann das Plazentaprotein PP5 aus dessen Lösungen, insbesondere aus PPj--angereicherten Plazentaextraktfraktionen isoliert werden. ,g
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2. Anreicherung des PP1- aus Plazentaextrakt
2.1. Anreicherung der PPj- Eiweiß fraktion
150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 150 Liter einer 0,5%igen wäßrigen Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2 normalem Natriumhydroxid auf pH 8 eingestellt und mit 50 Liter einer 3%igen wässrigen Lösung von Diaminoäthoxyacridin-
(R)
lactat (Rivanol ) versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 Stunde wird der Überstand, der das PPj- zusammen mit Gammaglobulin enthält, abgehebert, mit 5% festem Natriumchlorid (11 kg) zur Abscheidung des noch in Lösung verbliebenen Rivanols versetzt, filtriert und mit 26,5%, bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit, festem Ammonsulfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert.
500 g des auf dem Filer gesammelten Niederschlags werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,01 molare Tris-(oxymethyl)-aminomethan (im folgenden mit "Tris" abgekürzt)-Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0, die 0,05% Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert und der Überstand wird mit der gleichen Pufferlösung auf 2000 ml aufgefüllt, mit 0,1 normaler Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt und mit 250 g feuchter DEAE-Cellulose eine Stunde verrührt.
Sodann wird die DEAE-Cellulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je einem Liter 0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 ml 0,02 molarem Tris-Salzsäure-Puffer, pH 6,5, der 0,85% Natriumchlorid und 0,05% Natriumazid enthält, eluiert.
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- yf-
Den vereinigten Eluaten wird 30% Ammonsulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesetzt und das ganze verrührt. Der Niederschlag, der das PP5 enthält, wird mit 100 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen einen 0,1 molaren Tris-Salzsäure-Puffer pH 8,0, der 1,0 Mol NaCl pro Liter und 0,1% Natriumazid enthält, dialysiert. Man erhält 200 ml einer Lösung mit ca. 6% Eiweiß und etwa 30 mg PP-. Aus dieser Fraktion kann PP1-durch Immunadsorption isoliert werden.
Das unter 2.1 vorgestellte Anreicherungsverfahren ist nicht erfindungswesentlich. Die Immunadsorption kann auch mit Plazentenextrakt direkt durchgeführt werden.
2.2i Immunadsorption des PP5
Das Immunadsorbens wird in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 1,0 Mol/l NaCl und 0,1% NaN3 enthält (nachstehend Pufferlösung I) suspendiert, dann in eine Chromatografiesäule gefüllt (3 χ 20 cm) und mit Pufferlösung I nachgespült. Dann läßt man langsam 100 ml einer PP1-" haltigen Lösung durch die Säule wandern, wobei PP5 immunadsorptiv gebunden wird. Man wäscht die Säule gründlich mit Puffer I nach und eluiert dann das adsorbierte Protein mit 0,5 M Glycin-HCl-Puffer (pH 2,5). Die ΡΡς-haltigen Eluate werden mit 1 η NaOH auf pH 7,0 eingestellt und im Ultrafilter auf ca. 10 ml eingeengt. Ausbeute pro Adsorption ** 2 mg PP-.
Das Adsorbens in der Säule wird unmittelbar nach der Elution von PP5 wieder mit Pufferlösung I neutralisiert und gründlich gewaschen; es kann dann erneut zu immunadsorptiven Bindung von PP5 eingesetzt werden.
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Das durch Immunadsorption gewonnene Protein ist häufig durch unspezifisch gebundene Serumproteine (hauptsächlich IgG und daneben etwas IgA) verunreinigt. Die Abtrennung dieser Begleitproteine gelingt, z.B. durch Gelfiltration, Molekularsiebfraktionierung z.B. bevorzugt mit Hilfe von quervernetztem
(R)
Dextran wie Sephadexv G - 100; die Serumproteine können aber auch durch Immunadsorption, d.h. mit Hilfe von trägergebundenen Antikörpern gegen Serumproteine, entfernt werden.
Das im Rahmen der Erfindung verwendete Anti-PP5-Serum wurde wie folgt erhalten:
Es wurden Kaninchen mit dem gereinigten PP5 unter Verwendung von Aluminiumhydroxid als Adjuvans über einen Zeitraum von 6 Wochen immunisiert.
Das PP5 wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst (Konzentration 0,06 mg/ 3ml) und unter Zusatz von Aluminiumhydroxid zu einer Suspension verrührt. Die Kaninchen erhalten an 5 aufeinander folgenden Tagen je 0,06 mg Protein in 3 ml Suspension/Tier i.v. injiziert.
Anschließend läßt man die Tiere 9 Tage ruhen. Dann immunisiert man xtfleder an 5 aufeinander folgenden Tagen mit der oben angegebenen gleichen Menge Antigen, läßt die Tiere wieder 9 Tage ruhen und injiziert schließlich nochmals an 5 aufeinander folgenden Tagen je 0,06 mg des Antigens. Nach einer erneuten Wartezeit von 7 bis 9 Tagen werden die Tiere entblutet. Nach dem Gerinnen des Blutes wird das Serum vom Blutkuchen abgeschleudert und gewonnen.

Claims (1)

  1. PATENTANSPRÜCHE
    HOE 76/B 012
    1. Verfahren zur Anreicherung des plazentaspezifischen Proteins PP5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine PP5 enthaltende Pro-f-ei η lösung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 9 mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Antikörper gegen das PP5 in Berührung bringt, den Träger, der das PP5 gebunden enthält, von der flüssigen Phase abtrennt und zur Ablösung des PP1- mit einem wässrigen Medium vom pH-Wert 2 bis 4 oder mit einer Lösung eines Proteinbindungen dissoziierenden Stoffes bei einem pH-Wert von 4 bis 9 behandelt.
    2. Verwendung des nach Anspruch 1 erhältlichen plazentaspezifischen Proteins PPj. in einem diagnostischen Mittel zum Nachweis des PP1. und von gegen PP- gerichteten Antikörpern.
    3. Verwendung des nach Anspruch 1 erhältlichen plazentaspezifischen Proteins PP1- zur Herstellung eines gegen das plazentaspezifische Protein PP5 gerichteten Antiserums.
    9.0 9SU/05 4 5
DE2616984A 1976-04-17 1976-04-17 Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines plazentenspezifischen Glycoproteins Expired DE2616984C3 (de)

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