CN103570829A

CN103570829A - 自卵黄萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法

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Publication number: CN103570829A
Application number: CN201210271561.6A
Authority: CN
Inventors: 王玉麒; 汪宗明
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-08-01
Filing date: 2012-08-01
Publication date: 2014-02-12

Abstract

一种自卵黄萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，包括：(A)提供一缓冲盐类溶液、一卵黄样品及一无机盐类；(B)使用该缓冲盐类溶液稀释该卵黄样品，搅拌一预定时间后，离心以获得一上清液；以及(C)使用该无机盐类对该上清液进行盐析沉淀，以获得一高纯度的γ-卵黄球蛋白；其中，该缓冲盐类溶液的酸碱值(pH)于4.6至5.4的范围内，且该缓冲盐类溶液的浓度于0.05-0.15M的范围内，及该无机盐类的饱和度为30％至60％。

Description

自卵黄萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法

技术领域

本发明系关于一种自卵黄萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，尤其指一种可简单、快速地萃取出高纯度γ-卵黄球蛋白的方法。

背景技术

在脊椎动物的免疫系统遭遇外来特定抗原时，常会诱发体内产生多种辨识该抗原不同表位(epitopes)的抗体分子，这些抗体分子的集合统称为多株抗体(polyclonal antibodies)；由于抗体与其辨识的抗原表位间具有强结合力与高专一性，故常被应用于特定抗原分子的鉴定、分析与纯化等用途。目前于基础研究、一般检验、与医药治疗上，多株抗体已成为不可或缺的工具之一。

由于动物体内被诱发表现的抗体多分布于血液之中，故多株抗体的生产上，通常会选用中、大体型的兔和羊等动物，伴随的缺点在于：饲养动物的空间需求与饲养耗费较高，且哺乳动物彼此间的亲源关系较接近，不适合用来制造哺乳动物的保守性蛋白质(conserved proteins)的抗体。此外，对动物重复进行侵入性抽血的方式是常被动物福利团体争议的行为，因为动物可能会遭受痛苦、较易被感染而造成身体虚弱甚至死亡。

鸡只(Gallus gallus)受到免疫刺激后产生的抗体分子以γ-卵黄球蛋白(γ-livetin，IgY)为主，IgY不仅是鸡血中含量最丰富的抗体分子，也是卵黄中唯一存在的抗体种类；又，鸡只的饲养成本较低，产蛋效率又高，且每颗卵黄的IgY含量可高达约100mg，甚至比鸡血中的IgY浓度更高。此外，相较于哺乳类之间，鸟类与哺乳类有较大的亲缘差距，故成功产生对应哺乳动物保守性蛋白质的抗体的机会较高；又IgY与哺乳类的免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)分子在Fc部位的序列上有显著差异，不会与哺乳类动物的补体、类风湿性因子、及Fc受体等成分发生作用，故可降低分析哺乳动物样品(尤其是人体样品)时的伪阳性反应。因此，利用鸡只卵黄来生产IgY多株抗体不但生产成本较低、产量较高且稳定、可以对应的哺乳动物抗原种类较多元、分析应用时的伪阳性结果较少、更可免去对动物抽血的需求，而减少社会团体的不必要争议。

但由于卵黄中含有丰富的脂质(高达34％)和其他多种蛋白质，使IgY的纯化不易，导致目前IgY的应用仍不够普遍。再者，因IgY与IgG在Fc部位的胺基酸序列差异，也使得广泛应用于纯化IgG的A/G蛋白质管柱并无法被用来吸附分离IgY。现有的卵黄IgY萃取方法，皆以去脂步骤开始，包括水稀法、PEG沉淀法、氯仿沉淀法、胶液沉淀法等；随后再由盐析、或过滤、或离子交换管柱、或特定吸附管柱、或前述方法的不同组合将IgY进一步纯化；过程步骤不仅繁琐且耗时冗长。

因此，目前亟需发展一种简单快速、便宜有效的卵黄IgY分离方法，以获得回收量高且纯度良好的IgY样品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种自卵黄中萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，以简单快速、成本低廉的方法获得回收量高且纯度良好的IgY样品。

