CN101441210B - 纳米磁性粒子层析试纸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测技术领域的纳米磁性粒子层析试纸检测方法，先合成纳米的黑色磁性纳米粒子，对其表面进行羟基、氨基、羧基或巯基修饰后偶联抗原或抗体并冻干保存备用，然后通过在试纸的底衬上依次搭接粘贴有检测反应部分和吸水部分制备层析试纸条。检测反应部分上包被有抗体或抗原的检测区，同时包被有抗相应抗体或抗原作为参考线，利用纳米磁性粒子的颜色来检测相关抗原或抗体的存在。该检测法特异性强，检出率高，能够更好地满足于快速无创体外诊断及针对含有微量检测物的大样本的检测要求。本发明简单新颖，操作方便、快速、简便，便于推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测技术领域的方法，具体地说，涉及的是一种纳米磁性粒子层析试纸检测方法。
背景技术
近年来，纳米粒子以其独特的物理、化学性质引起广泛的关注。特别是磁性纳米粒子，由于其特有的超顺磁性和大大超越其它材料的比表面积，在医学和生物学领域有着极其广泛的用途(Anal Bioanal Chem.2006 384(3)：593-600)。磁性纳米粒子的超顺磁性使得其可在人为施加的磁场下进行操控；功能化的磁性纳米粒子可与大量的生物学分子或其他功能化材料进行偶联或修饰而用于细胞分离、自动化核酸提取、基因靶向、药物递送、磁共振现象以及高热治疗。其中，当与抗体进行偶联时，磁性纳米粒子可用于超灵敏免疫学实验或是微量物质的恢复。因而，磁性纳米粒子成为生物和医学研究领域不可或缺的材料之一。
免疫层析试验是继免疫渗滤实验之后发展起来的另一种膜固相免疫测定，以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，如层析一般。移动过程中被分析物与固定于膜上某一区域的受体(抗原或抗体)结合而被捕获，无关分析物则越过该区域而被分离，然后通过标记物的显色来判定试验结果。如今，免疫层析实验与酶联免疫吸附试验已成为医学检验中最为普遍的两种分析方法。与酶联免疫吸附试验相比，免疫层析实验具有简单(只有一步操作)、灵活(可单人份或少量样品检测)和快速(15分钟左右即可得到结果)等优点。
然而，由于免疫层析实验固有的限制，存在如下几个缺点：
1.目前常见的基于胶体金或者胶体硒免疫层析实验灵敏度较之酶联免疫吸附试验要低。
2.由于其体积和吸水材料的限制，免疫层析实验的上样量有限，因此在某些样本如唾液、尿液中靶分析物较少时会出现因检测样本量限制待检分析物少而检出率较低的情况。
3.制备工艺较为复杂。传统的工艺包括检测标记物的制备，样品垫与检测标记物垫的预处理，检测标记物喷垫干燥固化，抗原或抗体在硝酸纤维素膜上的固化，样品垫、检测标记物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫的四层搭接粘贴，工序多且繁复。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种纳米磁性粒子层析试纸检测方法，使其结合了纳米磁性粒子和免疫层析法两者优点，既能在大样本中富集微量待检物又能进行快速检测，提高了层析法的检出率和特异性，且制备工艺简单，省时省力。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤：
第一步，合成黑色磁性纳米粒子；
第二步，对第一步所得到的黑色磁性纳米粒子表面进行羟基、氨基、羧基或巯基修饰后偶联抗原或抗体并冻干保存备用；
第三步，在试纸的底衬上依次搭接粘贴检测反应部分和吸水部分，制备层析试纸条，检测反应部分上面包被有与待检项目相关的抗原或抗体作为检测线，同时包被有与偶联于磁性纳米粒子上的抗原或抗体相对应的特异性反应物如单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、抗原等作为参考线；
第四步，利用第二步所制备的偶联有抗原或抗体的黑色磁性纳米粒子对待检样本进行处理，再用第三步得到的试纸条检测处理后的待检样本。
所述合成黑色磁性纳米粒子可以采用共沉淀法或高温分解法实现，为现有常用方法。
