DE2612479A1 - Verfahren zur anreicherung des schwangerschaftsspezifischen beta tief 1- glycoproteins - Google Patents

Description

BEIlIUlViGWERKE AKTlENGESJiI-,LSOHAFT, Marburg(Lahn)

Akte.nze5.chen: Hoe 75/B 010

Datums 17.3.1976"

Verfahren zur Anreicherung· des schwangerechaftsspezifischen β-Glycoproteins

i.n der Patentanmeldung 21 57 61O ist ein in der Plazenta vorkommendes Glycoprotein beschrieben, dem die Bezeichnung "Schwangerschaftsspezifisches B₁-GIyCOPrOtGiIi" (SP1) zukommt* Forner ist in der genannten Patentanmeldung ein Verfahren zur Isolierung dieses Glycoproteins beschrieben.

Es wurde nun ein Verfahren gefunden, das die Isolierung- des sehvangerschaftsspezifischen ß -»Glycoproteins in besserer Ausbeute und grösserer Reinheit ermöglicht. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Blutserum, Urin oder Plazentenextrakt bei einem pH-Wert zwischen k und 9 mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Antikörper gegen das schwangerschaftsspezifische ß -Glykoprotein in Berührung- bringt, den Träger, der das Glykoprotein gcbiraden enthält, von der flüssigen Phase abtrennt und zur Ablösung des Glykoproteins mit einem wässrigen Medium

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vom pH-Wert 2 - k oder einer Lösung eines Proteinmoleküle dissoziierenden Stoffes bei einem pH-Wert von h~9, vorzugsweise etwa pH 7» behandelt.

Bei diesem Verfahren wird das Schwangerschaftsspezifische ß.-Glykoprotein aus seinen Lösungen durch, spezifische Immunadsorption gewonnen mit Hilfe eines Trägers, der den entsprechenden Antikörper in unlöslicher Form enthält.

Der
/Antikörper₉der in bekannter Weise- an einen festen Träger gebunden werden kann, wird erhalten durch Immunisation von Tieren mit dem schwangerschaftsspezif±sehen. ß..-Glyko~· protein. Das Blut der so behandelten Versuchstiere wird in bekannter Weise zur Gewinnung der Immuno globulin ~ Fraktion aufgearbeitet. Das auf diese Weise erhaltene Anti-SP »Serum wird entsprechend bekannten Verfahren an geeignete Träger gebunden. Solehe Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Ann. Rev. Bi'ochem, kO (1971) 259ϊ Naturwissenschaften 58 (1971) 389 oder Nature 214 (i°-67) 1302. Besonders geeignete Träger sind Hochpolymere Kohlehydrate wie Cellulose oder Agar, synthetische Harze wie Polyacrylamid oder Copolymere aus Athylen/Maleinsäurearihydrid. Auch Glaspartikeln können als Träger verwendet werden. " ■ -. _

Besonders bevorzugt als Trägermaterial ist eine gereinigte Agarose in Form von kleinen Kügelchen mit einem Durchmesser von etwa 20 - 200 fim an die nach der oben zuletzt genannten Methode die Antikörper gegen das SP₁ covalent gebunden werden können.

Für die Isolierung des SP. aus Lösungen» die ausserdem andere Proteine und Kohlehydrate enthalten wie Plazentaextrakten oder Serum oder Urin von Sch^angex-en,werden

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die genannten Ausgangsstoffe mit dem den Antikörper tragenden Adsoi'bens in Berührung gebracht, wobei der· pH-Wert auf

