CN101125886B - 卵黄免疫球蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卵黄免疫球蛋白的提取方法。具体步骤如下：1)水稀释，将卵黄用水稀释后过夜，去除沉淀，取上清液。2)无机盐沉淀，将上清液用饱和硫酸铵沉淀，离心分离，取沉淀。3)柱层析，将沉淀重新溶解，用填充MEPHyperCel的层析柱进行分离，收集洗脱峰。4)脱盐和干燥，收集液脱盐后，冷冻干燥，得到纯度大于95％的卵黄免疫球蛋白。本发明所开发的卵黄免疫球蛋白提取方法的关键步骤在于MEP HyperCel混合模式吸附层析，具有操作步骤简单，分离纯化因子高的优点，并且成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及一种卵黄免疫球蛋白的提取方法。
背景技术
禽类(如母鸡)接受特定抗原的免疫后，在卵黄成熟期，血液中的免疫球蛋白IgG选择性地转移到卵黄中，形成卵黄免疫球蛋白，通常称为IgY。IgY分子量约为180kD，具有一些不同于哺乳动物IgG的生物学特性，比如IgY对哺乳动物的补体成分无固定作用，也不与Fc受体结合，更突出的是IgY不与血清中的类风湿因子反应，这在许多免疫学检测中可有效地避免由补体成分引起的假阴性结果，以及由类风湿因子引起的假阳性结果，有利于提高免疫检测诊断的准确率。另外，IgY具有耐热、耐酸、价廉易得、稳定性好、可口服等优点，可代替哺乳动物来源的抗体，在免疫治疗剂、食品添加剂、疾病防治等方面均有广泛的用途
禽类蛋(如鸡蛋)提供了廉价易得的IgY来源，产量高，一枚鸡蛋中约含有100～250mg的IgY。如何将大量的卵黄免疫球蛋白高效地提取出来，是决定IgY能否获得广泛应用的前提。鸡卵黄中约含有脂肪30.5％、蛋白质17.8％和水48％。分离的第一步一般需要除去高浓度的脂类物质，得到水溶性组份(WSF)，最常用的方法是水稀释抽提法。在纯化阶段，常采用盐析与离子交换结合、疏水层析与凝胶过滤结合等方法，然而分离效果均不好，不适于大规模的生产。
近年来发展了一种新型的层析技术——混合模式吸附层析，功能配基同时含有疏水基团和离子交换基团，兼具疏水作用和静电相互作用，可以通过静电相吸来强化吸附或静电排斥来协助解吸。另外，配基密度通常比较高，吸附容量大，且具有典型的耐盐吸附特性，特别适合于大规模的分离纯化。本发明选用了Pall Biosepara公司开发的商业化的混合模式吸附介质MEP HyperCel，进行IgY的分离和纯化。
本发明将混合模式吸附层析与盐析分离相结合，用MEP HyperCel混合模式吸附直接处理卵黄稀释液盐析沉淀的溶解液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量、抗体选择性和耐盐吸附的特性，建立起一个卵黄免疫球蛋白的经济高效分离方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种卵黄免疫球蛋白的提取方法。
包括如下步骤：
1)水稀释法去除脂类物质
将卵黄用水稀释6～8倍，混匀，保持搅拌，用0.1M HCl和0.1MNaOH溶液调节卵黄稀释液pH到5.0～5.5，置于4℃过夜，用离心机以8000～10000rpm转速离心25～30分钟，去除沉淀，得到含有卵黄免疫球蛋白的卵黄稀释液；
2)无机盐沉淀法粗提卵黄免疫球蛋白
将饱和无机盐溶液缓缓倒入步骤1)得到的卵黄稀释液，保持搅拌，直至溶液中无机盐饱和度达到40～50％，溶液置于4℃静置2～3小时，使用离心机以8000～10000rpm转速离心25～30分钟，收集沉淀，得到卵黄免疫球蛋白粗品；
3)混合模式吸附层析纯化卵黄免疫球蛋白
将步骤2)得到的卵黄免疫球蛋白粗品用平衡缓冲液溶解，0.2μm滤膜过滤后，上样到填充有MEP HyperCel的层析柱，平衡缓冲液冲洗，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，得到卵黄免疫球蛋白溶液；
4)脱盐和干燥
将步骤3)得到的卵黄免疫球蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到95.6～99.8％高纯度的卵黄免疫球蛋白。
所述的卵黄来自新鲜的禽类蛋。无机盐为硫酸铵或硫酸钠。平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为8.5～8.9。洗脱液为柠檬酸钠缓冲液，pH值为4.2～4.4。
本发明将混合模式吸附层析用于卵黄抗体的分离纯化。与盐析分离相结合，用MEP HyperCel混合模式吸附直接处理卵黄稀释液盐析沉淀的再溶解液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量提高过程的处理量，抗体的高选择性提高分离的效率，以及耐盐吸附的特性简化分离步骤，得到一个经济高效的卵黄免疫球蛋白提取方法。本发明的优点在于：1)工艺简单，易于放大，成本较低廉；2)过程处理量大，分离效率高；3)所得卵黄免疫球蛋白的纯度高。
附图说明
