CN110687280A - 一种用于检测乙二胺四乙酸盐的免疫磁珠的制备方法及其制备的免疫磁珠 - Google Patents
一种用于检测乙二胺四乙酸盐的免疫磁珠的制备方法及其制备的免疫磁珠 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110687280A CN110687280A CN201910970803.2A CN201910970803A CN110687280A CN 110687280 A CN110687280 A CN 110687280A CN 201910970803 A CN201910970803 A CN 201910970803A CN 110687280 A CN110687280 A CN 110687280A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- magnetic
- earle
- beads
- immunomagnetic beads
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000011324 bead Substances 0.000 title claims abstract description 134
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 45
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 title claims abstract description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 31
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 claims description 52
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 claims description 42
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 claims description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 23
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 19
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 14
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 14
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M sodium bicarbonate Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 13
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 10
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims description 9
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- BDOYKFSQFYNPKF-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;sodium Chemical compound [Na].[Na].OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O BDOYKFSQFYNPKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229940009662 edetate Drugs 0.000 claims description 4
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 25
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 56
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 13
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 10
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 8
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 6
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 5
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102000030523 Catechol oxidase Human genes 0.000 description 2
- 108010031396 Catechol oxidase Proteins 0.000 description 2
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- LXAHHHIGZXPRKQ-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-2-methylpyridine Chemical compound CC1=CC=C(F)C=N1 LXAHHHIGZXPRKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219498 Alnus glutinosa Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005536 corrosion prevention Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于化学检测技术领域，公开了一种用于检测乙二胺四乙酸盐免疫磁珠的制备方法及制备的免疫磁珠。免疫磁珠制备方法如下：（1）取磁珠，洗涤后用缓冲液悬浮，得到磁珠悬液；（2）向磁珠悬液中加入乙二胺四乙酸盐单克隆抗体溶液，震荡混匀，10～45℃偶联活化20～120min，然后置于磁力架静置分层，弃上清，得到磁珠‑抗体复合物；（3）向磁珠‑抗体复合物中加入缓冲液使悬浮，再加入封闭液，室温孵育后于磁力架上静置分层，得到免疫磁珠。本发明制备的免疫磁珠特异性强，灵敏度高，能快速与待测样品溶液中的乙二胺四乙酸盐特异性结合，快速富集待测样品中乙二胺四乙酸盐，极大地提高了乙二胺四乙酸盐的检出限和检测准确性。
Description
技术领域
本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种用于检测乙二胺四乙酸盐的免疫磁珠的制备方法及其制备的免疫磁珠。
背景技术
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)被列为国家食品安全标准GB2760-2014《食品添加剂使用标准》中允许使用的食品添加剂，有防腐、稳定、抗氧化、凝固的作用，可以被用于饮料制品、乳制品、酱腌菜、罐头及果脯等食品中。由于乙二胺四乙酸可与钙、镁等人体所必需的微量金属形成螯合物，长期过量摄入会在一定程度上导致人体中微量金属元素流失，对人体造成伤害，而且EDTA-Na2对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道会产生刺激作用，如果长期大量食用EDTA-Na2超标的食品，则对人体健康产生不良影响，因此，世界各国对于食品添加剂的EDTA-Na2均有严格的限量规定，我国食品安全标准GB2760-2014规定了EDTA-Na2作为食品添加剂的使用原则，允许使用的品种、使用范围及最大使用量或残留量。其中，最大使用限量为0.25g/kg，可用于果脯、蔬菜罐头、杂粮罐头等食品类别，在允许使用EDTA-Na2作为食品添加剂的食品品种中，并不包含面粉及其制品。面粉及其制品在制作完成后会出现酶促褐变现象，影响产品营养成分和感官品质。为延缓面粉制成品的褐变过程，一些面粉生产及加工企业通常会加入EDTA-Na2、柠檬酸、抗坏血酸等多酚氧化酶抑制剂作用于多酚氧化酶上的铜离子，降低酶活性，减缓酶促褐变过程。相关法规规定，将EDTA-Na2应用于面粉及其制品中属于超范围使用。
目前，食品中乙二胺四乙酸盐的检测方法包括气相色谱法、高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法等；标准方法有GB5009.278-2016和SN/T 3855-2014，但是上述检测方法均不包括面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸盐的检测。目前没有用于检测面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二钠的参照标准。而且，上述的乙二胺四乙酸二钠检测方法操作步骤复杂，费时，特异性差，检测灵敏度低；尤其是当待测样品中EDTA-Na2含量较低时，检测结果误差较大，准确性低。因此，迫切需要建立一种快速、准确、可靠的检测食品中乙二胺四乙酸二钠的方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种用于检测乙二胺四乙酸盐的免疫磁珠的制备方法及其制备的免疫磁珠。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于检测乙二胺四乙酸二钠免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
(1)取磁珠，洗涤后用缓冲液将磁珠悬浮，得到磁珠悬液；
(2)向步骤(1)制得的磁珠悬液中加入乙二胺四乙酸盐单克隆抗体溶液，震荡混合均匀，在10～45℃偶联活化反应20～120min，然后置于磁力架静置分层，弃上清，得到磁珠-抗体复合物；
(3)向步骤(2)制备的磁珠-抗体复合物中加入缓冲液使悬浮，然后再加入封闭液，室温孵育后于磁力架上静置分层，弃上清，得到免疫磁珠；
其中，所述缓冲液为含Tween-20的Earle’s BSS溶液。
根据上述的制备方法，优选地，所述Earle’s BSS溶液的pH为6.8～8.0，Earle’sBSS溶液中Tween-20的浓度为0.025g/L。
根据上述的制备方法，优选地，所述Earle’s BSS溶液是由NaCl、KCl、 Na2HPO4、KH2PO4、CaCL2、MgSO4、葡萄糖、NaHCO3、Tween-20和水组成的混合溶液，所述Earle’s BSS溶液中各组分的浓度分别为：NaCl为6.8g/L，KCl 为0.4g/L，Na2HPO4为0.11g/L，KH2PO4为0.14g/L，CaCL2为0.2g/L，MgSO4为0.1g/L，葡萄糖为1.0g/L，NaHCO3为2.0g/L，Tween-20为0.025g/L。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(3)中所述封闭液的用量为磁珠-抗体复合物总重的10％，所述封闭液为血清蛋白溶液或卵清蛋白溶液；更加优选地，所述血清蛋白溶液的质量分数为5％，所述卵清蛋白溶液的浓度为2％。