为实现上述目的，本发明提供的自卵黄中萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，包括：

A)提供一缓冲盐类溶液、一卵黄样品、及一无机盐类；

B)使用该缓冲盐类溶液稀释该卵黄样品，搅拌一预定时间后，离心以获得一上清液；以及

C)使用该无机盐类对该上清液进行盐析沉淀，以获得一γ-卵黄球蛋白；

其中，该缓冲盐类溶液的pH值为4.6至5.4范围内，且该缓冲盐类溶液的浓度为0.05M至0.15M范围内，及该无机盐类的饱和度为30％至60％。

所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该卵黄样品为鸡蛋的卵黄。

所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该缓冲盐类溶液的浓度为0.08M至0.12M范围内。

所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该缓冲盐类溶液为醋酸系盐类溶液或柠檬酸系盐类溶液。

所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该缓冲盐类溶液为醋酸钠溶液。

所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，于步骤B)中，该缓冲盐类溶液是以8至10倍稀释倍率稀释该卵黄样品。

所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该搅拌的预定时间为25分钟以上。

所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该无机盐类为硫酸铵。

所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该γ-卵黄球蛋白的纯度为50％至95％。

所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该γ-卵黄球蛋白的产率为45％至98％。

所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该卵黄样品为鸡蛋的卵黄；该缓冲盐类溶液的浓度为0.08M至0.12M的范围内；该缓冲盐类溶液为醋酸钠溶液；于步骤(B)中，该缓冲盐类溶液是以8至10倍稀释倍率稀释该卵黄样品；该搅拌的预定时间为25分钟或以上；且该无机盐类为硫酸铵。

本发明的方法不仅步骤最为简单、快速，卵黄IgY的回收率与纯度亦佳，试剂成本更是低廉，且无需使用任何有机溶剂，较符合环保要求。由此，本发明除了可提供至一般实验室的IgY萃取使用外，亦可被应用于产业界的大规模IgY生产目的。

附图说明

图1是本发明实施例1的SDS胶体电泳分析结果图。

图2是本发明实施例2的卵黄粗萃液的外观照片。

图3是本发明实施例2的SDS胶体电泳分析结果图。

图4是本发明实施例3的酸碱值变化结果图。

图5是本发明实施例4的SDS胶体电泳分析结果图。

具体实施方式

本发明提供一种自卵黄中萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，包括：

(A)提供一缓冲盐类溶液、一卵黄样品、及一无机盐类；

(B)使用该缓冲盐类溶液稀释该卵黄样品，搅拌一预定时间后，离心以获得一上清液；以及

(C)使用该无机盐类对该上清液进行盐析沉淀，以获得一纯度提升的γ-卵黄球蛋白样品。

其中，该卵黄样品无特别限制，可视实验所需或材料取得的便利性而选用；较佳可使用鸡蛋的卵黄，其IgY含量高达约100mg，且鸡蛋的取得相当便利。

在本发明的萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法中，该缓冲盐类溶液的浓度是于0.05M至0.15M的范围内，较佳地是于0.08M至0.12M的范围内。再者，该缓冲盐类溶液不受限，可为酸解离常数(pKa)值约为5.0的醋酸系盐类溶液或柠檬酸系盐类溶液；较佳可使用醋酸钠溶液。此外，该缓冲盐类溶液的酸碱值(pH)为4.6至5.4的范围内，可达到最佳的去脂效果。与公知的酸水相比，该缓冲盐类溶液具有较佳的酸碱缓冲效率，可减少去脂作用所需的时间，提升萃取γ-卵黄球蛋白的时效，亦可省去实验期间测量与调整pH的步骤，进而减少电极的去蛋白操作次数以延长其使用寿命。

于步骤(B)中，该缓冲盐类溶液较佳是以8至10倍稀释倍率稀释该卵黄样品，然而此稀释倍率可依其他实验条件而做适当地调整；若稀释倍率过高，后续加工程序繁复，会造成较高的成本耗费。并且，该搅拌的预定时间可为25分钟或以上，即此步骤(B)的搅拌时间最短仅需25分钟，即可完成去脂作用。

此外，该无机盐类可使用如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等公知盐类，较佳可选用硫酸铵；该无机盐类吸引大量水分子与该无机盐类离子水合，使蛋白质表面暴露出来的疏水性区域增加，最后蛋白质彼此间由疏水性作用力而结合，进一步自溶液中沉淀。