图1是本发明MEP HyperCel混合模式吸附层析纯化卵黄免疫球蛋白的电泳图谱。
具体实施方式
本发明提供一种卵黄免疫球蛋白的提取方法。将卵黄用水稀释得到含有卵黄免疫球蛋白的上清液，用无机盐沉淀得到卵黄免疫球蛋白沉淀，将沉淀重新溶解，进一步使用混合模式吸附层析进行分离纯化，得到高纯度的卵黄免疫球蛋白。通过本发明法分离得到的卵黄免疫球蛋白纯度为95.6～99.8％。
卵黄免疫球蛋白的提取方法包括如下步骤：
1)水稀释法去除脂类物质
将卵黄用水稀释6～8倍，混匀，保持搅拌，用0.1M HCl和0.1M NaOH溶液调节卵黄稀释液pH到5.0～5.5，置于4℃过夜，用离心机以8000～10000rpm转速离心25～30分钟，去除沉淀，得到含有卵黄免疫球蛋白的卵黄稀释液；卵黄为新鲜的禽类蛋。
2)无机盐沉淀法粗提卵黄免疫球蛋白
将饱和无机盐溶液缓缓倒入步骤1)得到的卵黄稀释液，保持搅拌，直至溶液中无机盐饱和度达到40～50％，溶液置于4℃静置2～3小时，使用离心机以8000～10000rpm转速离心25～30分钟，收集沉淀，得到卵黄免疫球蛋白粗品；无机盐为硫酸铵或硫酸钠。
3)混合模式吸附层析纯化卵黄免疫球蛋白
将步骤2)得到的卵黄免疫球蛋白粗品用平衡缓冲液溶解，0.2μm滤膜过滤后，上样到填充有MEP HyperCel的层析柱，平衡缓冲液冲洗，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，得到卵黄免疫球蛋白溶液；层析所用的平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为8.5～8.9，洗脱液为柠檬酸钠缓冲液，pH值为4.2～4.4。
4)脱盐和干燥
将步骤3)得到的卵黄免疫球蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到95.6～99.8％高纯度的卵黄免疫球蛋白。
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
取新鲜鸡蛋一只，分离得到卵黄，用蒸馏水冲洗卵黄1～2次。用滤纸上吸干卵黄表面的水分，刺破卵黄膜，使卵黄流出。将收集到的卵黄85ml用蒸馏水稀释6倍，用0.1M的HCl溶液和0.1M的NaOH溶液调节pH至5.2，放入4℃冰箱，静置过夜。次日将卵黄稀释液体8000rpm离心30分钟，去除沉淀，得到上清液。将420ml上清液用40％饱和硫酸铵沉淀，溶液置于4℃静置2小时，8000rpm离心30分钟分离得到湿沉淀6.5g，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)溶解至20ml，0.2μm滤膜过滤，取2ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml MEP HyPerCel，平衡缓冲液为50mM tris-HCl缓冲液(pH 8.9)，洗脱液为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到卵黄免疫球蛋白，电泳分析卵黄免疫球蛋白的纯度为99.8％。
实施例2
取新鲜鸡蛋一只，分离得到卵黄，用蒸馏水冲洗卵黄1～2次。用滤纸上吸干卵黄表面的水分，刺破卵黄膜，使卵黄流出。将收集到的卵黄72ml用蒸馏水稀释6倍，用0.1M的HCl溶液和0.1M的NaOH溶液调节pH至5.2，放入4℃冰箱，静置过夜。次日将卵黄稀释液体10000rpm离心30分钟，去除沉淀，得到上清液。将400ml上清液用40％饱和硫酸铵沉淀，溶液置于4℃静置2小时，8000rpm离心30分钟分离得到湿沉淀5.6g，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)溶解至20ml，0.2μm滤膜过滤，取2ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml MEP HyPerCel，平衡缓冲液为50mM tris-HCl缓冲液(pH 8.5)，洗脱液为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到卵黄免疫球蛋白，电泳分析卵黄免疫球蛋白的纯度为95.6％。
实施例3
取新鲜鸡蛋一只，分离得到卵黄，用蒸馏水冲洗卵黄1～2次。用滤纸上吸干卵黄表面的水分，刺破卵黄膜，使卵黄流出。将收集到的卵黄90ml用蒸馏水稀释8倍，用0.1M的HCl溶液和0.1M的NaOH溶液调节pH至5.5，放入4℃冰箱，静置过夜。次日将卵黄稀释液体10000rpm离心25分钟，去除沉淀，得到上清液。将650ml上清液用50％饱和硫酸铵沉淀，溶液置于4℃静置3小时，10000rpm离心25分钟分离得到湿沉淀7.1g，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9)溶解至25ml，0.2μm滤膜过滤，取10ml作为进样样品。层析柱(内径1.6cm)中填充10ml MEP HyPerCel，平衡缓冲液为50mM tris-HCl缓冲液(pH 8.9)，洗脱液为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到卵黄免疫球蛋白，电泳分析卵黄免疫球蛋白的纯度为96.2％。