所述对黑色磁性纳米粒子表面进行羟基、氨基、羧基或巯基修饰后偶联抗原或抗体，具体为：加入柠檬酸钠对其表面进行羧基化修饰或者利用正硅酸乙酯水解在纳米磁性粒子表面包覆一层二氧化硅，然后加入硅烷偶联剂分别对表面进行氨基化、巯基化。
所述硅烷偶联剂，如：(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTS)、N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1，2-乙二胺(AEAPS)、3-巯丙基三乙氧基硅烷(MPS)等。
所述的黑色磁性纳米粒子与抗原或抗体偶联的方法，具体为：将表面羟基、氨基、羧基或巯基的磁性纳米粒子通过化学反应与抗原或抗体共价结合在一起。
所述制备层析试纸条，具体为：将检测目的物相应的抗体或者抗原以百得(Bio-Dot)点样仪喷到硝酸纤维素膜上形成线性检测带，同时也将与偶联于磁性纳米粒子上的抗原或抗体相对应的特异性反应物如单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、抗原等喷到硝酸纤维素膜的吸水部分端作为参考带，以中性蛋白封闭、干燥。然后在固相底衬上相互叠加粘贴固化有检测带和参考带的硝酸纤维素膜和玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸。
所述第四步，具体为：将待检样本如血清、血浆、唾液、尿液等用两倍浓缩的pH 7.0～7.4的缓冲液如磷酸盐缓冲液等按1∶1比例稀释后重悬冻干的纳米磁性粒子，或用两倍浓缩的pH 7.0～7.4的缓冲液如磷酸盐缓冲液等先重悬纳米磁性粒子，再与待检样本按照1∶1的比例混合，37度反应15～20分钟后用磁铁将纳米磁性粒子富集于反应管的一处，弃去反应液，以含0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗涤纳米磁性粒子一次，再用1ml pH 7.0～7.4的PBS缓冲液重悬纳米磁性粒子，层析试纸条的检测线端插入此重悬液中，液面不超过MAX线，在毛细作用下，重悬液从检测线段向吸水纸端不断渗移，如重悬液中含有被纳米磁性粒子捕获的特异性抗原或者抗体，在此渗移过程中将被固定在硝酸纤维素膜上的相应抗原或者抗体捕获，形成肉眼可分辨的黑色检测带，而不管重悬液中是否有与检测线上所固化的抗原或抗体相匹配的抗体或抗原，偶联有抗原或抗体的纳米磁性粒子都将被固化于参考线上的针对偶联于纳米磁性粒子上的抗原或抗体的对应物所捕获形成肉眼可见的黑色参考带。
本发明优点在于：(1)能够富集大样本中的微量待检物，不受起始样本量的限制；(2)操作容易；(3)检测时间远少于传统的酶联免疫吸附试验；(4)检出率及特异性远优于传统的免疫层析实验；(5)采用磁性纳米粒子对样本进行处理后既可富集样本中的靶分子又可大大减少因样本粘滞度以及样本中的其它干扰因素对层析反应带来的影响；(6)本发明所用的层析试纸条制备工艺较之传统的免疫层析试纸条更为简单，无需样品垫和检测标记物垫，成本更低，装配更简便，因此能够大大促进临床应用，特别是大样本微量待检物条件下如唾液、尿液等的检测分析。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
乙肝表面抗体检测
a)称取2.51g(0.0093mol)FeCl3·6H2O和1.25g(0.0045mol)FeSO4·7H2O溶于600ml去离子水中，在室温氮气保护下，向上述溶液中逐点加入24ml浓度为1.5mol/l的氨水得到黑色沉淀。借助磁分离用去离子水洗涤5次，将纳米磁性粒子分散在12ml的0.3M的柠檬酸钠溶液中反应30分钟。
或者采用高温分解法，称取0.706g(0.002mol)乙酰丙酮合铁(Fe(acac)3)溶解在10ml二苄醚和10ml油胺110度脱水1小时，快速加热到300度反应2小时，冷却后加入50ml乙醇，加入0.015mol的柠檬酸钠溶液中反应30分钟。
b)取1ml的浓度为0.25mM的纳米磁性粒子加入2.5ml磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)，再加入125mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和125mg的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)反应30分钟，最后加入300μg的葡萄球菌A蛋白(SPA)。