在该无机盐类的饱和度为30％至60％的情况下，所获得的该γ-卵黄球蛋白的纯度为50％至95％、产率为45％至98％。由此，使用饱和度近30％的该无机盐类进行盐析沉淀时，所获得的该γ-卵黄球蛋白的纯度较高(约95％)、产率适中(约45％)；反之，使用饱和度近60％的该无机盐类进行盐析沉淀时，所获得的该γ-卵黄球蛋白的纯度适中(约50％)、产率较高(约98％)。故各实验室可依据γ-卵黄球蛋白的后续用途而适当地选择该无机盐类的饱和度，例如若需在短时效内快速获得高纯度的IgY样品，则可选择30％饱和度的硫酸铵添加量；若后续需要由抗原管柱来进一步纯化专一的IgY抗体，则可选择60％饱和度的硫酸铵先沉淀大部分的IgY，再进行后续专一性抗体的纯化。

由此，在本发明的萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法中，可使用浓度于0.08M至0.12M的范围内、且酸碱值(pH)于4.6至5.4的范围内的醋酸钠溶液，以8至10倍稀释倍率稀释鸡蛋的卵黄，搅拌至少25分钟后，离心以获得一上清液；再使用饱和度系为30％至60％的硫酸铵对该上清液进行盐析沉淀，以获得纯度为50％至95％、产率为45％至98％的γ-卵黄球蛋白。

与公知技术相比，现今最常用的PEG沉淀法或水稀法，均需搭配其他多重的步骤，并且耗时冗长，才能获得纯度及产率可与使用本发明方法所得的γ-卵黄球蛋白相比拟的γ-卵黄球蛋白；近期发展较快速方法是以含果胶(gum pectin)、卡拉胶(κ-carrageenan)和氯化钙(CaCl₂)的溶液进行卵黄的去脂作用，再搭配两次不同饱和度的硫酸铵沉淀步骤，可于5小时内从1颗卵黄中分离得到60mg、纯度达80％的IgY样品，且试剂花费仅需约5美元。然而，本发明的萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法为一仅有两步骤的萃取方法，先以醋酸钠溶液进行卵黄的去脂作用，再由硫酸铵盐析沉淀IgY样品，完成萃取仅需约两小时，即可从卵黄中分离得到高纯度及高产率的IgY，比已知技术更加快速，并且试剂花费估计仅为1.5美元。

以下实施例使用的鸡蛋来源为实验室自行饲养的白色莱亨蛋用鸡(White Leghorn laying hens)。敲破蛋壳，将分离的卵黄置于不锈钢滤网中，再将滤网浸入去离子水中，以洗去卵黄表面残留的蛋白液；随后以纸巾从滤网外侧将多余的水分吸干，再用解剖针搓破卵黄膜，并以量筒收集卵黄液。以下实施例使用的鸡蛋其卵黄液体积约为13至15mL。

以下实施例使用的统计分析，对两两比较的实验结果，是以Student’sT-test来分析其是否具显著差异；对多组比较的实验结果，则是以单因子变异数分析(ANOVA)来检测组间的差异性，并以p＜0.05做为显著的标准。

[实施例1-粗萃取卵黄IgY的搅拌时间测试]

[卵黄IgY的粗萃取]

取定量体积的卵黄液，加入9倍体积的0.1M，pH5.0的醋酸钠溶液，混合均匀后，置于4℃中以四种不同搅拌时间(0.5h、1h、3h、6h)搅拌，接着以12,000×g，4℃离心30分钟，而收集到的上清液即为卵黄的粗萃液(crude extract)，量测体积后，加入NaN₃至最终浓度为0.02％(w/v)，并保存于4℃中供后续分析使用。

[IgY的定量分析]

以酵素连结免疫吸附法(enzyme-linked immuno-sorbent assay；ELISA)来测定分析样品中的IgY含量。首先将IgY标准品(Jackson，003-000-003)与待测样品分别以0.2M硼酸盐进行一系列稀释，再各取50μL分注至ELISA盘(Costar EW-01959-20)的样品孔中，经6h(室温)或隔夜(4℃)的吸附作用后，以洗涤缓冲液(wash buffer)冲洗三次，再加入180μL封闭缓冲液(blocking buffer)，并于室温下反应两小时或于4℃中隔夜反应；之后，以洗涤缓冲液冲洗三次，并于各孔加入50μL兔子抗鸡IgY(rabbitanti-chicken IgY，Jackson 303-005-003；1μg/ml)，在室温下反应2h后，以洗涤缓冲液冲洗三次，再于各孔中加入50μL山羊抗兔子抗体-碱性磷酸酶(goat anti-rabbit antibody-alkaline phosphatase，Sigma A3687；使用10,000倍稀释液)，随后于室温下反应两小时，以洗涤缓冲液冲洗三次，各孔分别加入50μL pNPP受质以进行30至60分钟的呈色反应，最后以酵素免疫分析测读仪(ELISA reader，BIO-TEK MQX220)测定吸光值(OD_405-490)。利用系列稀释的IgY标准品读值，推估待测样品的IgY含量。

[蛋白质定量]

由Bradford测定法来估测分析样品中的蛋白质含量，并以牛血清白蛋白(BSA，Sigma A7906)做为蛋白质标准品。先将BSA(2mg/mL)与待测样品进行系列稀释，并各取50μL分别加注于96孔盘中，随后各孔加入200μLBradford试剂，静置十分钟后，以酵素免疫分析测读仪(ELISA reader，BIO-TEK MQX220)测定OD₅₉₅的读值。取BSA系列稀释样品的读值做一标准曲线，用以估算待测样品的蛋白质浓度。

如下表一所示，四种不同搅拌时间(0.5h、1h、3h、6h)的处理下，每毫升卵黄所能萃得的IgY含量(6.0～7.2mg)及蛋白质含量(21.7～24.9mg)，经ANOVA分析后(p＞0.05)并无统计上的差异，表示仅需0.5小时就足够完成去脂程序。

表一

搅拌时间	0.5h	1h	3h	6h
					IgY(mg)/mL卵黄	6.9±2.0	7.2±1.7	7.2±1.8	6.0±1.1
蛋白质(mg)/mL卵黄	24.9±1.1	22.7±0.9	21.7±1.6	23.1±1.4

[SDS胶体电泳分析(Sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis；SDS-PAGE)]

各取8μg蛋白质，以4％焦集胶体(stacking gel)、12％分离胶体(separating gel)进行SDS-PAGE分析，电泳的条件为固定120V约2.5h。电泳后，将胶片取下摇荡浸泡于CBB染剂中1小时以上，随后以一级褪染液褪染10至20分钟，再以二级褪染液褪染至胶片上的蛋白质色带清晰可见且背景透明为止。

如图1所示，图右箭头分别标记IgY的H链(70kDa)及L链(26kDa)位置，MW为蛋白质分子量标准品(Bioman，PL01425)；四种不同搅拌时间样品中的蛋白质种类与个别含量亦无明显不同。此一结果显示，在以醋酸钠溶液为卵黄的萃取试剂时，0.5h的低温搅拌时间即可达到充分的萃取效果。

[实施例2-pH值对卵黄IgY的萃取效果]

配制pH值为4.2、4.6、5.0、及5.4的四种0.1M醋酸钠溶液，再分别用以进行与实施例1中[卵黄IgY的粗萃取]相同的过程，其中搅拌时间为30分钟。经离心处理后，如图2所示，四种不同pH条件的卵黄粗萃液在外观上有明显差异：pH 4.2的粗萃液最为黄浊，其次为pH 5.4的粗萃液，而pH 5.0的粗萃液则相对最为清澈。由于卵黄萃取液的黄浊颜色主要受非水溶性脂质含量的影响，故可推知醋酸钠溶液的去脂效果是呈pH依赖现象(pHdependent)。

另外，将上述四种不同pH条件的卵黄粗萃液，进行与实施例1中[IgY的定量分析]及[蛋白质定量]相同的分析。如下表二所示，四种卵黄粗萃液之间的IgY含量并无显著不同(每10mL粗萃液的IgY含量为8.7～9.2mg)，但蛋白质含量则有明显差异，并似乎与粗萃液的浊度成正相关：每10mL最黄浊的粗萃液(pH 4.2)中，蛋白质含量约为63mg；同体积最清澈的粗萃液(pH 5.0)中，蛋白质含量则仅约为27.6mg。若以IgY含量与蛋白质含量的比值来代表为萃取样品的IgY纯度，则四种不同pH条件的粗萃液中，IgY的纯度依序为32.6％(pH 5.0)、30.6％(pH 4.6)、21.6％(pH 5.4)、和14.7％(pH 4.2)；统计分析的结果显示，前两者(pH 5.0和pH 4.6)的纯度并无明显不同，但其与后两者(pH 5.4和pH 4.2)之间则有显著差异。

表二

醋酸钠液溶液	pH 4.2	pH 4.6	pH 5.0	pH 5.4
					IgY(mg)/mL卵黄	9.2±0.7	8.7±1.8	9.2±1.1	8.7±1.9
蛋白质(mg)/mL卵黄	63.6±2.2	26.4±0.6	27.6±2.5	39.3±0.7
					IgY纯度(％)	14.7±1.1	30.6±6.0	32.6±2.5	21.6±5.1

接着，将上述四种不同pH条件的卵黄粗萃液进行与实施例1[SDS胶体电泳分析]相同的分析，其中各组蛋白质取12μg，标准样品系取3μg。结果如图3所示，「S」表示IgY的标准样品，图右的箭头指示IgY的H链(70kDa)及L链(26kDa)位置；在等蛋白质量的基准下，pH 4.2的粗萃液中，蛋白质的种类明显最多，根据H链及L链的染色密度可知IgY的含量也相对较少；而在pH 5.0与pH 4.6的粗萃液中，蛋白质的种类则较少，IgY的含量也较高，此结果与表二的结果一致。

[实施例3-卵黄粗萃液的pH值变化]

为要探讨何以使用醋酸钠溶液可较常用的酸水具有更高的卵黄IgY萃取效率，本实验设计共分成3组：第一组取定量卵黄，加入9倍体积的0.1M醋酸钠溶液(pH 5.0)，稀释样品的初始pH值为5.1(醋酸钠稀释组)；第二组取与第一组同量的卵黄，并加入9倍体积的二次水，稀释样品的初始pH值为6.2，然后立即加入少量0.1N HCl(＜2％总体积)使其pH值调整为5.0(酸水稀释组)；第三组为单纯二次水，并加入少量0.1N HCl使其pH值调整为5(酸水对照组)。三组样品完成制备后，移入4℃中进行搅拌，并随时间进展检测其酸碱值的变化情形。

结果如图4所示，在6小时的搅拌期间内，「醋酸钠稀释组」样品的pH值恒定维持在5.1范围；「酸水稀释组」样品的pH值则是逐渐上升至5.4；而「酸水对照组」的pH值则于搅拌初期(经搅拌1小时)即迅速下降至4.4，而后维持于该pH值范围内。

「酸水对照组」的pH值于搅拌期间迅速下降(5.0→4.4)，应与空气中的二氧化碳溶入有关；而两组蛋黄稀释液样品的pH值不降反升(其中「醋酸钠稀释组」，5.0→5.1；及「酸水稀释组」，5.0→5.4)，则说明蛋黄脂质的堆聚过程会消耗稀释液中的氢离子。由于醋酸钠溶液具有酸碱缓冲的功效，能补充被耗去的氢离子，故除了反应初期可能因可堆聚的脂质量最高，致使醋酸钠稀释液的pH值些许上升(5.0→5.1)，随后该样品则能恒定维持在5.1范围。另一方面，由于酸水不具酸碱缓冲的效果，无法适切补充被耗去的氢离子，因此随着蛋黄脂质堆聚过程进行，酸水稀释液样品的酸碱值也逐渐持续上升。

萃取蛋黄IgY时的去脂作用属于pH-dependent的反应，并且仅有狭窄的适用pH范围。本发明证实在萃取蛋黄IgY的去脂过程中，会消耗稀释液中的氢离子。由于醋酸钠溶液的pH缓冲效应，能较稳定维持去脂反应所需的pH范围，故可有较快、较佳的去脂效果；反之，酸水因无维持适当pH范围的效果，因此随着pH值的上升，去脂效果渐差，故需更长的作用时间才能达到充足的去脂效果。

[实施例4-卵黄粗萃液的硫酸铵盐析沉淀测试]

[卵黄IgY的硫酸铵盐析沉淀]

