CN102411051A - 有机磷农药多残留的免疫检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种农药检测技术领域的有机磷农药多残留的免疫检测方法，包括如下步骤：合成有机磷通用半抗原，并与蛋白偶联制备免疫原与包被原；用免疫原进行动物免疫，得到有机磷农药通用抗体；合成Fe3O4磁性纳米粒子，并进行表面修饰；将表面修饰后的Fe3O4磁性纳米粒子与有机磷农药通用抗体偶联，形成免疫磁珠；在试纸条的底板上加上硝酸纤维素膜，将有机磷通用半抗原与蛋白偶联制备免疫原包被在膜上，封闭后成为检测部分，确定最佳包被、封闭条件以及免疫磁珠的用量；进行定性和半定量检测。本检测方法操作简便、灵敏、快速、不需要大型仪器，适合现场抽样检测以及大批量的检测任务。
Description
技术领域
本发明涉及一种农药检测技术领域的方法，具体涉及一种有机磷农药多残留的免疫检测方法。
背景技术
有机磷杀虫剂以其杀虫谱广、残效期较短、价格低廉而被广泛应用，农药使用不当，使得有机磷农药残留成为我国食品中农药残留的重要问题。目前，对该类农药的检测方法主要有气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法（CE）等，这些检测技术相对成熟，灵敏度高，但是需要昂贵的仪器、测试时间长且需要专业的技术人员，不适合大规模、快速化的检测。近年来，各国都在研究快速的有机磷多残留检测方法，目前应用最广的是酶联免疫分析方法，利用抗原与抗体反应的特异性，酶催化的高效与方法作用，使得其成为一种新型快速检测方法。
磁性纳米粒子是近年来发展起来的一种新型材料，由于其具有超顺磁性、大比表面积以及良好的生物相容性等特性而被广泛地应用在生物、医学等领域，目前研究和应用最多的是Fe3O4等铁的氧化物。免疫磁珠合成技术，是指利用共沉淀法制备Fe3O4并以此作为核，通过在核的表面修饰不同的功能化基团如：-OH、-COOH、-NH2等，使其与某些生物活性物质结合（如抗原、抗体、酶等）形成新的复合物。合成的免疫磁珠不但具有磁性，容易在外磁场的作用下分离，而且具有生物活性，可广泛应用于细胞分离和提纯、免疫检测、核酸分析和基因工程、作为靶向释药的载体等领域。
基于磁性纳米粒子的试纸条检测技术指将免疫磁珠应用到传统的试纸条检测中，以纤维素膜为载体，将有机磷通用抗原包被在膜上，封闭后分别滴加样品和免疫磁珠，最后通过膜上的颜色来判断实验结果，实现定性和半定量检测目的。
经检索文献发现，中国专利《快速检测有机磷农药残留的鱼酯酶试剂（公开号：CN1396267）》、《残留有机磷农药快速测试盒及制造方法（公开号：CN1293363）》、《一种能检测各种农产品中有机磷和氨基甲酸酯农药残留的速测卡（公开号：CN101140236）》、《一种检测有机磷农药残留试纸的制备及其使用方法（公开号：CN101299029）》，其原理均基于有机磷农药对动植物体内的某些酶有抑制作用，通过酶的底物的水解程度（显色程度）来判断有机磷农药的残留程度，这些方法的不足之处在于：1、容易出现假阳性现象，检测特异性不强；2、提取生物酶的过程相对繁琐，且生物酶易受温度等因素的影响。专利文献《一种检测有机磷农药的免疫胶体金测试条及其制备方法（公开号：CN101042405）》中披露的技术方案提高了检测特异性，但是试纸条制备步骤仍然很复杂，且只能定性的通过颜色深浅来判断结果。
发明内容
本发明的目的是针对目前传统有机磷农药多残留检测中存在的不足，提供一种有机
磷农药多残留的免疫检测方法。本检测方法操作简便、灵敏、快速、不需要大型仪器，适合现场抽样检测以及大批量的检测任务。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现，本发明的有机磷农药多残留的免疫检测方法包括如下步骤：
步骤一，设计及合成有机磷通用半抗原，并与蛋白偶联制备免疫原与包被原；
步骤二，用上述制备的免疫原进行动物免疫，得到有机磷农药通用抗体；
步骤三，通过化学方法合成Fe3O4磁性纳米粒子，并进行表面修饰；
步骤四，将表面修饰后的Fe3O4磁性纳米粒子与有机磷农药通用抗体偶联，并与胶体金结合，得到免疫磁珠；
步骤五，在试纸条的底板上加上硝酸纤维素膜，将有机磷通用半抗原与蛋白偶联制备免疫原包被在膜上，封闭后成为检测部分，确定最佳包被、封闭条件以及金标免疫磁珠的用量；
步骤六，利用免疫磁珠以及第五步中装配的检测试纸条对样品进行检测，获得定性结果和定量结果。
优选地，步骤一中，所述有机磷通用半抗原分别与牛血清白蛋白和鸡卵清白蛋白偶联，得到免疫原与包被原。
优选地，步骤二中，所述动物为小白鼠或新西兰大白兔。