根据上述的制备方法，优选地，所述血清蛋白为人血清蛋白或牛血清蛋白。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(2)中，所述乙二胺四乙酸盐单克隆抗体溶液的浓度为0.1～0.5mg/ml，所述乙二胺四乙酸盐单克隆抗体溶液与磁珠悬液的体积比为1:1。更加优选地，所述乙二胺四乙酸盐单克隆抗体溶液的浓度为0.1mg/ml。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(1)中所述洗涤的具体操作为：向磁珠中加入Earle’s BSS溶液，经混合、振荡后置于磁力架上静置分层，弃上清，得到洗涤后的磁珠。更加优选地，所述洗涤次数为2～3次。
根据上述的制备方法，优选地，所述磁珠为商品化的磁珠(羧基磁珠，已加 EDC和NHS活化)；所述乙二胺四乙酸盐为乙二胺四乙酸二钠；所述乙二胺四乙酸盐单克隆抗体为乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(2)中，在偶联活化反应前，需对磁珠与乙二胺四乙酸盐单克隆抗体溶液的混合物进行水浴热处理、离心处理，离心后弃上层清液，然后用缓冲液对下层样品洗涤，洗涤后再用缓冲液对下层样品悬浮，悬浮后进行偶联活化反应；其中，所述水浴热处理的温度为40～45℃，时间为2～4min；所述离心温度为4℃，转速为6000rpm，离心时间为1min～6min；所述缓冲液为含Tween-20的Earle’s BSS溶液。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(2)中所述乙二胺四乙酸盐单克隆抗体溶液使用前采用孔径为0.22μm的过滤器进行过滤。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(2)中偶联活化的温度为37℃，时间为20min。
根据上述的制备方法，优选地，所述Earle’s BSS溶液配制方法为：称取 NaCl6.8g、KCl 0.4g、Na2HPO4.7H2O 0.2g、KH2PO4 0.14g、CaCL2.2H2O 0.265g、 MgSO4.7H2O 0.2g、葡萄糖1.0g、NaHCO3 2.0g，将上述各物质溶于800ml蒸馏水中，再加入500μL 0.05％Tween-20，用NaOH调节溶液的pH值至7.0，最后加蒸馏水定容至1L，即得Earle’s BSS溶液。
一种利用上述制备方法制备的免疫磁珠；该免疫磁珠能够用于检测乙二胺四乙酸盐。
本发明制备的免疫磁珠用于检测乙二胺四乙酸盐的原理为：本发明制备的免疫磁珠偶联有乙二胺四乙酸盐单克隆抗体，乙二胺四乙酸盐单克隆抗体能够与抗原(乙二胺四乙酸盐)特异性结合，将免疫磁珠与待测样品溶液混合，如果待测样品溶液中存在相应抗原，免疫磁珠就会特异性地捕获、吸附待测样品中的抗原，形成抗原-免疫磁珠复合物，然后在适当的磁场条件下分离出来，达到富集待测样品中乙二胺四乙酸盐的目的，解决了乙二胺四乙酸盐量少不易检出的问题，提高加乙二胺四乙酸盐的检出限，进一步提高了检测结果的准确性。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
(1)本发明中Earle’s BSS溶液是由NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、CaCL2、 MgSO4、葡萄糖、NaHCO3、Tween-20和水组成的混合溶液，与传统的厄尔平衡盐溶液或PBS缓冲液相比，本发明中Earle’s BSS溶液能够提供更稳定的离子环境和更强的pH缓冲能力，能够更好的保护和稳定磁珠，而且，溶液中含有 Tween-20，Tween-20能够提高磁珠与乙二胺四乙酸盐单克隆抗体的特异性结合，降低非特异性结合，提高制备的免疫磁珠的稳定性，同时Tween-20还具有良好的洗涤功效，能有效除去免疫磁珠中的杂质，制备得到的免疫磁珠杂质少，纯度高，有效避免了免疫磁珠中杂质对乙二胺四乙酸二钠检测的干扰，提高了乙二胺四乙酸二钠检测结果的准确性。
(2)本发明在磁珠与单克隆抗体偶联活化反应结束后，向磁珠-抗体复合物中加入了血清蛋白或卵清蛋白封闭液，血清蛋白或卵清蛋白能够与磁珠结合，起到封闭磁珠的作用，能够防止制备的免疫磁珠与待测样品中蛋白类杂质结合，有效解决了利用免疫磁珠富集待测样品中乙二胺四乙酸盐时，存在免疫磁珠与待测样品中的蛋白类杂质结合，导致免疫磁珠对乙二胺四乙酸盐的富集效果差，存在杂质较多干扰乙二胺四乙酸盐的检测等问题，降低了非特异性背景对乙二胺四乙酸检测的影响，极大地提高了乙二胺四乙酸二钠检测结果的准确性。此外，血清蛋白或卵清蛋白是酶的稳定剂，能够进一步促进抗体与磁珠紧密结合，提供磁珠与抗体结合的稳定性。
(3)本发明偶联活化处理选择在10℃～45℃偶联活化10～40min，该偶联活化条件下，能得到去除杂蛋白，得到纯度较高的免疫磁珠，而且，乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体的活性高，有利于乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体与磁珠的快速特异性结合。如果偶联活化温度过高，时间过长，可能会导致单克隆抗体失活，偶联活化温度过低，单克隆抗体可能与磁珠结合不紧密，制得的免疫磁珠无法起到富集乙二胺四乙酸二钠的作用。
