CN106468712B

CN106468712B - 基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素a方法

Info

Publication number: CN106468712B
Application number: CN201610852241.8A
Authority: CN
Inventors: 刘星; 陈健; 曹献英; 孙志昶; 唐宗文; 马新辉; 舒杨
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2016-09-26
Filing date: 2016-09-26
Publication date: 2018-11-16
Anticipated expiration: 2036-09-26
Also published as: CN106468712A

Abstract

本发明公开了一种基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法，将抗OTA纳米抗体与纳米磁珠结合制备IMB，利用IMB富集谷物中的OTA作为样品前处理方法；再结合斑点免疫法，将OTA‑OVA检测抗原固定在PVDF膜上，磁珠以抗体标记物的形式参与免疫反应，OTA‑OVA与待测物OTA竞争结合抗体，以磁珠是否在PVDF膜聚集来判断检测结果。本发明实现简单、快速的定性检测；该方法无需分析仪器即可裸视读取结果，进而可研发一种新型快速可视化的检测卡专门用于检测谷物中的OTA。

Description

基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法

技术领域

本发明属于细菌研究技术领域，尤其涉及一种基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法。

背景技术

赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)是一种由青霉素属和曲霉属的某些菌种产生的真菌毒素，主要污染谷物及其制品，是影响我国食品安全的主要因素之一。因此，开发OTA快速检测法显得尤为重要。真菌毒素是由真菌产生的次级代谢产物，普遍存在于被真菌污染的食品和饲料中。研究表明，真菌毒素可能引发肝、肾等器官病变，如肝炎、肝硬化和肝癌，是影响食品安全的主要因素之一。粮食中常见的真菌毒素有黄曲霉毒素(aflatoxins,AFs)、赭曲霉毒素(ocratoxins,OTs)、呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)、伏马菌素B₁(fumonisin b₁,FB₁)、桔青霉素(citrinin,CIT)等。OTA是一种常见的谷物及谷物制品污染物，具有毒性、肝毒性、免疫毒性等多重毒性作用，被国际癌症研究机构(InternationalAgency ofResearch on Cancer,IARC)将列为2B类致癌物质。基于OTA对人类健康的多重威胁，为了降低通过食物摄入OTA所带来的风险，许多国家、地区及国际组织都对食品中OTA含量制定了严格的限量标准。由于食品在生产、加工、运输、贮藏等各个环节都可能遭受真菌污染，所以为了保障食品安全，我们需要开发一些简单快速的检测方法，用于企业和政府相关部门对产品进行现场筛查。目前，检测OTA的方法主要包括色谱分析、免疫分析、电化学分析。薄层色谱、液相色谱、质谱法等色谱分析方法因其灵敏度、准确度高，被广泛应用于法定检验和方法验证。色谱法需要特定的分析仪器，检测周期长，因而不适用于大量样品的快速筛选。免疫分析则弥补了以上不足，目前，酶联免疫法(enzyme linked immuno sorbentassay,ELISA)、斑点免疫法(dot-enzyme linked immuno sorbent assay,Dot-ELISA)、免疫层析法(immunochromatographic assay,ICA)等方法操作简单、快速，商业化产品众多。虽然免疫法的特异性高，但是由于实际样品复杂多样，检测结果易出现假阳性、假阴性，重复性差，只适用于样品的初步筛选。即便免疫法测定OTA的准确度不高，但是低成本、易操作、速度快的特点使其在商业市场上占有很大优势。因此提高免疫分析方法的准确度，可以进一步扩大该方法在食品分析领域的应用范围。由于快速检测方法的主要目的是节省操作时间和减少操作步骤，而且样品前处理在整个分析过程中所占的时间比重较大，因此优化前处理条件实现快速富集是实现快速检测的有效手段。而且，样品中的杂质、萃取过程中残留的有机溶剂、pH值等条件均会影响抗原与抗体之间的特异性反应。为了提高免疫检测的稳定性，优化样品前处理过程，既能够快速富集样品中的待测物且不影响免疫反应体系，是一种行之有效的解决办法。目前常用的样品前处理方法包括液液萃取、固相萃取、免疫亲和层析、免疫磁珠(Immuno magnetic bead,IMB)富集等。液液萃取成本低、应用广，但是净化不彻底，影响检测准确度。SPE净化彻底、干扰杂志少，但是操作繁琐、耗时较长。免疫亲和层析净化彻底、选择性好，通常与色谱法联用，准确度高，但是成本较高、耗时较长。1993年，研究人员首次报道在双峰驼等驼源性动物的血清中除了完整的抗体之外，还存在许多天然缺失轻链和CH1的新型抗体，即重链抗体(Heavy ChainAntibody,HCAb)，后来陆续发现在护士鲨等软骨鱼体内也存在类似驼源HCAb结构的新抗原受体(NewAntigen Receptor,NAR)，与完整的常规抗体IgG1相比，HCAb(IgG2和IgG3)的重链仅由重链可变区、铰链区和恒定区CH2、CH3构成，而HCAb的抗原结合区则仅由重链可变区组成，克隆重链可变区并经表达后即可获得由重链可变区组成的单域抗体VHH(heavy chain variable of heavy chainantibody,VHH)。VHH的分子量约为15kDa，其晶体结构为直径2.5nm、长4nm的椭球形，因而也被称为纳米抗体(Nanobody,Nb)。与软骨鱼相比，驼源性动物更易于进行免疫等操作，因此目前大部分纳米抗体的研究均采用驼源性动物作为实验对象。重链抗体的VHH与完整抗体的VH序列比对分析结果显示两者在框架区(Framework region,FR)和超变区(Hypervariable region,HVR)具有一定的同源性，主要的区别在于以下两方面：第一，FR2的氨基酸构成：完整抗典型特征是在FR2中含有四个高度保守的、与VL相互作用的关键性疏水性氨基酸(V42、G49、L50和W52，这四个疏水性氨基酸在重链抗体的VHH中则相应进化突变为更小的亲水性氨基酸(F42、E49、R50和G52)，使得VHH具有良好的水溶性并无需与VL形成异二聚体就能保持稳定的结构。根据这一特性，Davies等通过定向突变将人源抗体VH区进行驼源化VHH改造，结果表明驼源化的VH的水溶性和稳定性不仅得到了极大的提高，而且仍然保留了良好的抗原结合能力；第二，互补决定区(complementary determining regions,CDRs)的差别：与完整抗体的VH相比，驼源VHH具有更长CDR1区和CDR3区，完整抗体通过6个CDR区形成抗原结合区，而驼源重链抗体通过进化形成更长的CDR1和CDR3区来弥补轻链的缺失，以提供充足的抗原识别面积。此外，VHH的CDR1和CDR3均含有一个半胱氨酸，易形成分子内二硫键，使得纳米抗体具有更好的稳定性。随着纳米抗体技术在医学诊断、疾病治疗应用上的日渐成熟，研究人员进一步发掘了纳米抗体在食品安全检测上的应用潜力。近年来，纳米抗体在真菌毒素、农药残留等有毒有害物的检测方面发展迅速。Xu等以抗桔青霉素(citrinin,CIT)单克隆抗体为靶标，从羊驼天然库淘选获得抗CIT独特型纳米抗体，并以展示有抗独特型纳米抗体的噬菌体替代人工抗原，建立了检测CIT的间接竞争phage ELISA，IC₅₀为10.9μg/kg，比人工抗原建立的传统ELISA灵敏度(IC₅₀＝102.1μg/kg)提高了9倍；Wang等以抗AFB₁单克隆抗体1C11免疫羊驼并构建噬菌体展示纳米抗体文库，经过多轮淘选获得3株抗独特型纳米抗体并选取灵敏度最好的抗体建立了VHH ELISA，IC₅₀为0.16ng/mL，与AFB₂、AFG₁、AFG₂的交叉反应率分别为90.4％、54.4％、37.7％。除了应用于传统的检测方法，纳米抗体结合新型材料制备生物传感器，并应用于食品安全分析正成为当前的研究热点。Zhu等以纳米金作为信号增强剂包被纳米抗体，制备了一种高灵敏快速检测肉毒梭状芽孢杆菌毒素(Clostridium difficile toxin,Tcd)的电化学免疫传感器，检测限分别为TcdA 0.61pg/mL和Tcd B 0.60pg/mL。

综上所述，样品前处理方法成本较高、耗时较长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法，旨在解决现有的样品前处理方法成本较高、耗时较长的问题。

本发明是这样实现的，一种基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法，包括以下步骤：

采用化学共沉淀法合成磁性纳米颗粒，采用EDC/NHS法将纳米磁珠的羧基与抗OTA纳米抗体上的氨基偶联，制得用于富集谷物样品中OTA的高偶联比IMB和参与免疫反应体系的低偶联比IMB；

利用IMB富集技术对待测样品进行前处理后，得到低偶联比IMB和OTA的混合物；

再结合磁珠斑点免疫法，以PVDF膜为固相基质，将OTA-OVA检测抗原点样于PVDF膜基质上，以抗His tag抗体作为对照，封闭处理；

将处理好的PVDF膜投入IMB和OTA的混合物进行反应，磁珠以抗体标记物的形式参与免疫反应，样品混合物中的游离OTA与膜上的OTA-OVA抗原竞争结合低偶联比IMB；

以磁珠在PVDF膜聚集OTA-OVA量的多少判断样品中的OTA含量。

进一步，纳米磁珠的制备方法为：

称取4.78g FeCl₃·6H₂O和2.78g FeSO₄·7H₂O溶解在200mL水中，将溶液倒入250mL锥形瓶，通氮气搅拌至溶解；

加入3.2g NaOH，溶液变为黑色；85℃水浴持续搅拌1h得到Fe₃O₄磁性纳米颗粒；

利用磁场分离除去上清，用乙醇和水洗涤后保存于水中；取1mL磁珠溶液称重，在红外灯下烘干后重新称重，测得溶液中磁性颗粒的含量为0.05g/mL；

将1mL磁珠溶液溶于100mL无水乙醇，超声至完全分散，加入6mL APTES，用氨水调节pH值至11.0，在60℃水浴中搅拌反应5h后，用无水乙醇洗涤5次，制得表面偶联有氨基基团的功能性纳米磁珠。

进一步，纳米磁珠与抗OTA纳米抗体偶联方法为：

1mg磁珠用500μL MEST洗涤两次；

400μL MES重悬磁珠后加入0.5mg EDC和0.5mg NHS，置于混匀仪上保持悬浮状态，37℃活化1h；

磁分离去上清，500μL MEST洗涤两次，PBST重悬后加入40μg抗OTA纳米抗体，4℃搅拌反应过夜；

偶联产物与乙醇胺37℃混匀1h；

PBST洗涤3次后加1mL PBST重悬，4℃保存；

将上述制备的免疫磁珠稀释到合适浓度，进行电镜表征和紫外扫描。

进一步，所述的MEST为：10mM MES,0.05％Tween 20,pH 6.0；

所述的MES为：10mM,pH 6.0；

所述的PBST为0.01M PBS,0.01％Tween 20,pH 7.4；

所述的乙醇胺体积比为2％的溶液；

所述PBST洗涤3次后加1mL PBST中，1mL的PBST含0.5％BSA和0.02％NaN₃。

进一步，磁珠斑点免疫法的建立方法包括：

PVDF膜前处理：

用铅笔在PVDF膜上画出膜反应区；将PVDF膜置于甲醇中浸泡15s后取出，再用超纯水漂洗2min；

将两层滤纸平铺于操作台上，加入3mL PBS，使滤纸润湿，并用干燥的滤纸吸收多余的PBS，使台面与滤纸间无气泡；将用超纯水漂洗处理后的膜放在湿滤纸上，用光滑的玻璃试管在滤纸与膜上滚动，使滤纸与膜间无气泡；

用移液器将3μL抗OTA纳米抗体点在膜反应区的中心位置，静置10秒后放入湿盒中，37℃孵育2h；将膜浸泡于5％脱脂牛奶中封闭1h，用PBST漂洗，晾干，并储存于4℃备用。

进一步，利用IMB富集技术对待测样品进行前处理方法为：

称取5g粉碎后的谷物样品，加入20mL 50％甲醇-PBS，剧烈震荡提取10分钟，离心分离上清，PBS稀释一定比例后加入高偶联比免疫磁珠进行孵育；

磁分离除去上清，用1mL PBS洗涤一次；磁珠重悬于120μL PBS中，90℃水浴10min使抗体变性并洗脱OTA，向洗脱溶液中加入10μg低偶联比的免疫磁珠并充分混合。

进一步，以磁珠在PVDF膜聚集OTA-OVA量的多少判断样品中的OTA含量方法为：

将封闭好的PVDF膜浸入IMB-OTA混合液中，在水平摇床上室温反应；取出PVDF膜，PBST洗涤3次，样品中的OTA含量越高，能够与膜上OTA-OVA聚集结合的磁珠量越少；洗去未结合的磁珠，判断结果。

本发明另一目的在于提供一种基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法在小分子污染物快速检测体系上的应用。

本发明的另一目的在于提供一种上述的基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法制备的快速检测谷物中OTA的可视化检测卡。

本发明提供的基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法，首次将免疫磁珠应用在斑点免疫反应中，既能够快速净化样品，又可以充当标记物的作用，节省了反应时间和步骤，可实现准确度高、特异性强的OTA快速检测，为其他小分子污染物的快速筛查奠定良好的基础；高偶联比的免疫磁珠能够快速富集样品中的OTA，消除了复杂样品的对检测的基质干扰效应；检测抗原能与结合了洗脱后的OTA的低偶联比免疫磁珠竞争结合纳米抗体，且磁珠自身带有棕色，因此能够充当显色标记物的作用。

本发明实现简单、快速的定性检测；该方法无需分析仪器即可裸视读取结果，进而可研发一种新型快速可视化的检测卡专门用于检测谷物中的OTA。与传统抗体相比，纳米抗体具有制备简单、生产成本低等优势；使用免疫磁珠的目的是简单快速富集样品中的待测物，并有效去除样品的基质干扰。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例的基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法包括以下步骤：

S101：采用化学共沉淀法合成磁性纳米颗粒，采用EDC/NHS法将纳米磁珠的羧基与抗OTA纳米抗体上的氨基偶联，制得用于富集谷物样品中OTA的高偶联比IMB和参与免疫反应体系的低偶联比IMB；

S102：利用IMB富集技术对待测样品进行前处理后，得到低偶联比IMB和OTA的混合物；

S103：再结合磁珠斑点免疫法，以PVDF膜为固相基质，将OTA-OVA检测抗原点样于PVDF膜基质上，以抗His tag抗体作为对照，封闭处理；

S104：将处理好的PVDF膜投入IMB和OTA的混合物进行反应，磁珠以抗体标记物的形式参与免疫反应，样品混合物中的游离OTA与膜上的OTA-OVA抗原竞争结合IMB；

S105：以磁珠在PVDF膜聚集OTA-OVA量的多少判断样品中的OTA含量。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步说明。

1.1实验方案

1.1.1纳米抗体的表达、纯化及鉴定

1.1.1.1纳米抗体的诱导表达

纳米抗体原核表达的具体步骤如下：

1)将质粒pET 25b-VHH热击转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞中，均匀涂布于LB/Car/Chl平板上，37℃倒置培养12h；

2)挑取单菌落接入5mL LB/Car/Chl液体培养基中，37℃220rpm摇振培养12h；

3)按1％接种量将上述培养物转接至200mL LB/Car/Chl液体培养基中，37℃、220rpm摇振培养至OD₆₀₀≈0.5；

4)移取1mL上述培养物离心收集菌体细胞并于-20℃冻存备用，加入终浓度为0.5mM的IPTG至剩余培养物中，30℃、250rpm摇振培养12h；

5)移取1mL诱导后培养物离心收集菌体细胞并于-20℃冻存备用，5000g离心10min收集剩余菌体；

6)在上述每克剩余菌体中加入4mL菌体蛋白提取试剂(Bacterical ProteinExtractionReagent,B-PER)，且每毫升B-PER中含有2μL溶菌酶和2μL核酸内切酶DNase I，充分重悬菌体后室温静置10-15min；

7)15000g离心5min，收集含有可溶性蛋白的上清液；

8)处理上述样品，采用SDS-PAGE和Western blot分析目的蛋白的表达情况。

1.1.1.2纳米抗体的纯化

1)吸取1mL HisPurNi-NTAresin填充纯化柱，使其自然沉降；

2)采用6mL 0.01M PBS冲洗并平衡预装柱；加入经0.22μm滤膜过滤的上述含有可溶性蛋白的上清液；

3)采用6mL过柱缓冲液(含25mM咪唑的0.01M PBS)淋洗；

4)采用6mL洗脱液(含100mM咪唑的0.01M PBS)洗脱目的蛋白；

5)采用SDS-PAGE和Western blot分析目的蛋白纯化情况。

1.1.1.3纳米抗体的鉴定

A.SDS-PAGE分析

1)将样品与4×Loading Buffer混匀，95℃加热5min，2000g离心5min，分离上清备用；

2)将蛋白预制胶NuPAGE 4-12％Bis-Tris gel组装至电泳槽，加入0.5×SDSBuffer并上样；

3)运行电泳程序：浓缩胶35V 30min，分离胶120V 1h；

4)电泳完成后，采用100mL固定液(含50％甲醇和7％乙酸的水溶液)处理SDS-PAGE胶30min，重复一次；

5)将SDS-PAGE胶置于60mL SYPRO Ruby gel stain中浸泡过夜；

6)采用洗涤剂(含10％甲醇和7％乙酸的水溶液)洗去胶上残余的SYPRO Ruby gelstain；

7)凝胶成像系统紫外拍照保存图片。

B.Western blot分析

1)采用SDS-PAGE分析样品；

2)将PVDF膜和两张转膜专用滤纸在转膜液中浸泡1min；

3)依次在转膜仪上小心逐层放置一张滤纸、PVDF膜、SDS-PAGE胶、另一张滤纸，选择适当程序进行转膜；

4)转膜完成后，取出PVDF膜，37℃、3％脱脂牛奶封闭1h；

5)PBST洗涤三次，加入HRP-兔抗His标签多克隆抗体(1:2000稀释)，室温孵育1h；

6)PBST洗涤三次，加入TMB沉淀型显色液TMB Membrane Peroxidase，反应1min；

7)自来水终止反应，将PVDF膜晾干，拍照保存图像。

1.1.2免疫磁珠的制备及表征

1.1.2.1纳米磁珠的制备

称取4.78g FeCl₃·6H₂O和2.78g FeSO₄·7H₂O溶解在200mL水中，将溶液倒入250mL锥形瓶，通氮气搅拌至溶解。加入3.2g NaOH，溶液变为黑色。85℃水浴持续搅拌1h得到Fe₃O₄磁性纳米颗粒。利用磁场分离除去上清，用乙醇和水洗涤后保存于水中。取1mL磁珠溶液称重，在红外灯下烘干后重新称重，测得溶液中磁性颗粒的含量为0.05g/mL。将1mL磁珠溶液溶于100mL无水乙醇，超声至完全分散，加入6mLAPTES，用氨水调节pH值至11.0，在60℃水浴中搅拌反应5h。之后，用无水乙醇洗涤5次，制得表面偶联有氨基基团的功能性纳米磁珠。

1.1.2.2纳米磁珠与抗OTA纳米抗体偶联

1mg磁珠用500μL MEST(10mM MES,0.05％Tween 20,pH 6.0)洗涤两次。400μL MES(10mM,pH 6.0)重悬磁珠后加入0.5mg EDC,0.5mg NHS，置于混匀仪上保持悬浮状态，37℃活化1h。磁分离去上清，500μL MEST洗涤两次，PBST(0.01M PBS,0.01％Tween 20,pH 7.4)重悬后加入40μg抗OTA纳米抗体4℃搅拌反应过夜。偶联产物与乙醇胺(2％,v/v)37℃混匀1h。PBST洗涤3次后加1mL PBST(含0.5％BSA,0.02％NaN₃)重悬，4℃保存。将上述制备的免疫磁珠稀释到合适浓度，进行电镜表征和紫外扫描。

1.1.3磁珠斑点免疫法的建立

1.1.3.1PVDF膜前处理

用铅笔在PVDF膜上画出膜反应区。将PVDF膜置于甲醇中浸泡15s后取出，再用超纯水漂洗2min。此时，将两层滤纸平铺于水平、洁净的操作台上，加入3mL PBS，使滤纸润湿，并用干燥的滤纸吸收多余的PBS，使台面与滤纸间无气泡。将处理后的膜放在湿滤纸上，用光滑的玻璃试管在滤纸与膜上滚动，使滤纸与膜间无气泡。用移液器将3μL抗OTA纳米抗体点在膜反应区的中心位置，静置10秒后放入湿盒中，37℃孵育2h。将膜浸泡于5％脱脂牛奶中封闭1h，用PBST漂洗，晾干，并储存于4℃备用。

1.1.3.2样品前处理

称取5g粉碎后的谷物样品，加入20mL 50％甲醇-PBS，剧烈震荡提取10分钟，离心分离上清，PBS稀释一定比例后加入高偶联比免疫磁珠进行孵育。磁分离除去上清，用1mLPBS洗涤一次。磁珠重悬于120μL PBS中，90℃水浴10min使抗体变性并洗脱OTA，向洗脱溶液中加入10μg低偶联比的免疫磁珠并充分混合。

1.1.3.3检测

将封闭好的PVDF膜浸入上述IMB-OTA混合液中，在水平摇床上室温反应。取出PVDF膜，PBST洗涤3次，判断结果。

1.1.3.4优化前处理过程

通过单因素变化法实现对各项萃取条件的优化。以下列出了各项萃取实验参数拟优化的区间(根据实际情况进行调整)：

萃取剂种类：80％甲醇(v/v)、60％甲醇(v/v)、80％甲醇(v/v)+5％NaCl(w/v)、60％甲醇(v/v)+5％NaCl(w/v)；

免疫磁珠富集体系中甲醇的含量：10％、20％、30％、40％；

高偶联比免疫磁珠的用量：5、10、20、40mg；

萃取时间：5、10、20、40min。

1.1.3.5优化检测条件

通过单因素实验对抗原、抗体反应条件进行优化：OTA-OVA抗原的包被浓度：20、40、80、160μg/mL；

抗His tag抗体的包被浓度：20、40、80、160μg/mL；

检测时间：10、20、30、40min。

1.1.3.6检测方法的灵敏度

在OTA阴性样本(经HPLC测定未检出OTA的植物油样品)中添加OTA标准品，使OTA终浓度分别为0、5、10、20、40、80μg/kg，分别进行检测。

1.1.3.7方法的特异性

配制一系列不同浓度的OTB、ZEN、DON、FB₁和AFB₁标准品溶液代替OTA，采用优化后的条件进行检测。

1.1.3.8方法的重复性

方法的日内和日间精密度分别通过在同日内以及连续几日内重复实验测定，并用于评价方法。实验将在线性范围内的三个浓度级别被分别测定以确保可靠性。

1.2可行性分析

1.2.1理论上的可行性：现有的理论和报道已经证明鼠单克隆抗体免疫磁珠能够用于黄曲霉毒素B1的试纸条快速检测，此外，纳米抗体也成功应用于修饰各类纳米材料，因此从理论和方法来说，本发明是可行的。

1.2.2技术上的可行性：本发明涉及的纳米抗体表达纯化、磁珠制备及抗体修饰、斑点免疫分析在许多领域均已成功实施，因此从技术手段方面来说，本发明是可行的。

1.2.3前期工作基础：本发明目前已获得了抗OTA的纳米抗体、OTA抗独特型纳米抗体、FB₁抗独特型纳米抗体，同时本发明已经拥有所涉及的纳米抗体表达载体、宿主细胞实验材料，因此从技术储备来说本发明也是可行的。

本发明首次制备OTA纳米抗体免疫磁珠并运用于斑点免疫反应中，实现了OTA的快速、可视化定性分析。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，该基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A的方法包括以下步骤：

采用化学共沉淀法合成磁性纳米颗粒，采用EDC/NHS法将纳米磁珠的羧基与抗OTA纳米抗体上的氨基偶联，制得用于富集谷物样品中OTA的高偶联比免疫磁珠和参与免疫反应体系的低偶联比免疫磁珠；

利用免疫磁珠富集技术对待测样品进行前处理后，得到低偶联比免疫磁珠和OTA的混合物；

再结合磁珠斑点免疫法，以PVDF膜为固相基质，将OTA-OVA检测抗原点样于PVDF膜基质上，以抗Histag抗体作为对照，封闭处理；

将处理好的PVDF膜投入免疫磁珠和OTA的混合物进行反应，磁珠以抗体标记物的形式参与免疫反应，样品混合物中的游离OTA与膜上的OTA-OVA抗原竞争结合免疫磁珠；

以磁珠在PVDF膜聚集OTA-OVA量的多少判断样品中的OTA含量；

利用免疫磁珠富集技术对待测样品进行前处理方法为：

称取5g粉碎后的谷物样品，加入20mL50％甲醇-PBS，剧烈震荡提取10分钟，离心分离上清，PBS稀释一定比例后加入高偶联比免疫磁珠进行孵育；

磁分离除去上清，用1mLPBS洗涤一次；磁珠重悬于120μLPBS中，90℃水浴10min使抗体变性并洗脱OTA，向洗脱溶液中加入10μg低偶联比的免疫磁珠并充分混合。

2.如权利要求1所述的基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，纳米磁珠与抗OTA纳米抗体偶联方法为：

1mg磁珠用500μLMEST洗涤两次；

400μLMES重悬磁珠后加入0.5mgEDC和0.5mgNHS，置于混匀仪上保持悬浮状态，37℃活化1h；

磁分离去上清，500μLMEST洗涤两次，PBST重悬后加入40μg抗OTA纳米抗体，4℃搅拌反应过夜；

偶联产物与乙醇胺37℃混匀1h；

PBST洗涤3次后加1mLPBST重悬，4℃保存；

3.如权利要求2所述的基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述的MEST为：10mMMES,0.05％Tween20,pH6.0；

所述的MES为：10mM,pH6.0；

所述的PBST为0.01MPBS,0.01％Tween20,pH7.4；

所述的乙醇胺体积比为2％的溶液；

所述PBST洗涤3次后加1mLPBST中，1mL的PBST含0.5％BSA和0.02％NaN₃。

4.如权利要求1所述的基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，磁珠斑点免疫法的建立方法包括：

PVDF膜前处理：

将两层滤纸平铺于操作台上，加入3mLPBS，使滤纸润湿，并用干燥的滤纸吸收多余的PBS，使台面与滤纸间无气泡；将用超纯水漂洗处理后的膜放在湿滤纸上，用光滑的玻璃试管在滤纸与膜上滚动，使滤纸与膜间无气泡；

用移液器将3μL检测抗原点在膜反应区的中心位置，静置10秒后放入湿盒中，37℃孵育2h；将膜浸泡于5％脱脂牛奶中封闭1h，用PBST漂洗，晾干，并储存于4℃备用。

5.如权利要求1所述的基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，以磁珠在PVDF膜聚集OTA-OVA量的多少判断样品中的OTA含量方法为：

将封闭好的PVDF膜浸入免疫磁珠-OTA混合液中，在水平摇床上室温反应；取出PVDF膜，PBST洗涤3次，样品中的OTA含量越高，能够与膜上OTA-OVA聚集结合的磁珠量越少；洗去未结合的磁珠，判断结果。