优选地，步骤三中，所述化学方法为共沉淀法，所述表面修饰为用3-氨丙基三乙氧基硅烷对Fe3O4磁性纳米粒子进行表面氨基硅烷化修饰。
优选地，步骤四中，所述形成免疫磁珠具体为：将表面修饰后的Fe3O4磁性纳米粒子分散在乙醇溶液中，用戊二醛法将其与制备得到的有机磷农药通用抗体偶联，磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，得到免疫磁珠。
本发明的方法利用磁性纳米粒子的大比表面积以及易磁性分离的特点，对磁性纳米粒子表面进行氨基硅烷化修饰，通过戊二醛偶联有机磷农药通用抗体，在外磁场作用下，分离得到免疫磁珠；采用直接竞争免疫分析方法，在试纸条的检测部分包被有机磷农药通用抗原，随后分别加入样品和免疫磁珠，利用颜色判断样品中有机磷农药的存在。
本发明与传统的胶体金试纸条检测技术相比，具有如下优点：1、磁性纳米粒子的制备成本低廉；2、试纸条的制作更为简单，省略了样品垫、吸水垫和金标垫，成本更低，装配更加简单；3、磁性纳米粒子其大比表面积可以吸附更多的抗体，达到一个信号放大的作用，检测灵敏度提高；4、制得的免疫磁珠在外磁场的作用下容易分离，纯化；5、本检测方法操作简便、灵敏、快速、不需要大型仪器，适合现场抽样检测以及大批量的检测任务。
附图说明
图1为有机磷农药通用免疫原及包被原的合成的路线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
一、有机磷农药通用免疫原及包被原的合成
在O,O-二乙基硫代磷酰氯分子结构上引入氨基酸后，即可得到含有羧基团的通用半抗原DENP，利用羧基与蛋白质中氨基的结合反应，将通用半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原及包被原，合成路线如图1所示。
具体步骤如下：取52mg DENP（0.2mmol）溶于3mL无水DMF，加入46mg NHS（0.4mmol），78mg EDC（0.4mmol）。室温（10℃）搅拌反应过夜。取133mg 牛血清白蛋白（BSA）溶于15mL硼酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH8.7），然后将活化半抗原溶液加入BSA溶液中，使半抗原与BSA的摩尔比约为100：1。室温（10℃）反应2h后，于4℃反应过夜。用蒸馏水透析3天，每天换水3次，然后将人工抗原分装保存于-20℃，此即免疫原DENP-BSA。将DENP偶联鸡卵清白蛋白（OVA）得包被原，方法同上。
二、有机磷农药通用抗体的制备
初次免疫时，将免疫原与弗氏完全佐剂混合，在新西兰大白兔背部进行皮下多点注射，两周后换用弗氏不完全佐剂进行免疫，之后每隔两周进行基础免疫1次，并在基础免疫7天后采血，用ELISA法测抗血清的效价。待血清抗体达到一定效价后进行最后一次加强免疫，并在7天后，采用心脏采血，分离提纯血清，-20℃保存备用。
三、Fe
3
O
4
磁性纳米粒子的制备及表面氨基化
采用共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子，分别取5.2g FeCl3·6H2O、2.7969 g FeSO4·7H2O、0.85 mL 12.1 mol/L的浓盐酸溶解于200 mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250 mL、0.75 mol/L NaOH溶液。所有反应在80℃、搅拌、隔绝空气条件下进行。随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀。反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，先后用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5 g/mL的Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液。
取25mL Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，加入1mL水，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30 min。滴加0.4mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），室温下搅拌7 h。反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe3O4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5 mg/mL的氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液。