取四等份卵黄粗萃液(各10mL)，分别添加硫酸铵(ammonium sulfate；Merk 1.01217)至30％、40％、50％、和60％四种不同饱和程度，经4℃中搅拌30分钟，接着以12,000×g，4℃离心30分钟，再分别以1mL PBS溶液回溶沉淀(pellet)，进行与实施例1中[IgY的定量分析]及[蛋白质定量]相同的分析。

如下表三的结果显示，卵黄粗萃液中的硫酸铵饱和程度越高，蛋白质及IgY的沉淀量亦随之增加：在30％饱和度的条件下，每10mL卵黄粗萃取液可沉淀出4.9mg蛋白质，其中4.4mg为IgY；在60％饱和度的条件下，同体积的卵黄粗萃取液则可沉淀出16.9mg蛋白质，包含8.9mg IgY。此一结果显示在不同硫酸铵饱和度的条件下，蛋白质与IgY的沉淀量并非以等比例的形式变化，故硫酸铵的添加量除了会影响IgY的回收率之外，亦会影响各回收样品的IgY纯度(IgY/total protein)：在30％硫酸铵的饱和度条件下，IgY的回收率虽只有48％，但纯度却高达近90％；在60％硫酸铵饱和度的条件下，IgY的回收率虽可高达96％，但纯度则减至53％。

表三

接着，将上述四种不同硫酸铵饱和度的盐析沉淀样品进行与实施例1[SDS胶体电泳分析]相同的分析，其中各组蛋白质取3μg，结果如图5所示，「S」表示IgY的标准品(Jackson，003-000-003)，图右的箭头标示卵黄中各特定蛋白质的位置，MW为蛋白质分子量标准品；可见30％饱和度的沉淀样品其IgY纯度最高，仅含有些许β-卵黄球蛋白及Δ血清白蛋白，随着硫酸铵饱和度的增加，沉淀的蛋白质种类亦随之增多，而IgY的纯度则随之递减，此一结果与表三的结果一致。

据此，醋酸钠溶液(0.1M；pH 5.0)具有良好的卵黄去脂效果，相较于常见的酸水稀释法需要作用5.5h或更久时间，醋酸钠溶液仅需反应0.5h即可分离得到IgY含量超过30％的粗萃液，因此，仅需进行本发明萃取方法的粗萃步骤，所得的IgY含量即已足够直接使用于多种免疫化学试验，如西方墨点法(Western Blot)、酵素连结免疫吸附法(ELISA)等。进一步的盐析沉淀结果则显示，粗萃液中分别添加硫酸铵至30％、40％、50、和60％饱和度时，IgY的沉淀回收率为48％、69％、90％、及96％，而回收样品的IgY纯度则分别为90％、83％、66％、及53％，此项结果可做为参考，供各实验室依后续用途对IgY产率和纯度的要求，而选择沉淀IgY的适当硫酸铵添加量。

上述实施例仅为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利范围自应以申请的权利要求范围所述为准，而非仅限于上述实施例。

Claims

1.一种自卵黄中萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，包括：

A)提供一缓冲盐类溶液、一卵黄样品、及一无机盐类；

2.如权利要求1所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该卵黄样品为鸡蛋的卵黄。

3.如权利要求1所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该缓冲盐类溶液的浓度为0.08M至0.12M范围内。

4.如权利要求1所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该缓冲盐类溶液为醋酸系盐类溶液或柠檬酸系盐类溶液。

5.如权利要求4所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该缓冲盐类溶液为醋酸钠溶液。

6.如权利要求5所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，于步骤B)中，该缓冲盐类溶液是以8至10倍稀释倍率稀释该卵黄样品。

7.如权利要求1所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该搅拌的预定时间为25分钟以上。

8.如权利要求1所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该无机盐类为硫酸铵。

9.如权利要求1所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该γ-卵黄球蛋白的纯度为50％至95％。

10.如权利要求1所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该γ-卵黄球蛋白的产率为45％至98％。

11.如权利要求1所述萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该卵黄样品为鸡蛋的卵黄；该缓冲盐类溶液的浓度为0.08M至0.12M范围内；该缓冲盐类溶液为醋酸钠溶液；于步骤(B)中，该缓冲盐类溶液是以8至10倍稀释倍率稀释该卵黄样品；该搅拌的预定时间为25分钟或以上；且该无机盐类为硫酸铵。