c)先将硝酸纤维素膜用戊二醛溶液处理30分钟后37度烘干；再将以pH7.60.01mol/L的磷酸盐缓冲液将基因工程乙肝表面抗原稀释为1mg/ml以百得(Bio-Dot)点样仪喷到0.7cm宽7cm长的硝酸纤维素膜MAX线端距末端上2cm处形成线性检测带，同时也将0.1mg/ml抗葡萄球菌A蛋白(SPA)单克隆抗体喷到硝酸纤维素膜的吸水部分端距检测带6mm处作为参考带，以中性蛋白封闭、37度干燥。然后在固相底衬上相互叠加粘贴硝酸纤维素膜和玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸，最后在距硝酸纤维素膜MAX线端的末端1cm处用塑料纸标记出MAX线，为插入样本溶液中液面不可超过的指示线。
d)将待检样本如血清、血浆、唾液等用两倍浓缩的pH 7.0～7.4的缓冲液如磷酸盐缓冲液等按1∶1比例稀释后重悬冻干的纳米磁性粒子，或用两倍浓缩的pH 7.0～7.4的缓冲液如磷酸盐缓冲液等先重悬纳米磁性粒子，再与待检样本按1∶1比例混合，37度反应20～30分钟后用磁铁将纳米磁性粒子富集于反应管的一处，弃去反应液，以含0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗涤纳米磁性粒子一次，再用1ml pH 7.0～7.4的PBS缓冲液重悬纳米磁性粒子，层析试纸条的检测线端插入此重悬液中，液面不超过MAX线，在毛细作用下，重悬液从检测线段向吸水纸端不断渗移，如重悬液中含有被纳米磁性粒子捕获的乙肝表面抗体，在此渗移过程中将被固定在硝酸纤维素膜上的乙肝表面抗原捕获，形成肉眼可分辨的阳性黑色检测带；而不管重悬液中是否有乙肝表面抗体，偶联有葡萄球菌A蛋白的纳米磁性粒子都将被固化于参考线上的抗葡萄球菌A蛋白单克隆抗体所捕获形成肉眼可见的黑色参考带；如试纸条失效则在参考带不会出现黑色条带。
实施例2
乙肝表面抗原检测
a)称取2.51g(0.0093mol)FeCl3·6H2O和1.25g(0.0045mol)FeSO4·7H2O溶于600ml去离子水中，在室温氮气保护下，向上述溶液中逐点加入24ml浓度为1.5mol/l的氨水得到黑色沉淀，借助磁分离用去离子水洗涤5次，得到纳米磁性粒子。
或者采用高温分解法，称取0.706g(0.002mol)乙酰丙酮合铁(Fe(acac)3)溶解在10ml二苄醚和10ml油胺110度脱水1小时，快速加热到300度反应2小时，冷却后加入50ml乙醇。
取上述两种方法的纳米磁性粒子74mg分散在149ml乙醇和1ml水中超声分散30分钟，加入35μl的APTS快速搅拌反应7h，磁分离洗涤得到表面氨基化的纳米磁性粒子。
b)取1ml的浓度为0.25mM的上述纳米磁性粒子加入2.5ml磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)，再加入适量戊二醛，最后加入300μg的抗乙肝表面抗原单克隆抗体。
c)先将硝酸纤维素膜用戊二醛溶液处理30分钟后37度烘干；再将以pH7.60.01mol/L的磷酸盐缓冲液将抗乙肝表面抗原另一表位的单克隆抗体稀释为2mg/ml以百得(Bio-Dot)点样仪喷到0.7cm宽7cm长的硝酸纤维素膜MAX线端距末端上2cm处形成线性检测带，同时也将0.1mg/ml葡萄球菌A蛋白(SPA)喷到硝酸纤维素膜的吸水部分端距检测带6mm处作为参考带，以中性蛋白封闭、37度干燥。然后在固相底衬上相互叠加粘贴硝酸纤维素膜和玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸。最后在距硝酸纤维素膜MAX线端的末端1cm处用塑料纸标记出MAX线，为插入样本溶液中液面不可超过的指示线。