四、免疫磁珠的制备
取0.5mL氨基化Fe3O4磁性纳米粒子的无水乙醇溶液，用1mL PBS清洗3次，磁分离器弃上清液。加入5%（体积分数）戊二醛溶液2 mL，室温振荡交联2 h，磁分离，弃上清液。用PBS洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5mL不同稀释度的抗体包被氨基化Fe3O4磁性纳米粒子，室温下振荡固定2h。磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，得到具有最佳吸附量的免疫磁珠。
取制备好的10mL胶体金溶液于50mL烧杯中，用0.2 mol/L的K2CO3溶液调节pH至8.0。在磁力搅拌器上边搅拌边缓慢加入适量上述方法制备的免疫磁珠，搅拌30 min后加入10% BSA至终浓度1%，继续搅拌30 min，转移烧杯于4℃环境静置2 h。然后4℃ 1500 rpm离心20 min，弃沉淀，再10000 rpm离心60 min，弃上清，沉淀用PBS重悬至原体积，重复以上步骤2次，最后沉淀重悬于1/10体积的PBS里，4℃保存备用。
五、简易磁珠试纸条的制备
第一步，包被原吸附于硝酸纤维素膜上条件摸索，确定最佳包被原稀释度、包被温度和包被时间。具体设计如下：
在37℃条件下用稀释度为1:1，1:10，1:20，1:50，1:100的DENP-OVA，按照10μL/cm2用量包被反应10min，然后用蒸馏水洗净，再用1% 脱脂奶-PB溶液37℃封闭10min后洗净晾干，与500μL稀释后的免疫磁珠溶液37℃反应20 min，比较几个NC膜的颜色，确定最佳包被原稀释度。
采用最佳包被稀释度，设置包被温度为4℃、20℃和37℃，其他条件不变，比较NC膜的颜色，确定最佳包被温度。
采用最佳包被稀释度和最佳包被温度，设置包被时间为1、5、10、15和20 min，其他条件不变，比较NC膜的颜色，确定最佳包被时间。
第二步，硝酸纤维素膜的封闭条件摸索，确定最佳封闭液浓度，封闭时间和温度。具体设计如下：
选用脱脂奶-PB缓冲液为封闭液，试验选取0、0.1%、0.5%、1%和2% 五个浓度的脱脂奶-PB缓冲液分别封闭已包被的NC膜，包被条件采用第一步中的结果，确定最佳封闭液浓度。
采用最佳封闭液浓度，设置封闭温度为4℃、20℃和37℃，其他条件不变，比较NC膜的颜色，确定最佳封闭温度。
采用最佳封闭液浓度和最佳封闭温度，设置封闭时间为1、5、10、15和20 min，其他条件不变，比较NC膜的颜色，确定最佳封闭时间。
第三步，免疫磁珠与NC膜反应条件摸索，确定免疫磁珠最佳稀释度，反应温度和反应时间，具体设计如下：
采用最佳包被条件和封闭条件，试验选取稀释度为1:1，1:2，1:5，1:10和1:20的免疫磁珠溶液500μL与包被并封闭后的NC膜反应，37℃下反应20 min。比较NC膜的颜色，确定免疫磁珠的最佳稀释度。
采用免疫磁珠的最佳稀释度，设置反应温度为4℃、20℃和37℃，其他条件不变，比较NC膜的颜色，确定最佳反应温度。
采用免疫磁珠的最佳稀释度和最佳反应温度，设置反应时间为1、5、10、15和20 min，其他条件不变，比较NC膜的颜色，确定最佳反应时间。
第四步，试纸条的组装
试纸条依上述得出的最适条件制备：取PVC底板，裁剪成1cm×5cm大小，一端揭开1cm×1cm大小的粘面，粘贴包被有DENP-OVA并封闭后的NC膜，即为磁性纳米粒子的有机磷农药简易试纸条。
六、比色卡的制作及样品检测
取5个装有500μL免疫磁珠溶液的离心管，将浓度为0、20、50、100、200 μg/mL毒死蜱（100μL）分别加入离心管，同时插入组装好的试纸条，反应10min，根据不同浓度下试纸条的显色程度差异，制作比色卡。用于样品的半定量检测。
取装有500μL免疫磁珠溶液的离心管，加入100μL待测样品提取液，同时插入试纸条，反应10min，观察试纸条的显色结果，不显色为阳性样品，否则为阴性样品。对照比色卡，试纸条颜色越浅，样品中有机磷农药含量越高。
实施例2
一、有机磷农药通用免疫原及包被原的合成
在O,O-二乙基硫代磷酰氯分子结构上引入氨基酸后，即可得到含有羧基团的通用半抗原DENP，利用羧基与蛋白质中氨基的结合反应，将通用半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原及包被原，合成路线如图1所示。