(4)本发明在磁珠上偶联乙二胺四乙酸单克隆抗体，与多克隆抗体相比，偶联单克隆抗体制备的免疫磁珠具有更高的稳定性和特异性，能够快速与待测样品中的乙二胺四乙酸二钠特异性结合，达到快速富集待测样品中乙二胺四乙酸二钠的目的，提高乙二胺四乙酸二钠的检出率；而且，本发明乙二胺四乙酸单克隆抗体溶液在使用前采用微孔过滤器(0.22μm)进行过滤，减少了抗体中的杂质，使抗体更加纯化，制备得到的免疫磁珠杂质少，纯度高，有效避免了免疫磁珠中杂质对检测结果的干扰，提高了乙二胺四乙酸二钠检测结果的准确性
(5)本发明首先将磁珠与乙二胺四乙酸单克隆抗体混匀，然后经短暂的水浴热处理(热处理温度为40-45℃，时间为2-4min)后进行低温离心，水浴后低温快速离心处理，能够进一步除去磁珠和抗体中的杂质，使样品中的目标物更加纯净，极大地降低了制得的免疫磁珠中杂质的含量，制备得到的免疫磁珠杂质少，纯度高，有效避免了免疫磁珠中杂质对乙二胺四乙酸二钠检测的干扰，提高了乙二胺四乙酸二钠检测的准确性。
(6)本发明制备的免疫磁珠特异性强，灵敏度高，能够快速与待测样品溶液中的乙二胺四乙酸二钠特异性结合，达到快速富集待测样品中乙二胺四乙酸二钠的目的，解决了现有检测方法对低含量目标物检测存在的灵敏度低，检测结果不准确，误差大的问题；极大地提高了乙二胺四乙酸二钠的检出限和检测准确性。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。
实施例1：缓冲液的筛选
取四份200μL磁珠，分别置于四个离心管中，震荡1min后置于磁力架；分别向四个离心管中加入400μL的ddH2O、PBS、Earle’s BSS溶液(pH 7.0)、碳酸盐缓冲液，再分别向每个离心管中加入200μL浓度为0.1mg/mL的乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体溶液，震荡混合均匀，然后将四个离心管置于振荡器上30℃反应4h，置于磁力架上静置分层，分离上层清液，用紫外分光光度计测定上层清液中乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体浓度。其中，所述Earle’sBSS溶液是由NaCl、 KCl、Na2HPO4、KH2PO4、CaCL2、MgSO4、葡萄糖、NaHCO3、Tween-20和水组成的混合溶液，Earle’s BSS溶液中各组分的浓度分别为：NaCl为6.8g/L，KCl 为0.4g/L，Na2HPO4为0.11g/L，KH2PO4为0.14g/L，CaCL2为0.2g/L，MgSO4为0.1g/L，葡萄糖为1.0g/L，NaHCO3为2.0g/L，Tween-20为0.025g/L。实验结果如表1所示。
表1磁珠偶联抗体过程缓冲液的筛选
由表1可知，在反应条件相同的情况下，采用不同的缓冲液作为反应介质时，磁珠与单克隆抗体的偶联量具有明显区别，其中，采用Earle’s BSS溶液为反应介质时，反应4h后上清液中单克隆抗体浓度最低，这说明磁珠吸附单克隆抗体的量最多。因此，选用Earle’s BSS溶液作为最佳的缓冲液。
实施例2：缓冲液pH的筛选
取四份200μL磁珠，分别置于四个离心管中，震荡1min后置于磁力架，分别向四个离心管中加入400μL pH分别为6.8、7.0、7.4、8.0的Earle’s BSS溶液，再分别向每个离心管中加入200μL浓度为0.1mg/mL的乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体，震荡混合均匀，然后将四个离心管置于振荡器上30℃反应4h，置于磁力架上静置分层，分离上层清液，用紫外分光光度计测定上层清液中单克隆抗体浓度。其中，Earle’s BSS溶液是由NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、CaCL2、MgSO4、葡萄糖、NaHCO3、Tween-20和水组成的混合溶液，Earle’s BSS溶液中各组分的浓度与实施例1相同。实验结果如表2所示。
表2缓冲液最佳pH和反应时间的筛选
由表2可知，在单克隆抗体用量相同、反应条件相同的情况下，采用不同 pH的Earle’s BSS溶液作为反应介质时，磁珠与单克隆抗体的偶联量具有明显区别。在反应时间相同的情况下，以pH 7.0的Earle’s BSS作为反应介质时，上清中抗体浓度均最低，这说明磁珠吸附单克隆抗体的量最多。因此，Earle’s BSS 溶液的pH优选为7.0。以pH 7.0的Earle’s BSS作为反应介质时，反应4h后，上清中抗体浓度最低，但是，反应时间过长，效率低；在反应2h后，上清中的抗体含量仅有60.25μg/mL，反应体系中大部分的单克隆抗体已被磁珠吸附，因此，反应时间选为2h。
实施例3：偶联活化反应温度的筛选
取六份200μL磁珠，分别置于六个离心管中，震荡1min后置于磁力架，分别向六个离心管中加入pH 7.0的Earle’s BSS溶液，加入量为400μL，然后再分别向每个离心管中加入200μL浓度为0.1mg/mL的乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体，震荡混合均匀，然后将六个离心管分别置于10℃、20℃、25℃、30℃、37℃和 45℃下反应，反应2h后将各离心管置于磁力架上静置分层，分离上层清液，并紫外分光光度计测定上层清液中乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体的浓度。其中，所述Earle’s BSS溶液是由NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、CaCL2、MgSO4、葡萄糖、NaHCO3、Tween-20和水组成的混合溶液，所述Earle’s BSS溶液中各组分的浓度分别为：NaCl为6.8g/L，KCl为0.4g/L，Na2HPO4为0.11g/L，KH2PO4为0.14g/L，CaCL2为0.2g/L，MgSO4为0.1g/L，葡萄糖为1.0g/L，NaHCO3为 2.0g/L，Tween-20为0.025g/L。实验结果如表3所示。
表3偶联活化反应温度筛选实验结果
由表3可知，不用的偶联活化反应温度，磁珠与单克隆抗体的偶联量具有明显区别。在反应时间相同的情况下，以偶联活化反应温度为37℃时，上清中抗体浓度均最低，这说明磁珠吸附单克隆抗体的量最多。因此，偶联活化反应的反应温度优选为37℃。
实施例4：偶联活化反应时间的筛选
取五份200μL磁珠，分别置于五个离心管中，震荡1min后置于磁力架，分别向五个离心管中加入pH 7.0的Earle’s BSS溶液，加入量为400μL，然后再分别向每个离心管中加入200μL浓度为0.1mg/mL的乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体，震荡混合均匀，然后将五个离心管置于37℃分别反应20min、40min、60min、 90min、120min，反应结束后将各离心管置于磁力架上静置分层，分离上层清液，用紫外分光光度计测定上清液中乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体的浓度。其中，所述Earle’s BSS溶液是由NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、CaCL2、MgSO4、葡萄糖、NaHCO3、Tween-20和水组成的混合溶液，所述Earle’s BSS溶液中各组分的浓度与实施例1相同。实验结果如表4所示。
表4偶联活化反应时间筛选实验结果
由表4可看出，磁珠与菌液的最佳偶联活化反应时间为120min，结合时间过长或过短，都会增加非特异性反应。因此，选用120min作为磁珠偶联抗体的最佳时间。
实施例5：乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体浓度的筛选
取五份200μL磁珠，分别置于五个离心管中，震荡1min后置于磁力架，分别向五个离心管中加入pH 7.0的Earle’s BSS溶液，加入量为400μL，然后向五个离心管中分别加入200μL浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、 0.5mg/mL的乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体，震荡混合均匀，40℃水浴处理3min，然后在4℃6000rpm条件下离心5min，弃上层清液，用Earle’s BSS溶液洗涤下层样品两次，洗涤后再次用400μL Earle’s BSS溶液对下层样品悬浮；然后将五个离心管置于37℃反应2h，反应结束后将各离心管置于磁力架上静置分层，弃上层清液，得到磁珠-抗体复合物；向抗体-磁珠复合物中加入400μL Earle’sBSS 溶液重悬使悬浮，然后再加入质量分数为5％牛血清蛋白溶液，牛血清蛋白溶液的加入量为抗体-磁珠复合物重量的10％，室温孵育20min后于磁力架上静置分层，弃上清，下层样品用Earle’s BSS溶液洗涤重悬，得到五种免疫磁珠。其中，所述Earle’s BSS溶液是由NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、CaCL2、MgSO4、葡萄糖、NaHCO3、Tween-20和水组成的混合溶液，所述Earle’s BSS溶液中各组分的浓度与实施例1相同。
上述制备的5种免疫磁珠各取100μL，然后向五种免疫磁珠中分别加入50μL 乙二胺四乙酸二钠溶液(2.0μg/mL)，室温混旋孵育20min，置于磁力架上静置分层，分离上层清液，采用GB5009.278-2016中记载的液相色谱法检测上层清液中乙二胺四乙酸二钠溶液的浓度。然后根据捕获率计算公式计算上述制备的五种免疫磁珠对乙二胺四乙酸二钠的捕获率，具体实验结果参见表5所示。
捕获率的计算公式为：捕获率＝(乙二胺四乙酸二钠初始浓度-上层清液中乙二胺四乙酸二钠浓度)/乙二胺四乙酸二钠初始浓度×100％，其中，乙二胺四乙酸二钠初始浓度为乙二胺四乙酸二钠溶液加入免疫磁珠中后形成的混合物中乙二胺四乙酸二钠的浓度(0.667μg/mL)。
表5乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体筛选实验结果
由表5可知，乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体浓度为0.1mg/mL时，制备的免疫磁珠对乙二胺四乙酸二钠的亲和力最高，对乙二胺四乙酸二钠的捕获率达到 78.84％；继续增加抗体浓度，制备的免疫磁珠对乙二胺四乙酸二钠的捕获率无明显增加，表明磁珠上的抗体量饱和，因此选择0.1mg/mL作为乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体的优选浓度。
实施例6：封闭液对制备的免疫磁珠性能影响的探究
取六支离心管，六支离心管中均加入200μL磁珠，震荡1min后置于磁力架，向每个离心管中加入400μL pH 7.0的Earle’s BSS溶液和200μL浓度为0.1mg/mL 的乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体，震荡混合均匀，40℃水浴处理3min，然后在4℃ 6000rpm条件下离心5min，弃上层清液，用Earle’s BSS溶液洗涤下层样品两次，洗涤后再次用400μL Earle’s BSS溶液对下层样品悬浮；然后将六个离心管置于 37℃反应2h，反应结束后将各离心管置于磁力架上静置分层，弃上层清液，得到磁珠-抗体复合物；向六个离心管的抗体-磁珠复合物中加入400μL Earle’s BSS 溶液重悬使悬浮，然后向其中5个离心管中加入占抗体-磁珠复合物重量的10％的牛血清蛋白(牛血清蛋白的质量分数为5％)，5个离心管中牛血清蛋白溶液的浓度分别为1％、3％、5％、10％；室温孵育20min后于磁力架上静置分层，弃上清，下层样品用Earle’s BSS溶液洗涤重悬，得到六种免疫磁珠。其中，所述 Earle’s BSS溶液是由NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、CaCL2、MgSO4、葡萄糖、 NaHCO3、Tween-20和水组成的混合溶液，所述Earle’s BSS溶液中各组分的浓度与实施例1相同。