d)将待检样本如血清、血浆、唾液等用两倍浓缩的pH 7.0～7.4的缓冲液如磷酸盐缓冲液等按1∶1比例稀释后重悬冻干的纳米磁性粒子，或用两倍浓缩的pH 7.0～7.4的磷酸盐缓冲液先重悬纳米磁性粒子，再与待检样本按1∶1比例混合，37度反应15～20分钟后用磁铁将纳米磁性粒子富集于反应管的一处，弃去反应液，以含0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗涤纳米磁性粒子一次，再用1mlpH 7.0～7.4的PBS缓冲液重悬纳米磁性粒子，层析试纸条的检测线端插入此重悬液中，液面不超过MAX线，在毛细作用下，重悬液从检测线段向吸水纸端不断渗移，如重悬液中含有被纳米磁性粒子捕获的乙肝表面抗原，在此渗移过程中将被固定在硝酸纤维素膜上的抗乙肝表面抗原另一表位的单克隆抗体捕获，形成肉眼可分辨的阳性黑色检测带；而不管重悬液中是否有乙肝表面抗原，偶联有抗乙肝表面抗原单克隆抗体的纳米磁性粒子都将被固化于参考线上的抗葡萄球菌A蛋白单克隆抗体所捕获形成肉眼可见的黑色参考带；如试纸条失效则在参考带不会出现黑色条带。
Claims (6)
1.一种纳米磁性粒子层析试纸非诊断目的的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
第一步，合成黑色磁性纳米粒子；
第二步，对第一步所得到的黑色磁性纳米粒子表面进行羧基化修饰再进行氨基或巯基化修饰后偶联抗原或抗体并冻干保存备用；
第三步，在试纸的底衬上依次搭接粘贴检测反应部分和吸水部分，制备层析试纸条，检测反应部分上面包被有与待检项目相关的抗原或抗体作为检测线，同时包被有与偶联于磁性纳米粒子上的抗原或抗体相对应的特异性反应物作为参考线；
第四步，利用第二步所制备的偶联有抗原或抗体的黑色磁性纳米粒子对待检样本进行处理，再用第三步得到的试纸条检测处理后的待检样本；
所述合成黑色磁性纳米粒子采用共沉淀法或高温分解法实现；
所述对黑色磁性纳米粒子表面进行羧基化修饰再进行氨基或巯基修饰后偶联抗原或抗体，具体为：加入柠檬酸钠对其表面进行羧基化修饰，然后加入硅烷偶联剂对表面进行氨基化、巯基化。
2.根据权利要求1所述的纳米磁性粒子层析试纸非诊断目的的检测方法，其特征是，所述硅烷偶联剂为（3-氨丙基）三乙氧基硅烷、N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1,2-乙二胺、3-巯丙基三乙氧基硅烷中一种。
3.根据权利要求1所述的纳米磁性粒子层析试纸非诊断目的的检测方法，其特征是，所述的黑色磁性纳米粒子与抗原或抗体偶联的方法是将表面进行羧基化修饰，再进行氨基化或巯基化的磁性纳米粒子通过化学反应与抗原或抗体共价结合在一起。
4.根据权利要求1所述的纳米磁性粒子层析试纸非诊断目的的检测方法，其特征是，所述制备层析试纸条，具体为：将检测目的物相应的抗体或者抗原喷到硝酸纤维素膜上形成线性检测带，同时也将与偶联于磁性纳米粒子上的抗原或抗体相对应的特异性反应物喷到硝酸纤维素膜的吸水部分端作为参考带，以中性蛋白封闭、干燥，然后在固相底衬上相互叠加粘贴固化有检测带和参考带的硝酸纤维素膜和玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸。
5.根据权利要求1所述的纳米磁性粒子层析试纸非诊断目的的检测方法，其特征是，所述第四步，具体为：将待检样本用两倍浓缩的pH7.0～7.4的缓冲液按1:1比例稀释后重悬冻干的纳米磁性粒子，或用两倍浓缩的pH7.0～7.4的缓冲液先重悬纳米磁性粒子，再与待检样本按照1:1的比例混合，37度反应15～20分钟后用磁铁将纳米磁性粒子富集于反应管的一处，弃去反应液，以含0.05%Tween20的PBS缓冲液洗涤纳米磁性粒子一次，再用lml pH7.0～7.4的PBS缓冲液重悬纳米磁性粒子，层析试纸条的检测线端插入此重悬液中，液面不超过MAX线，如重悬液中含有被纳米磁性粒子捕获的特异性抗原或者抗体，在此渗移过程中将被固定在硝酸纤维素膜上的相应抗原或者抗体捕获，形成肉眼可分辨的黑色检测带，而不管重悬液中是否有与检测线上所固化的抗原或抗体相匹配的抗体或抗原，偶联有抗原或抗体的纳米磁性粒子都将被固化于参考线上的针对偶联于纳米磁性粒子上的抗原或抗体的对应物所捕获形成肉眼可见的黑色参考带，结合生物免疫层析芯片检测仪，可实现定量检测。
6.根据权利要求5所述的纳米磁性粒子层析试纸非诊断目的的检测方法，其特征是，所述缓冲液为pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |