CN109061016A - 一种富集生物胺的固相萃取柱的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，包括以下步骤：S1、固相萃取柱的柱管为移液枪枪头，将下筛板置于移液枪枪头的底部；S2、将离心管盖子中部及底部垂直打孔，将固相萃取柱穿过离心管的孔径，固定于离心管中；S3、向柱管中放入固相萃取填料，得固相萃取柱。本发明还公开了所述富集生物胺的固相萃取柱的应用方法，步骤包括：待测样品前处理、活化固相萃取柱、上样、淋洗、洗脱及浓缩干燥洗脱液。本发明制备的的固相萃取柱与通用的固相萃取小柱相比，减少了填料量、样品处理量和有机溶剂的消耗，缩短了样品前处理的时间，节约成本，使得生物胺的检测更为方便、高效。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全检测领域，特别涉及一种富集生物胺的固相萃柱的制备方法与应用。
背景技术
生物胺是低分子量的含氮有机化合物，广泛存在于蛋白质丰富的食品和发酵制品中，如鱼、肉、奶酪、啤酒、葡萄酒等。当人体摄入过量的生物胺，会引起头疼、恶心、心悸等中毒反应，严重时可能危及生命；其中毒性最大的是组胺，酪胺次之，其他生物胺能够增加组胺的毒性。因此对食品中的生物胺进行检测具有现实意义，是确保食品安全的重要指标。
由于生物样品成分复杂，基质干扰严重，一般采取的样品前处理方法包括液液萃取(LLE)，固相萃取(SPE)，固相微萃取(SPME)；其中，固相萃取以其操作简单、回收率高、重复性好、较环保等特点被广泛使用。固相萃取主要是通过固相填料对样品组分的选择性吸附，实现对样品的分离、纯化和富集。常见的固相萃取小柱存在萃取时流速低的问题，需要外借给予一定的压力，影响样品处理效率；同时商业化固相萃取小柱成本较高。苏州赛分科技有限公司2011年申请了“一种新型固相萃取小柱”(申请号：201110165998.7)；江南大学2013年申请了“一种混合填料固相萃取小柱的装填方法及固相萃取小柱”(申请号：201310153658.1)；新会出入境检验检疫局综合技术服务中心2016年申请了“一种固相萃取小柱”(申请号：201620083045.4)。然而这些固相萃取小柱的柱管均是圆形柱管，填料量及样品处理量大，处理时间长。
发明内容
本发明旨在优化固相萃取技术，提供一种填料用量少、生物胺检测样品用量低、节约成本、检测效率高的富集生物胺的固相萃取柱的制备方法与应用，改进现有固相萃取小柱的结构、填充方式和使用方式，以减少填料量、溶剂用量以及样品处理量，并建立高效且可靠的样品前处理方法来监控食品中六种毒性较大的的生物胺。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，包括以下步骤：
S1、将下筛板置于固相萃取柱柱管内部的下方；
S2、将离心管盖子中部及离心管底部垂直打孔，将柱管从上至下依次穿过所述离心管盖子及离心管底部的孔，固定于离心管中，柱管前端露出离心管底部的距离为3～13mm；
S3、向所述柱管中放入固相萃取填料。
优选方式下，步骤S1所述下筛板，孔径为10～60μm，直径为1～5mm，材质为聚乙烯或聚四氟乙烯；所述柱管可通过商业途径获得，为200μl或1000μl移液枪枪头。
优选方式下，S2所述离心管可通过商业途径购买获得；步骤S1所述200μl的柱管，对应步骤S2所述离心管为0.5ml；步骤S1所述1000μl的柱管，对应步骤S2所述离心管为1.5ml；步骤S2所述离心管盖子的孔，孔径与步骤S1所述柱管上部的直径相同。
优选方式下，步骤S3所述固相萃取填料为C18，Thermo HyperSep Retain-CX，Cleanert C8/SCX，Waters Oasis MCX中的一种，添加量为10～200μl。
本发明的另一个目的在于提供一种富集生物胺的方法，包括如下步骤：
S1、生物胺待测样品的前处理：向0.01～1克待测样品中加入100～500μl0.01～1％三氯乙酸水溶液，旋涡震荡1～10min，以5000～15000转/min，离心5～15min，取上清液，得到生物胺待测样品溶液；
S2、取权利要求1至5任一方法制备的富集生物胺的固相萃取柱；
S3、活化固相萃取柱：将所述富集生物胺的固相萃取柱放入tube管中，向萃取柱中加入100～500μl甲醇，500～2000转/min，离心30～200s，弃去tube管底部的流出液；加入100～500μl水进行活化，500～2000转/min，离心30～200s，弃去tube管底部的流出液；
S4、上样：向固相萃取柱中加入10～100μl生物胺待测样品溶液进行上样，1000～8000转/min，离心30～200s，弃去tube管底部的流出液；
S5、淋洗：向固相萃取柱中加入10～100μl 0.1％～3％甲酸溶液(v/v)进行淋洗，1000～8000转/min，离心30～200s，弃去tube管底部的流出液；
S6、洗脱：将固相萃取柱移入新的2ml或5ml tube管中，向固相萃取柱中加入100～500μl 5％～20％氨水甲醇溶液(v/v)进行洗脱，1000～8000转/min，离心30～200s，收集tube管中的洗脱液；
S7：浓缩干燥洗脱液：28～32℃，转速200～500rpm，浓缩离心1～3小时。
优选方式下，步骤S3所述tube管可通过商业途径获得；步骤S2所述柱管为200μl的固相萃取柱，对应步骤S3所述tube管为2ml；步骤S2所柱管为1000μl的述固相萃取柱，对应步骤S3所述tube管为5ml。本发明的有益效果是：
本发明制备的的固相萃取小柱与通用的固相萃取小柱相比，减少了填料量、样品处理量和有机溶剂的消耗，缩短了样品前处理的时间，节约成本，使得生物胺的检测更为方便、高效。目前商业途径能够购买的固相萃取柱，以C18或者STRATA X为例，每个样品的用量为0.5～5g，有机溶剂最低消耗量为4.5mL，填料体积最低为1mL；本发明制备的固相萃取小柱，每个样品的最低用量为0.01g，有机溶剂的最低消耗量为200μl，填料体积的最小用量为10μl。
本发明基于固相萃取的原理，制作固相萃取柱步骤简单，不需要依赖仪器，常规实验室即可制备；遵循固相萃取通用的上样、淋洗、洗脱步骤，实验流程较快，可批量对样品进去前处理。每批同时处理24个样品，时间不超过30min。
本发明使用的固相萃取填料均可以商品化得到，与现有的商品化固相柱相比，生物胺回收率的范围在86％～93％之间，在保证回收率的同时，大大节省了成本。
附图说明
图1是本发明一种富集生物胺的固相萃取柱的结构示意图；图中，1.柱管，2.离心管，3.下筛板，4.固相萃取填料；
图2是本发明实施例一种富集生物胺的固相萃取柱对生物胺的富集回收率；
图3是本发明实施例一种富集生物胺的固相萃取柱对生物胺的富集回收率。
具体实施方式
为使本发明的优点和目的更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，包括以下步骤：
S1、固相萃取柱的柱管为1ml移液枪枪头；将粒径60μm，直径2.5mm的聚乙烯下筛板置于移液枪枪头的底部；
S2、将1.5mL离心管盖子中部以及该离心管底部打孔，离心管盖子中部的孔径大小使得所述固相萃取柱的柱管顶端能刚好穿过；将柱管从上到下穿过1.5mL离心管盖子及底部的孔径，固定于离心管中，枪头前端露出离心管底部的距离为13mm；
S2、向步骤S1所述柱管中放入40μl Thermo HyperSep Retain-CX固相萃取填料，制得富集生物胺的固相萃取柱，制备好的萃取柱如图1所示。
实施例2
应用本发明实施例1制作的固相萃取柱对马鲛鱼样品中的生物胺进行检测。
不经任何处理的天然马鲛鱼鱼肉为待测样品1；向每克天然马鲛鱼鱼肉(即待测样品1)中直接加入3毫克的生物胺标准品溶液，得待测样品2；待测样品1和待测样品2分别经下述步骤进行生物胺的富集和生物胺含量的测定。
应用实施例1制备的固相萃取柱进行马鲛鱼样品中生物胺的富集，包括以下步骤：
S1、待测样品前处理：向0.2g待测样品中加入500μl 1％三氯乙酸水溶液(w/v)，旋涡震荡10min，6000转/min离心8min，取上清液，得马鲛鱼待测溶液；
S2、取实施例1制备的固相萃取柱；
S3、活化固相萃取柱：将萃取柱放入5ml tube管中，向固相萃取柱中加入150μl甲醇，2000转/min，离心2min，弃去流出液；加入150μl水进行活化，2000转/min，离心2min，弃去tube管中的流出液；
S4、上样：向固相萃取柱中加入60μl马鲛鱼待测溶液进行上样，2000转/min离心2min，弃去流出液；弃去tube管底部的流出液；
S5、淋洗：向固相萃取柱中加入30μl 3％甲酸溶液(v/v)进行淋洗，6000转/min离心2min，弃去tube管底部的流出液；
S6、洗脱：将固相萃取柱移入新的5ml tube管中，向固相萃取柱中加入250μl 8％氨水甲醇溶液(v/v)进行洗脱，6000转/min离心2min，收集tube管中的洗脱液；
S7、浓缩洗脱液，30℃，转速300rpm，浓缩离心2小时。
使用高效液相色谱-质谱检测上述步骤S5制得的样品中生物胺的含量，包括以下步骤：
将上述步骤S5制备的样品用1ml甲醇复溶，过膜后进行LC-MS检测。色谱柱为Luna3μm HILIC流动相条件(A)5mM乙酸铵水溶液(B)甲醇；流速：0.32ml/min乙酸铵水溶液，0.08ml/min甲醇，进样体积5μl；采用多反应监测(MRM)检测模式，具体参数见表1。