上述制备的6种免疫磁珠各取100μL，然后向六种免疫磁珠中分别加入50μL 乙二胺四乙酸二钠溶液(2.0μg/mL)，室温混旋孵育20min，置于磁力架上静置分层，分离上层清液，采用GB5009.278-2016中记载的液相色谱法检测上层清液中乙二胺四乙酸二钠溶液的浓度。然后根据捕获率计算公式计算上述制备的六种免疫磁珠对乙二胺四乙酸二钠的捕获率，具体实验结果参见表6所示。
捕获率的计算公式为：捕获率＝(乙二胺四乙酸二钠初始浓度-上层清液中乙二胺四乙酸二钠浓度)/乙二胺四乙酸二钠初始浓度×100％，其中，乙二胺四乙酸二钠初始浓度为乙二胺四乙酸二钠溶液加入免疫磁珠中后形成的混合物中乙二胺四乙酸二钠的浓度(0.667μg/mL)。
表6封闭液对制备的免疫磁珠性能的影响
由表6可知，不添加牛血清蛋白进行封闭的免疫磁珠，其对乙二胺四乙酸二胺的捕获率仅有38.21％，捕获率极低；采用牛血清蛋白封闭的免疫磁珠，捕获率均在50％以上，，其中采用5％的牛血清蛋白进行封闭，制备的免疫磁珠对乙二胺四乙酸二钠的捕获率可达到81.56％，故选取5％的牛血清蛋白作为免疫磁珠的封闭液。
实施例7：利用本发明制备的免疫磁珠对市售面粉制品进行检测
取离心管中均加入200μL磁珠，震荡1min后置于磁力架，向离心管中加入 400μLpH 7.0的Earle’s BSS溶液和200μL浓度为0.1mg/mL的乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体，震荡混合均匀，40℃水浴处理3min，然后在4℃6000rpm条件下离心5min，弃上层清液，用Earle’sBSS溶液洗涤下层样品两次，洗涤后再次用 400μL Earle’s BSS溶液对下层样品悬浮；然后将离心管置于37℃反应2h，反应结束后将离心管置于磁力架上静置分层，弃上层清液，得到磁珠-抗体复合物；向离心管的抗体-磁珠复合物中加入400μL Earle’s BSS溶液重悬使悬浮，然后再加入占抗体-磁珠复合物重量的10％的牛血清蛋白(牛血清蛋白的质量分数为5％)，室温孵育20min后于磁力架上静置分层，弃上清，下层样品用Earle’s BSS 溶液洗涤重悬，得到免疫磁珠。
利用上述制备的免疫磁珠对市售的面粉、面条、饺子皮等90份面粉及制品进行测定。具体的测定方法为：取5g待测样品，加入25mL无菌水，用均质机粉碎，涡旋混匀，超声20min，7500r/min离心5min，取上清液置于50mL容量瓶中。剩余残渣重复提取一次，离心后合并上清液，加水定容至50mL，得到样品待测液。取上述制备的免疫磁珠100μL置于离心管中，向其中加入1mL样品待测液，室温混旋孵育20min，孵育过程中免疫磁珠捕获样品待测液中的乙二胺四乙酸二钠形成复合物。然后，将离心管置于磁力架上磁分离3min(在外加磁场的作用下游离的免疫磁珠和免疫磁珠-乙二胺四乙酸二钠复合物聚集在离心管壁上形成沉淀)，弃上层清液，收集下层样品，采用GB5009.278-2016中的液相色谱法进行检测下层样品中乙二胺四乙酸二钠或其钠盐的含量。经检测发现，90 份待测样品中，有2份面粉检出乙二胺四乙酸二钠，其含量为10～18mg/kg；1 份面条和一份饺子皮中均检出乙二胺四乙酸二钠，含量为20mg/kg；其余样品中未检出。由此说明，采用本发明制备的免疫磁珠能有效富集待测样品(尤其是一些难以直接采用GB5009.278-2016中规定方法直接检测的样品)中乙二胺四乙酸二钠，并用于乙二胺四乙酸二钠的检测，极大地提高了待测样品中乙二胺四乙酸钠盐的检出限和检测准确性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测乙二胺四乙酸盐的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取磁珠，洗涤后用缓冲液将磁珠悬浮，得到磁珠悬液；
（2）向步骤（1）制得的磁珠悬液中加入乙二胺四乙酸盐单克隆抗体溶液，震荡混合均匀，在10～45℃偶联活化反应20～120min，然后置于磁力架静置分层，弃上层清液，得到磁珠-抗体复合物；
（3）向步骤（2）制备的磁珠-抗体复合物中加入缓冲液使悬浮，然后再加入封闭液，室温孵育后于磁力架上静置分层，弃上清，得到免疫磁珠；
其中，所述缓冲液为含Tween-20的Earle’s BSS溶液。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Earle’s BSS溶液的pH为6.8～8.0，Earle’s BSS溶液中Tween-20的浓度为0.025g/L。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述Earle’s BSS溶液是由NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、CaCL2、MgSO4、葡萄糖、NaHCO3、Tween-20和水组成的混合溶液，所述Earle’s BSS溶液中各组分的浓度分别为：NaCl为6.8g/L，KCl为0.4g/L，Na2HPO4为0.11g/L，KH2PO4为0.14g/L，CaCL2为0.2g/L，MgSO4为0.1g/L，葡萄糖为1.0g/L，NaHCO3为2.0 g/L，Tween-20为0.025g/L。
4.根据权利要求1～3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述封闭液的用量为磁珠-抗体复合物总重的10%；所述封闭液为血清蛋白溶液或卵清蛋白溶液，所述血清蛋白溶液的质量分数为5%，所述卵清蛋白溶液的浓度为2%。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乙二胺四乙酸盐单克隆抗体溶液的浓度为0.1～0.5mg/ml，所述乙二胺四乙酸盐单克隆抗体溶液与磁珠悬液的体积比为1:1。
6. 根据权利要求1或2或3或5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述洗涤的具体操作为：向磁珠中加入Earle’s BSS溶液，经混合、振荡后置于磁力架上静置分层，弃上清，得到洗涤后的磁珠。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述磁珠为商品化的磁珠；所述乙二胺四乙酸盐为乙二胺四乙酸二钠；所述乙二胺四乙酸盐单克隆抗体为乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，偶联活化反应前，需对磁珠与乙二胺四乙酸盐单克隆抗体溶液的混合物进行水浴热处理、离心处理，离心后弃上层清液，用缓冲液对下层样品悬浮，悬浮后进行偶联活化反应；其中，所述水浴热处理的温度为40～45℃，时间为2～4min；所述离心温度为4℃，转速为6000rpm，离心时间为1 min～6min。
9.一种利用权利要求1或2或3或5或7或8所述制备方法制备的免疫磁珠。
10.权利要求9所述免疫磁珠在检测乙二胺四乙酸盐中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910970803.2A CN110687280A (zh) | 2019-10-14 | 2019-10-14 | 一种用于检测乙二胺四乙酸盐的免疫磁珠的制备方法及其制备的免疫磁珠 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910970803.2A CN110687280A (zh) | 2019-10-14 | 2019-10-14 | 一种用于检测乙二胺四乙酸盐的免疫磁珠的制备方法及其制备的免疫磁珠 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110687280A true CN110687280A (zh) | 2020-01-14 |
Family
ID=69112368
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910970803.2A Pending CN110687280A (zh) | 2019-10-14 | 2019-10-14 | 一种用于检测乙二胺四乙酸盐的免疫磁珠的制备方法及其制备的免疫磁珠 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110687280A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101865924A (zh) * | 2010-06-26 | 2010-10-20 | 上海交通大学 | 基于免疫磁珠联合酶联免疫吸附试验检测伏马毒素的方法 |
| CN102426222A (zh) * | 2011-09-05 | 2012-04-25 | 上海海洋大学 | 快速检测ttx的磁性免疫层析方法及检测试纸条的制备 |
| CN103756967A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-30 | 卢英 | 抗hla-g的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用 |
| CN104388549A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-03-04 | 广西医科大学 | 适配体磁富集和rca双信号放大检测肿瘤细胞方法及应用 |
| CN106468712A (zh) * | 2016-09-26 | 2017-03-01 | 海南大学 | 基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素a方法 |
| CN109387499A (zh) * | 2017-08-08 | 2019-02-26 | 华东师范大学 | 一种pd-l1探针及其制备方法和应用 |
| WO2019174127A1 (zh) * | 2018-03-10 | 2019-09-19 | 广东省实验动物监测所 | 一种多重液相芯片检测方法及试剂盒 |
-
2019
- 2019-10-14 CN CN201910970803.2A patent/CN110687280A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101865924A (zh) * | 2010-06-26 | 2010-10-20 | 上海交通大学 | 基于免疫磁珠联合酶联免疫吸附试验检测伏马毒素的方法 |
| CN102426222A (zh) * | 2011-09-05 | 2012-04-25 | 上海海洋大学 | 快速检测ttx的磁性免疫层析方法及检测试纸条的制备 |
| CN103756967A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-30 | 卢英 | 抗hla-g的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用 |
| CN104388549A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-03-04 | 广西医科大学 | 适配体磁富集和rca双信号放大检测肿瘤细胞方法及应用 |
| CN106468712A (zh) * | 2016-09-26 | 2017-03-01 | 海南大学 | 基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素a方法 |
| CN109387499A (zh) * | 2017-08-08 | 2019-02-26 | 华东师范大学 | 一种pd-l1探针及其制备方法和应用 |
| WO2019174127A1 (zh) * | 2018-03-10 | 2019-09-19 | 广东省实验动物监测所 | 一种多重液相芯片检测方法及试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Handa et al. | Incidence of Listeria monocytogenes in raw seafood products in Japanese retail stores | |
| CA2752126A1 (en) | Allergen detection method using immunochromatography | |
| CN108982842A (zh) | 一种应用免疫磁珠技术的玉米赤霉烯酮前处理试剂盒 | |
| CN113801855B (zh) | 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体t102及其在富集分离沙门氏菌中的应用 | |
| CN110687280A (zh) | 一种用于检测乙二胺四乙酸盐的免疫磁珠的制备方法及其制备的免疫磁珠 | |
| CN103698504B (zh) | 邻苯二甲酸酯类总量elisa酶联免疫检测试剂盒及其使用方法 | |
| CN110007078A (zh) | 一种脱氧雪腐镰刀烯醇的样本前处理试剂盒 | |
| Jung et al. | Evaluation of antibodies for immunomagnetic separation combined with flow cytometry detection of Listeria monocytogenes | |
| CN102707064B (zh) | 一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法 | |
| CN106442817A (zh) | 一种食品中霉菌的检测方法 | |
| Ito et al. | Improved 4-aminoantipyrine colorimetry for detection of residual hydrogen peroxide in noodles, fish paste, dried fish, and herring roe | |
| CN104726534B (zh) | 一种快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法 | |
| CN113189324A (zh) | 一种封闭试剂及利用其封闭免疫反应载体的方法 | |
| CN112858508A (zh) | 一种咖啡制品中糠醛类化合物的测定方法 | |
| Goryacheva et al. | Immunoaffinity pre-concentration combined with on-column visual detection as a tool for rapid aflatoxin M1 screening in milk | |
| CN103018090A (zh) | 一种检测乳饮料的总砷含量的前处理方法及检测方法 | |
| CN109900825A (zh) | 玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法 | |
| CN109870517A (zh) | 霉菌毒素吸附剂吸附效果评估方法 | |
| Jiang et al. | Role of pepstatin-sensitive proteases on the postmortem changes of tilapia (Tilapia nilotica. times. Tilapia aurea) muscle myofibrils | |
| CN104280498A (zh) | 一种乳制品中乳铁蛋白的检测试剂盒及检测方法 | |
| CN109142579A (zh) | 一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法 | |
| CN115057916A (zh) | 一种马氏珠母贝肉抗氧化多肽及其制备方法与应用 | |
| CN108546680A (zh) | 一种麦胚清蛋白诱导肝癌细胞分泌外泌体的方法 | |
| CN107561269A (zh) | 一种沙丁胺醇的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法 | |
| CN113080422A (zh) | 一种复合精油调味汁在脱除鱼腥味方面的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200114 |