实施例4
取新鲜鸡蛋一只，分离得到卵黄，用蒸馏水冲洗卵黄1～2次。用滤纸上吸干卵黄表面的水分，刺破卵黄膜，使卵黄流出。将收集到的卵黄96ml用蒸馏水稀释6倍，用0.1M的HCl溶液和0.1M的NaOH溶液调节pH至5.0，放入4℃冰箱，静置过夜。次日将卵黄稀释液体8000rpm离心30分钟，去除沉淀，得到上清液。将460ml上清液用40％饱和硫酸铵沉淀，溶液置于4℃静置2小时，8000rpm离心30分钟分离得到湿沉淀7.4g，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)溶解至25ml，0.2μm滤膜过滤，取2ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml MEP HyPerCel，平衡缓冲液为50mM tris-HCl缓冲液(pH 8.9)，洗脱液为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.4)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到卵黄免疫球蛋白，电泳分析卵黄免疫球蛋白的纯度为96.8％。
实施例5
取卵黄500ml用蒸馏水稀释6倍，用0.1M的HCl溶液和0.1M的NaOH溶液调节pH至5.2，放入4℃冰箱，静置过夜。次日将卵黄稀释液体8000rpm离心30分钟，去除沉淀，得到上清液。将2200ml上清液用40％饱和硫酸铵沉淀，溶液置于4℃静置2小时，8000rpm离心30分钟分离得到湿沉淀38.5g，用50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.9)溶解至125ml，0.2μm滤膜过滤，作为进样样品。层析柱(内径5cm)中填充125ml MEP HyPerCel，平衡缓冲液为50mM tris-HCl缓冲液(pH 8.9)，洗脱液为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到卵黄免疫球蛋白，电泳分析卵黄免疫球蛋白的纯度为99.5％。
实施例6
取卵黄800ml用蒸馏水稀释6倍，用0.1M的HCl溶液和0.1M的NaOH溶液调节pH至5.2，放入4℃冰箱，静置过夜。次日将卵黄稀释液体8000rpm离心30分钟，去除沉淀，得到上清液。将3800ml上清液用40％饱和硫酸铵沉淀，溶液置于4℃静置2小时，8000rpm离心30分钟分离得到湿沉淀60.4g，用50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.9)溶解至200ml，0.2μm滤膜过滤，作为进样样品。层析柱(内径5cm)中填充200ml MEP HyPerCel，平衡缓冲液为50mM tris-HCl缓冲液(pH 8.9)，洗脱液为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到卵黄免疫球蛋白，电泳分析卵黄免疫球蛋白的纯度为99.3％。
Claims (2)
1.一种卵黄免疫球蛋白的提取方法，其特征在于包括如下步骤：
1)水稀释法去除脂类物质
将卵黄用水稀释6～8倍，混匀，保持搅拌，用0.1M HCl和0.1M NaOH溶液调节卵黄稀释液pH到5.0～5.5，置于4℃过夜，用离心机以8000～10000rpm转速离心25～30分钟，去除沉淀，得到含有卵黄免疫球蛋白的卵黄稀释液；
2)无机盐沉淀法粗提卵黄免疫球蛋白
将饱和无机盐溶液缓缓倒入步骤1)得到的卵黄稀释液，保持搅拌，直至溶液中无机盐饱和度达到40～50％，溶液置于4℃静置2～3小时，使用离心机以8000～10000rpm转速离心25～30分钟，收集沉淀，得到卵黄免疫球蛋白粗品；
3)混合模式吸附层析纯化卵黄免疫球蛋白
将步骤2)得到的卵黄免疫球蛋白粗品用平衡缓冲液溶解，0.2μm滤膜过滤后，上样到填充有MEP HyperCel的层析柱，平衡缓冲液冲洗，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，得到卵黄免疫球蛋白溶液；
4)脱盐和干燥
将步骤3)得到的卵黄免疫球蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到95.6～99.8％卵黄免疫球蛋白；
所述的无机盐为硫酸铵或硫酸钠，所述的平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为8.5～8.9，所述的洗脱液为柠檬酸钠缓冲液，pH值为4.2～4.4。
2.根据权利要求1所述的一种卵黄免疫球蛋白的提取方法，其特征在于所述的卵黄来自新鲜的禽类蛋。
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