^ h eingestellt wird« Um eine Benaturieruiig der Proteine zu vermeiden, empfiehlt es sich., den pll-¥ert nicht höher als 9 zu wählen* Die Salzkonzentration der Lösung ist nicht kritisch. Jedoch seilten Bedingungen vermieden werden, die geeignet sind, die Bindung von Antigenen an Antikörper zu lösen. Vox'texlhaft enthält die wässi-ige Lösung neutrale Salze und/oder Puffersubstanzen, •wie sie allgemein in biochemischen Reaktionen-.verwendet werden, insbesondere Natriumchlorid, Phosphatpuffer, Trishydroxymethylaminomethan oder andere bekannte Puffersubstanzen, wie sie beispielsweise in Biochemistry 5 0966) kf2 beschrieben sind. Die Konzentration dieser Substanzen liegt zweckmässig im Bereich zwischen O,OI und 2 Mol/l. Das Verhältnis Proteinlösung:Adsorbens ist zweckmässig im Bereich 1:1 bis 10:1, vorzugsweise 2:1. Das Adsorbens sollte mit der Proteinlösung O,1 bis 5 Stunden in Berührung bleiben, damit genügend Zeit zur· Verfügung steht, die Anti gen·-Anti« körper-Bindtmg zu knüpfen.

Das Adsorbens wird sodann von der Lösung durch Zentri— fugierung oder Filtration abgetrennt und mehrfach mit einer neutralen Salzlösung gewaschen, um überschüssige Salze und unspezifisch adsorbierte Verunreinigungen zu eliminieren«

Die Elution des SP₁ vom Antikörper-Haltig^n Träger kann auf bekannte Weise durch Maßnahmen erfolgen, die die Auflösung von Antigen—Antikörper-Bindungen bewirken. Beispielsweise kann die Elution durch Einbringen des Trägers in ein wässriges Medium vom pH—Wert "^ 4, vorzugsweise zwischen 2 und h erfolgen. Die entsprechende Lösung sollte Salze und geeignete Puff er subs tanzen in geeigneter Konzentration, vorzugsweise 0,2 bis 8 Mol/l enthalten.

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Es empfiehlt sich., die Dispersion des Adsorbens in dieser Lösung 0,1 bis 2 Stunden latag zu rühren, wobei das SP vom Immunadsorbens desorbiert wird. Nach Abtrenming des Adsorbens vii-d der pH-Vert der das SP enthaltenden Lösung auf etwa, neutral (6 bis 8) gestellt. Die Lösung kann gewünschtenfalls einer weiteren Reinigung beispielsweise durch Adsorption an Hydi-oxyl apatit (Patentanmeldung Hoe 75/B 01 1 ) unterworfen werden.

Die Elution. des SP vom Antikörper'-haltigen Träger kann auch mit Hilfe von Proteine dissoziierenden Stoffen, beispielsweise Harnstofflösungen oder Lösungen von sogenannten chaotropen Salzen wie NaNO , NaBr, NaC 104, CF₃COONa, NaSGN oder CCl„COONa erfolgen. Die Konzentration dieser Salze i rr; Elutionsmedium beträgt zweckmässig 0_r2 bis 8 Mol/l. Zur Entfernung der- Proteinmoleküle dissoziierenden Stoffe aus der Lösung nach der Desorption des SP und zur Abtrennung des Adsorbens kann die Lösung gegen eine Neutralsalzlösung oder Pufferlösung der Konzentration 0,1 bis 1 Mol/l dialysiert werden.

Das nach diesem Verfahren erhaltene SP besitzt einen Reinheitsgrad von 60 bis 95$>· Durch weitere Reinigungsverfahren kann es auf über 99?& angereichert werden.

Das nachfolgende Beispiel erläuteret das Verfahren:

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Isolierung von schwangerschaftsspezifischem ß -G-lycoprotein aus deiisen Lösungen durch Immunoadsorption

Ein zur spezifischen Bindung von schvangerscliaftsspezifischom ß -Glycoprotein geeignetes Immunoadsorbens einhält man durch kovalente Verknüpfung von Anti-schwangerschaftsspezifisclien·- ß,~Glycoprotein~Irnmunoglobulinen mit einem geeigneten Trägar. Das im vorliegenden Beispiel verwendete Immunoadsorbens wurde durch Bindung von 1,75 S Protein einer aus Anti-sehwangerschafts~ spezifiscliem-ß »Glycoprotein-Kaninchenserum gewonnenen Inrnninoglobulinfraktion an 175 δ Sepharose(R) '{ B (Pharmacia Uppsala), die mit 21*8 g BrCN

aktiviert worden war, hergestellt (Axen, R., Porath, J-, Ernbaeh, S.; Mature 214, 1302 (1967)}. Mit Hilfe dieses Immunoädsorbens läßt sich schwanger schaff tsspexif isches β,-Glyicoprotein nach, folgendem Verfahren aus dem Extrakt von Plazenten isolieren:

Der scxiv/angersciiäftsspez-ifiseheS- B₁ -Glykopr ο te in-enthalten de Plazentenextrakt wird zunächst gegen 0,1 m Trishydrcxyi?.ethyl— arainomethan-Salzsäure-Puffer (pH 8,0), der 1,0 Mol/Liter KaCl •und 1 g/Liter Natriurnazid enthält, dialysiert. Zu dieser Lösung gibt man als spezifisches Adsorbens das trägergebundene Anti-schwangerschaftsspezifische ßy-Glykoprotein^-.Iirtfaunoglobulin, rührt 2 Stunden bei 4°C und saugt auf einer Filternutsche das Adsorbens mit dem gebundenen sehwangerschaftsspezifischen ß-^- Glykoprotein ab. Das Adsorbens wird zunächst mit 2 χ 250 ml der 0,1 nt Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäure-Pufferlösung und .danach mit 2 χ 250 ml einer physiologischen (0,9?£igen) Kochsalzlösung gev/aschon; anschließend eluiert man das schv/angerschaftsspezifischG ßj_-Glykoprotein von dem Adsorbens- durch sechsmalige Behandlung des Adsorbens je 20 Minuten lang mit 400 ml eines 0,5 m Glycin-HCl-Puffers »vom pH-Wert 2,5- Die

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vereinigten EXuate werden mit 1 η NaOH auf pH 7_r0 eingestellt und auf einem Ultrafilter auf 10 ml eingeengt. Die schvangerschaftsspezifische-ß -Glycoprotein-haltige Lösung wird sodann durch Dialyse gegen Wasser salzfrei-gemacht und schliess« lieh lyophilisiert. Gewünschtenfalls kann die ¥ ext err einiglingder SP -Lösung z.B. durch die folgenden Verfahren vorgenommen werden, Das Koxjjsenti'at wird, gegen einen 0,005 m Natriuirrphosphatpuffer vom pH-Vert 6,8 dialysiert und/oder- durch Chromatographie an Hydroxylapatit wie in Patentanm, Hoe weiter·
/gereinigt» Da/bei werden die vom Immtmoadsorbens unspszifiscii

gebundenen und anschliessend eluierten Plasmaproteine an das Hydroxylapatit adsorbiert, während im Durchlauf das gerschaftsspezifische ß,—Glycoprotein in hochgereirjd (Reinheit >99?0 vorliegt.

Das gleiche Verfahren kanu angewandt verdeE, wenn das schwa-iif^erschaf tsspozif ische ß -Glycoproteiix au: von Schwangeren gewonnen werden soll»

schaf tsspozif ische ß -Glycoprotein. aus dem Sex^um oder dem Urin

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Claims (1)

1. Patentanspruch

   Verfahren zur Anreicherung des schwangei-schaftsspezifischen ß -Glycoproteins (SP ) aus Blutserum, Urin oder Plazontenextrakt, dadurch gekennzeichnet, dass man das Aus gangsmaterial bei einem pH-Wert zwischen h und 9 mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Antikörper gegen das schwangerschaftsspezifische ß -Glycoprotein in Berührung bringt, den Träger, der das SP gebunden enthält» von der flüssigen Phase abtrennt und zur Ablösung des SP₁ mit
   einem wässrigen Medium vom pH—Wert 2~h oder einer Lösung eines Proteinmoleküle dissoziierenden Stoffes bei einem pH-Wert h-9 behandelt.

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   ORIGINAL INSPECTED