具体步骤如下：取52mg DENP（0.2mmol）溶于3mL无水DMF，加入46mg NHS（0.4mmol），78mg EDC（0.4mmol）。室温（10℃）搅拌反应过夜。取133mg 牛血清白蛋白（BSA）溶于15mL硼酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH8.7），然后将活化半抗原溶液加入BSA溶液中，使半抗原与BSA的摩尔比约为100：1。室温（10℃）反应2h后，于4℃反应过夜。用蒸馏水透析3天，每天换水3次，然后将人工抗原分装保存于-20℃，此即免疫原DENP-BSA。将DENP偶联鸡卵清白蛋白（OVA）得包被原，方法同上。
二、有机磷农药通用抗体的制备
初次免疫时，将免疫原与弗氏完全佐剂混合，对小白鼠进行腹部皮下注射，两周后换用弗氏不完全佐剂进行免疫，之后每隔两周进行基础免疫1次，并在基础免疫7天后采血，用ELISA法测抗血清的效价。待血清抗体达到一定效价后进行最后一次加强免疫，通过手术取小鼠脾细胞并与骨髓瘤细胞杂交，筛选出能稳定分泌有机磷农药通用单克隆抗体的细胞株，将其注入小鼠腹腔，取小鼠腹水制备单克隆抗体。
三、Fe
3
O
4
磁性纳米粒子的制备及表面氨基化
采用共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子，分别取5.2 g FeCl3·6H2O、2.7969 g FeSO4·7H2O、0.85mL 12.1 mol/L的浓盐酸溶解于200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250 mL、0.75 mol/L NaOH溶液。所有反应在80 ℃、搅拌、隔绝空气条件下进行。随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀。反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，先后用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5 g/mL的Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液。
取25 mL Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，加入1mL水，再用无水乙醇稀释到150 mL，超声振荡30 min。滴加0.4mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），室温下搅拌7 h。反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe3O4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5 mg/mL的氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液。
四、免疫磁珠的制备
取0.5mL氨基化Fe3O4磁性纳米粒子的无水乙醇溶液，用1mL PBS清洗3次，磁分离器弃上清液。加入5%（体积分数）戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2 h，磁分离，弃上清液。用PBS洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5mL不同稀释度的抗体包被氨基化Fe3O4磁性纳米粒子，室温下振荡固定2 h。磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，得到具有最佳吸附量的免疫磁珠。
取制备好的10 mL胶体金溶液于50 mL烧杯中，用0.2 mol/L的K2CO3溶液调节pH至8.0。在磁力搅拌器上边搅拌边缓慢加入适量上述方法制备的免疫磁珠，搅拌30 min后加入10% BSA至终浓度1%，继续搅拌30 min，转移烧杯于4℃环境静置2 h。然后4℃1500 rpm离心20 min，弃沉淀，再10000 rpm离心60 min，弃上清，沉淀用PBS重悬至原体积，重复以上步骤2次，最后沉淀重悬于1/10体积的PBS里，4℃保存备用。
五、简易磁珠试纸条的制备
第一步，包被原吸附于硝酸纤维素膜上条件摸索，确定最佳包被原稀释度、包被温度和包被时间。具体设计如下：
在37℃条件下用稀释度为1:1，1:10，1:20，1:50，1:100的DENP-OVA，按照10μL/cm2用量包被反应10min，然后用蒸馏水洗净，再用1% 脱脂奶-PB溶液37℃封闭10min后洗净晾干，与500μL稀释后的免疫磁珠溶液37℃反应20 min，比较几个NC膜的颜色，确定最佳包被原稀释度。
采用最佳包被稀释度，设置包被温度为4℃、20℃和37℃，其他条件不变，比较NC膜的颜色，确定最佳包被温度。
采用最佳包被稀释度和最佳包被温度，设置包被时间为1、5、10、15和20 min，其他条件不变，比较NC膜的颜色，确定最佳包被时间。
第二步，硝酸纤维素膜的封闭条件摸索，确定最佳封闭液浓度，封闭时间和温度。具体设计如下：
选用脱脂奶-PB缓冲液为封闭液，试验选取0、0.1%、0.5%、1%和2% 五个浓度的脱脂奶-PB缓冲液分别封闭已包被的NC膜，包被条件采用第一步中的结果，确定最佳封闭液浓度。
采用最佳封闭液浓度，设置封闭温度为4℃、20℃和37℃，其他条件不变，比较NC膜的颜色，确定最佳封闭温度。
采用最佳封闭液浓度和最佳封闭温度，设置封闭时间为1、5、10、15和20 min，其他条件不变，比较NC膜的颜色，确定最佳封闭时间。
第三步，免疫磁珠与NC膜反应条件摸索，确定免疫磁珠最佳稀释度，反应温度和反应时间，具体设计如下：
采用最佳包被条件和封闭条件，试验选取稀释度为1:1，1:2，1:5，1:10和1:20的免疫磁珠溶液500μL与包被并封闭后的NC膜反应，37℃下反应20 min。比较NC膜的颜色，确定免疫磁珠最佳稀释度。
采用免疫磁珠最佳稀释度，设置反应温度为4℃、20℃和37℃，其他条件不变，比较NC膜的颜色，确定最佳反应温度。
采用免疫磁珠最佳稀释度和最佳反应温度，设置反应时间为1、5、10、15和20 min，其他条件不变，比较NC膜的颜色，确定最佳反应时间。
第四步，试纸条的组装
试纸条依上述得出的最适条件制备：取PVC底板，裁剪成1cm×5cm大小，一端揭开1cm×1cm大小的粘面，粘贴包被有DENP-OVA并封闭后的NC膜，即为磁性纳米粒子的有机磷农药简易试纸条。
六、比色卡的制作及样品检测
取5个装有500μL免疫磁珠溶液的离心管，将浓度为0、20、50、100、200 μg/mL毒死蜱（100μL）分别加入离心管，同时插入组装好的试纸条，反应10min，根据不同浓度下试纸条的显色程度差异，制作比色卡。用于样品的半定量检测。
取装有500μL免疫磁珠溶液的离心管，加入100μL待测样品提取液，同时插入试纸条，反应10min，观察试纸条的显色结果，不显色为阳性样品，否则为阴性样品。对照比色卡，试纸条颜色越浅，样品中有机磷农药含量越高。
综上所述，本发明的方法利用磁性纳米粒子的大比表面积以及易磁性分离的特点，对磁性纳米粒子表面进行氨基硅烷化修饰，通过戊二醛偶联有机磷农药通用抗体，在外磁场作用下，分离得到免疫磁珠；采用直接竞争免疫分析方法，在试纸条的检测部分包被有机磷农药通用抗原，随后分别加入样品和免疫磁珠，利用磁性纳米粒子的颜色判断样品中有机磷农药的存在。本检测方法操作简便、灵敏、快速、不需要大型仪器，适合现场抽样检测以及大批量的检测任务。
Claims (5)
1.一种有机磷农药多残留的免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，设计及合成有机磷通用半抗原，并与蛋白偶联制备免疫原与包被原；
步骤二，用上述制备的免疫原进行动物免疫，得到有机磷农药通用抗体；
步骤三，通过化学方法合成Fe3O4磁性纳米粒子，并进行表面修饰；
步骤四，将表面修饰后的Fe3O4磁性纳米粒子与有机磷农药通用抗体偶联，形成免疫磁珠；
步骤五，在试纸条的底板上加上硝酸纤维素膜，将有机磷通用半抗原与蛋白偶联制备免疫原包被在膜上，封闭后成为检测部分，确定最佳包被、封闭条件以及免疫磁珠的用量；
步骤六，利用免疫磁珠以及第五步中装配的检测试纸条对样品进行检测，获得定性结果和定量结果。
2.根据权利要求1所述的有机磷农药多残留的免疫检测方法，其特征在于，步骤一中，所述有机磷通用半抗原分别与牛血清白蛋白和鸡卵清白蛋白偶联，得到免疫原与包被原。
3.根据权利要求1所述的有机磷农药多残留的免疫检测方法，其特征在于，步骤二中，所述动物为小白鼠或新西兰大白兔。
4.根据权利要求1所述的有机磷农药多残留的免疫检测方法，其特征在于，步骤三中，所述化学方法为共沉淀法，所述表面修饰为用3-氨丙基三乙氧基硅烷对Fe3O4磁性纳米粒子进行表面氨基硅烷化修饰。
5.根据权利要求1所述的有机磷农药多残留的免疫检测方法，其特征在于，步骤四中，所述形成免疫磁珠具体为：将表面修饰后的Fe3O4磁性纳米粒子分散在乙醇溶液中，用戊二醛法将其与制备得到的有机磷农药通用抗体偶联，磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，加入胶体金后，得到免疫磁珠。
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