CN109900825A - 玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，其中，分离方法中采用非极性乙酸乙酯和正己烷等体积混合试剂作为萃取剂，与常规萃取剂相比，本发明的萃取剂更便宜、更环保并且获得的萃取液更干净；采用硅藻土与乙二胺‑N‑丙基硅烷键合相硅胶等质量混合试剂作为吸附剂，该吸附剂在非极性体系中吸附分析物，除脂量大，萃取液中脂肪含量对萃取效率几乎无影响，可见该分离方法扩大了高脂肪类固体样品中霉菌毒素萃取剂的选择，选择合适的溶剂并对混合吸附剂进行优化，这在提高高脂肪类固体样品中霉菌毒素的萃取和净化效率方面很有前景。

Description

玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测 方法

技术领域

本发明涉及一种霉菌毒素的分离检测方法，具体涉及玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，属于检测技术领域。

背景技术

1960年，英国发生约10万只火鸡因黄曲霉毒素急性中毒死亡事件，次年证实黄曲霉毒素具有严重的致癌性，此后，霉菌毒素引起了人们的广泛注意。

霉菌毒素，又叫真菌毒素，是由一些霉菌(主要包括曲霉属、青霉属及镰孢属)在生长成熟后产生的一系列有毒的次级代谢产物。根据霉菌生长环境的不同，霉菌毒素可分为田间毒素和仓储毒素两类。霉菌的鉴定和分类在传统上以形态和培养特征为主要依据，但霉菌的形态特征复杂，其形态研究也因没有标准、没有共同的表述及具有较大的人为主观性而经常受到质疑。

常见的霉菌毒素主要有AFB₁、ZEN、DON、FUM、赫曲霉毒素(OTA)等，其中，对粮食污染较为严重且对畜禽健康影响较为严重的主要是AFB₁、ZEN、DON。霉菌毒素是真菌的天然有毒次生代谢物，能够干扰许多器官和系统，尤其是肝、肾、神经系统、内分泌系统和免疫系统，引发人类和动物疾病。霉菌毒素在生产上严重危害着畜禽的健康，间接危害着人类的健康，并给畜禽企业造成严重的经济损失。因而，建立霉菌毒素快速而有效的检测方法可预防霉菌毒素的污染，降低毒素中毒事件的发生，提升畜产品的质量与安全。

作为人口大国，我国储粮数量大、储期长，而且粮食流通量大，每年北粮南运的运输量约占粮食总产量的10％，跨省流通量约占粮食年产量的30％，粮食流通总量约占粮食年产量的50％。在粮食流通领域，储藏工作显得极其重要。

针对北粮南运数量逐年增加，散粮在集装箱运输过程中的粮食安全问题日益严峻。

水是微生物生存的必须条件，储粮及运输环境的水分条件包括：大气湿度、仓房湿度、粮堆湿度和粮食含水量，其中，粮堆湿度和粮食含水量对粮食微生物的生长发育有直接的影响。干生性霉菌生长的最低相对湿度为65％左右，与之相平衡的粮食水分就是通常所说的“安全水分”。在粮食微生物的区系中，中温性的微生物最多，危害也最大，它们生长的最适温度为20℃～40℃，生长的最低温度为5℃～15℃。因此，对于玉米散粮集装箱运输过程中霉菌生长情况要进行监测和及时测定，以更好的抑制霉菌生长，保证散粮安全。霉菌的存在是产生霉菌毒素的先决条件，霉菌毒素是霉菌的天然有毒的次生代谢物，建立霉菌毒素快速而有效的检测方法可预防霉菌以及其毒素的污染。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，该分离检测方法不仅快速、有效，而且灵敏度高、检出限低、检测效率高。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step1：随机抽取散粮集装箱内的玉米样品，将玉米样品粉碎，用四分法取样；

Step2：准确称取5.000g玉米粉末样品于带盖离心管中，加入16mL体积浓度为0.5％的甲酸水溶液并均质30s，然后剧烈振荡5min，再加入6mL萃取剂和0.3g NaCl，超声5min，样品在0℃以15000rpm离心5min，上清液转移至另一支含有80mg吸附剂的离心管中，搅拌混合1min，然后以15000rpm离心5min，最后将上清液收集至玻璃烧瓶中，其中，前述萃取剂为乙酸乙酯与正己烷等体积混合，前述吸附剂为硅藻土与乙二胺-N-丙基硅烷键合相硅胶等质量混合；

Step3：将玻璃烧瓶中的上清液旋转蒸干，然后用100μL乙腈回溶，再用滤膜过滤，最后用高效液相色谱仪对样品进行分析。

前述的玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，其特征在于，在Step1中，用四分法取样前，保证玉米样品至少有75％的玉米粉末过80目筛网，将通过80目筛网的玉米粉末与未通过80目筛网的玉米粉末混合均匀，然后再取样。

前述的玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，其特征在于，在Step2中，上清液转移至含有吸附剂的离心管中后，混合物在搅拌器中搅拌混合1min。

前述的玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，其特征在于，在Step3中，前述滤膜选用的是PTFE滤膜。

前述的玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，其特征在于，在Step3中，色谱条件为：

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱，150mm×4.6mm i.d.，3.5μm；

柱温：35℃；

流动相A：体积浓度为0.1％的甲酸水溶液；

流动相B：甲醇；

梯度洗脱程序：0.0min→2.0min，5％B；2.0min→10.0min，5％B→50％B；10.0min→12.0min，50％B→60％B；12.0min→25.0min，60％B→90％B；

流速：0.5mL/min；

进样量：10μL。

本发明的有益之处在于：

(1)分离霉菌毒素的方法

将硅藻土与乙二胺-N-丙基硅烷键合相硅胶等质量混合作为吸附剂，该吸附剂具有离子交换能力，且分子结构中带有电极性，所以能够将玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素从高脂肪、高蛋白复杂基质中快速且彻底的分离出来，为后续检测的有效性奠定了基础。

另外，吸附剂在非极性体系中吸附霉菌毒素，所以除脂、除蛋白量大，萃取液中脂肪、蛋白质含量对萃取效率几乎无影响。

(2)检测霉菌毒素的方法

选用体积浓度为0.1％的甲酸水溶液作为流动相A，选用甲醇作为流动相B，流动相是极性的，待检测的霉菌毒素是极性分子，根据极性相似相溶原理，通过适当调节流动相A和流动相B的比例，改变流动相的极性，与流动相极性相近的组分就会一次性被检测出来，所以实现了快速检测玉米中的霉菌毒素。

另外，经验证，该检测方法灵敏度较高，检出限较低，精密度较好，基线稳定，相比其他分析检测方法更具有优势。

附图说明

图1是考察萃取剂的类型和用量对萃取结果的影响的结果图；

图2是考察超声萃取的时间对霉菌毒素回收率的影响的结果图；

图3是考察吸附剂的类型和用量对霉菌毒素回收率的影响的结果图；

图4是玉米粉末样品1的色谱图；

图5是标准对照品的色谱图。

具体实施方式

本发明提供的玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，不仅能够快速且彻底的将霉菌毒素从高脂肪、高蛋白复杂基质中分离出来，而且能够快速且有效的检测出玉米中的霉菌毒素，该分离检测方法的研究是国家重点研发计划(2018YFD0401403)的项目。

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、准备样品

随机抽取集装箱内三个品种玉米样品。

将三个品种玉米样品分别粉碎，保证每个品种玉米样品至少有75％的玉米粉末过80目筛网，将每个品种玉米样品的通过80目筛网的玉米粉末与未通过80目筛网的玉米粉末混合均匀，用四分法取样，最后留3份玉米粉末样品，三个品种玉米样品各1份，分别记为：玉米粉末样品1、玉米粉末样品2、玉米粉末样品3，-20℃下密封保存待测。

二、准备试剂和设备

乙腈、甲醇：色谱纯，美国Thermo-Fisher公司。

甲酸、甲酸铵：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司。

十八烷基硅烷键合相硅胶(C18)、乙二胺-N-丙基硅烷键合相硅胶(PSA)、石墨化碳(GCB)、氨基键合相硅胶(NH₂)：美国Agilent公司。

正己烷、硫酸镁、氯化钠：分析纯，北京试剂厂。

实验所用水均为Milli-Q超纯水。

霉菌毒素对照品：黄曲霉毒素B₁(AFB₁)、黄曲霉毒素B₂(AFB₂)，杂色曲霉素(ST)、黄绿青霉素(CIT)，每种霉菌毒素对照品均用乙腈配制成标准储备液(100μg/mL)，所有的标准储备液在4℃的冰箱中储存，通过用乙腈稀释标准储备液来制得标准工作液(10μg/mL)。

Agligent1260型高效液相色谱仪：美国Agilent公司。

Allegra 64R型高速冷冻离心机：美国贝克曼公司。

Eclipse XDB-C18柱(150mm×4.6mm i.d.，3.5μm)：美国Agilent公司。

预柱(7.5mm×2.1mm I.D.，5μm)：美国Agilent公司。

RE-52AA真空旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。

KQ2200E型超声波水浴清洗器：昆山仪器设备有限公司。

由于霉菌毒素毒性极强，危害身体健康，污染环境，因此在实验过程中需做好防护，避免霉菌毒素与皮肤接触。实验所用容器、操作台以及接触过霉菌毒素的物品须用5％次氯酸钠-丙酮溶液消毒，容器在密闭消毒液中浸泡至少30min，然后再用水洗涤。

三、分离玉米中的霉菌毒素

以分离玉米粉末样品1中的霉菌毒素为例。

我们采用液相萃取-固体吸附剂分散固相萃取玉米中的霉菌毒素，具体如下：

准确称取5.000g(精确至0.001g)玉米粉末样品1于50mL带盖离心管中，加入16mL0.5％(体积浓度)甲酸水溶液并在高速均质器中均质30s，剧烈振荡5min后，加入6mL萃取剂(乙酸乙酯：正己烷＝1：1)和0.3g NaCl，超声5min，样品在0℃以15000rpm离心5min，上清液转移至另一支含有80mg吸附剂(40mg硅藻土+40m乙二胺-N-丙基硅烷键合相硅胶)的离心管中，混合物在搅拌器中混合1min，然后以15000rpm离心5min，最后收集上清液即可。

本发明提供的分离玉米中的霉菌毒素的方法，用乙酸乙酯和正己烷等体积混合试剂作萃取剂，与乙腈相比，乙酸乙酯和正己烷更便宜、更环保并且获得的萃取液更干净。

本发明提供的分离玉米中的霉菌毒素的方法，用少量的NaCl代替盐的混合物，有效的避免了固体样品中的盐结块。

常规的分离玉米中的霉菌毒素的方法，采用吸附剂吸附脂肪，除脂量较少，难以处理脂肪含量大的萃取液。

本发明提供的分离玉米中的霉菌毒素的方法，采用混合吸附剂在非极性体系中吸附分析物——霉菌毒素，除脂量大，萃取液中脂肪含量对萃取效率几乎无影响。

由此可见，本发明提供的分离玉米中的霉菌毒素的方法，扩大了高脂肪类固体样品中霉菌毒素萃取剂的选择，选择合适的萃取剂并对混合吸附剂进行优化，这在提高高脂肪类固体样品中霉菌毒素的萃取和净化效率方面很有前景。

我们将霉菌毒素从玉米中分离出来的目的是检测玉米中霉菌毒素的含量，所以为了方便后续的检测，我们又对收集的上清液进行了浓缩处理，具体如下：

将上清液转移至玻璃烧瓶中，旋转蒸干，然后用100μL溶剂(乙腈)回溶，最后用PTFE滤膜过滤，等待进样分析。

四、分析样品

采用高效液相色谱仪对样品进行分析，色谱条件如下：

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱(150mm×4.6mm i.d.，3.5μm)。

柱温：35℃。

流动相A：0.1％(体积浓度)甲酸水溶液；流动相B：甲醇。

梯度洗脱程序：0.0min→2.0min，5％B；2.0min→10.0min，5％B→50％B；10.0min→12.0min，50％B→60％B；12.0min→25.0min，60％B→90％B。

流速：0.5mL/min。

进样量：10μL。

五、研究萃取条件

在确定上述分离玉米中的霉菌毒素的方法之前，我们对萃取条件做了详细的研究，包括：萃取剂的类型和用量对霉菌毒素萃取回收率的影响、超声萃取的时间对萃取结果的影响、吸附剂的类型和用量对萃取结果的影响。

1、萃取剂的类型和用量对萃取结果的影响

我们实验考察了乙腈(acetonitrile，ACN)、丙酮(acetone，AO)、乙酸乙酯(ethylacetate，EA)、正己烷(hexane，HA)和乙酸乙酯：正己烷(EA/HA，V：V＝1:1)5种萃取剂对霉菌毒素萃取回收率的影响。考察结果如图1所示。

我们对考察结果做了分析，具体如下：

(1)乙腈组(ACN)：由于乙腈极性较强，不能有效地渗透进入高脂肪类样品，不利于对分析物的萃取；

(2)正己烷(HA)组：正己烷是非极性的，虽然能够有效地渗透进入高脂肪类样品，但对极性较强的霉菌毒素的溶解能力有限，导致目标分析物的回收率较低；

(3)乙酸乙酯：正己烷(EA/HA)组：乙酸乙酯便宜、低毒、易蒸发、极性中等、色谱图更干净，乙酸乙酯和正己烷的萃取率较高，在净化步骤中，采用吸附剂从正己烷溶液中吸附分析物，脂肪保留在溶液中，消除了脂肪对分析物萃取的影响，因此，我们最终选定乙酸乙酯和正己烷(EA/HA，V：V＝1:1)作为萃取剂。

我们还实验考察了萃取剂在2.00mL到8.00mL范围内对分析物萃取回收率的影响。考察结果为：随着萃取剂体积的增加，分析物的回收率先增加后基本不变，在6.00mL时分析物的回收率达到最大，为了萃取充分，我们最终选定萃取剂(EA/HA，V：V＝1:1)的用量为6.00mL。

2、超声萃取的时间对霉菌毒素回收率的影响

我们通过在2min到6min内进行单因素实验来评估超声萃取时间对霉菌毒素回收率的影响。结果如图2所示。

由图2可知，当萃取时间从2min增加到5min时，分析物的峰面积明显增大，但当萃取时间继续延长时，回收率基本不再变化。因此，我们最终选定萃取时间为5min。

3、吸附剂的类型和用量对霉菌毒素回收率的影响

霉菌毒素是一类带有极性的分子物质，如黄曲霉毒素便是一种带强阳极性的分子，选择吸附剂时需要分子结构带有电极性，且具有离子交换能力，才能很好的吸附霉菌毒素。

不同的吸附剂，吸附能力也不尽相同，如沸石、膨润土是单极性的，遇水会发生膨胀，只能吸附黄曲霉毒素，同时还会吸附水溶性的营养养分；绿泥石带双极性，具有最佳的阳离子交换平衡，遇水不会发生膨胀，吸附毒素能力强，范围广，不但能吸附黄曲霉毒素，还会吸附呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T－2毒素等多种有害毒素，且不会吸附营养。

我们实验考察了C18、Diatomite(硅藻土)、PSA(乙二胺-N-丙基硅烷键合相硅胶)、中性氧化铝Al₂O₃、Diatomite+PSA)这5种不同吸附剂对霉菌毒素萃取分析物回收率的影响。考察结果如图3所示。

由图3可知，当选择硅藻土和乙二胺-N-丙基硅烷键合相硅胶混合吸附剂(Diatomite/PSA，m:m＝1:1)时，四种霉菌毒素的回收率均最高。因此，我们最终选定吸附剂为硅藻土和乙二胺-N-丙基硅烷键合相硅胶混合吸附剂(Diatomite/PSA，m:m＝1:1)。

我们还实验考察了混合吸附剂的量从0mg增到250mg时对萃取率的影响。考察结果表明：混合吸附剂含量太少的话，不能充分净化，霉菌毒素分析物的回收率随混合吸附剂的量增加而增大，当混合吸附剂量等于80mg时，回收率达到最大，当混合吸附剂的量大于80mg时，回收率略微降低。因此，我们最终选定混合吸附剂的用量为80mg，硅藻土和乙二胺-N-丙基硅烷键合相硅胶各40mg。

六、评价测量方法

1、线性

用上述方法分析添加了霉菌毒素的样品，以峰面积相对于分析物的浓度制作标准曲线。数据的线性以线性相关系数评价。

线性回归方程和相关系数都列在表1中。

表1分析性能

由表1可知，本发明提供的方法能够取得很好的线性，并且全部分析物的相关系数都在0.9975到0.9989范围内，结果令人满意。

2、精密度和萃取平均回收率

日内精密度的检测是通过对加标玉米粉末样品进行5次平行测定得到的。日间精度的检测是通过分析在不同的5天里的加标玉米粉末样品得到的。日内精密度和日间精密度以相对标准偏差(RSDs)表示。继而，就就可以得到萃取平均回收率。

相对标准偏差和萃取平均回收率都列在表2中。

表2样品的分析结果

由表2可知，日内精密度的可接受的标准偏差值范围为1.8-4.3％，日间精密度的可接受的标准偏差值范围为3.2-5.2％，回收率范围为89.7-105.9％。

由此可见，本发明提供的方法具有较好的精密度和萃取平均回收率。

3、检出限和定量下限

检出限(LOD)和定量下限(LOQ)分别是产生3倍和10倍信噪比时对应的最低浓度值。

测量结果见表3。

表3分析性能

由表3可知，四种霉菌毒素的检出限(LOD)范围是3.5-7.2μg/kg，所有分析物的定量下限(LOQ)均低于10μg/kg(即最大残留量)。所以，LOQ适用于本发明提供的检测方法。

4、样品分析

经过对实际样品(玉米粉末样品1)进行分析，我们得到了实际样品的色谱图，如图4所示。

标准对照品的色谱图如图5所示。

由图4和图5可知，本发明提供的检测方法得到了很好的回收率(89.7-105.9％％)和精密度(≤5.2％)。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step1：随机抽取散粮集装箱内的玉米样品，将玉米样品粉碎，用四分法取样；

Step2：准确称取5.000g玉米粉末样品于带盖离心管中，加入16mL体积浓度为0.5％的甲酸水溶液并均质30s，然后剧烈振荡5min，再加入6mL萃取剂和0.3g NaCl，超声5min，样品在0℃以15000rpm离心5min，上清液转移至另一支含有80mg吸附剂的离心管中，搅拌混合1min，然后以15000rpm离心5min，最后将上清液收集至玻璃烧瓶中，其中，所述萃取剂为乙酸乙酯与正己烷等体积混合，所述吸附剂为硅藻土与乙二胺-N-丙基硅烷键合相硅胶等质量混合；

Step3：将玻璃烧瓶中的上清液旋转蒸干，然后用100μL乙腈回溶，再用滤膜过滤，最后用高效液相色谱仪对样品进行分析。

2.根据权利要求1所述的玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，其特征在于，在Step1中，用四分法取样前，保证玉米样品至少有75％的玉米粉末过80目筛网，将通过80目筛网的玉米粉末与未通过80目筛网的玉米粉末混合均匀，然后再取样。

3.根据权利要求1所述的玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，其特征在于，在Step2中，上清液转移至含有吸附剂的离心管中后，混合物在搅拌器中搅拌混合1min。

4.根据权利要求1所述的玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，其特征在于，在Step3中，所述滤膜选用的是PTFE滤膜。

5.根据权利要求1所述的玉米在散粮集装箱运输过程中产生的霉菌毒素的分离检测方法，其特征在于，在Step3中，色谱条件为：

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱，150mm×4.6mm i.d.，3.5μm；

柱温：35℃；

流动相A：体积浓度为0.1％的甲酸水溶液；

流动相B：甲醇；

梯度洗脱程序：0.0min→2.0min，5％B；2.0min→10.0min，5％B→50％B；10.0min→12.0min，50％B→60％B；12.0min→25.0min，60％B→90％B；

流速：0.5mL/min；

进样量：10μL。