表1
生物胺回收率的测定：回收率计算方式如下：
回收率(％)＝(C-A)/B*100％
式中：
A为测得的待测样品(即待测样品1)中生物胺的含量；
B为加入生物胺标准品的含量；
C为测得的加入标准品的待测样品中(即待测样品2)生物胺的含量；
实验结果如图2所示，测得不同种类生物胺的回收率的范围在66％～96％之间。
实施例3
一种富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，包括以下步骤：
S1、固相萃取柱的柱管为1000μl移液枪枪头；将粒径60μm，直径2.5mm的聚乙烯下筛板置于移液枪枪头的底部；
S2、将1.5mL离心管盖子中部以及该离心管底部打孔，将所述固相萃取柱的柱管从上至下依次穿过1.5mL离心管盖子及底部的孔径，固定于离心管中，柱管前端露出离心管底部的13mm；
S3、向步骤S1所述柱管中放入40μl Waters Oasis MCX固相萃取填料，得富集生物的固相萃取柱。
使用本实施例制备的固相萃取柱进行马鲛鱼样品中生物胺的富集，包括以下步骤：
S1、待测样品前处理：向0.2g马鲛鱼待测样品中加入500μl 1％三氯乙酸水溶液(w/v)，旋涡震荡10min，6000转/min离心8min，取上清液，得马鲛鱼待测溶液。
S2、取本实施例制备的固相萃取柱；
S3、活化固相萃取柱：将固相萃取柱置于5mL tube管中，向固相萃取柱中加入150μl甲醇，2000转/min，离心2min，弃去流出液；加入150μl水进行活化，2000转/min，离心2min，弃去tube管中的流出液；
S4、上样：向固相萃取柱中加入60μl马鲛鱼待测溶液进行上样，2000转/min离心2min，弃去tube管中的流出液；
S5：淋洗：向固相萃取柱中加入30μl 3％甲酸进行淋洗，6000转/min离心2min，弃去tube管中的流出液；
S6：洗脱：将固相萃取柱移入新的5mL tube管中，向固相萃取柱中分三次加入500μl 15％氨水甲醇溶液(v/v)进行洗脱，6000转/min离心2min，收集tube管中的洗脱液；
S7：浓缩洗脱液，30℃，转速300rpm，浓缩离心2小时。
回收率测定结果如图3所示，生物胺回收率的范围在86％～93％之间；回收率的结果表明使用本实施案例中的阳离子交换填料富集生物胺的效果良好；增大洗脱液的浓度和洗脱液的体积，解决了实施例2中目标化合物不能被完全洗脱的问题；同时使用本发明制备的固相萃取柱，可大幅减少样品用量和有机试剂用量，降低了检测成本，缩短了样品前处理时间，使得生物胺的检测更为绿色、经济、方便、高效。
实施例4
一种富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，包括以下步骤：
S1、固相萃取柱的柱管为200μl移液枪枪头，将孔径为10μm，直径为1mm，材质为聚乙烯的下筛板置于移液枪枪头的底部；
S2、将500μl离心管盖子中部及底部垂直打孔，孔径大小使得所述固相萃取柱的柱管顶端能刚好穿过；将柱管从上至下依次穿过离心管盖子及底部的孔径，固定于离心管中，柱管前端露出离心管底部的距离为3mm；
S3、向步骤S1所述柱管中放入10μl的固相萃取填料C18，得固相萃取柱。
使用上述固相萃取柱对生物胺样品进行富集，包括如下步骤：
S1、生物胺待测样品前处理：向0.01克待测样品中加入100μl 0.01％三氯乙酸水溶液(w/v)，旋涡震荡1min，以5000转/min，离心5min，取上清液，得到生物胺待测样品溶液。
S2、取本实施例制备的固相萃取柱
S3、活化固相萃取柱：将固相萃取柱放入2ml tube管中，向萃取柱中加入100μl甲醇，500转/min，离心30s，弃去tube管底部的流出液；加入100μl水进行活化，500转/min，离心30s，弃去tube管底部的流出液；
S4、上样：向固相萃取柱中加入10μl生物胺待测样品溶液进行上样，1000转/min，离心30s，弃去tube管底部的流出液；
S5、淋洗：向固相萃取柱中加入10μl 0.1％甲酸溶液(v/v)进行淋洗，1000转/min，离心30s，弃去tube管底部的流出液；
S6、洗脱：将固相萃取柱移入新的2ml tube管中，向固相萃取柱中加入100μl 5％氨水甲醇溶液(v/v)进行洗脱，1000转/min，离心30s，收集tube管中的洗脱液；
S7：浓缩干燥洗脱液：30℃，转速300rpm，浓缩离心2小时。
实施例5
一种富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，包括以下步骤：
S1、固相萃取柱的柱管为1000μl移液枪枪头，将孔径60μm，直径5mm的聚四氟乙烯下筛板置于移液枪枪头的底部；
S2、将1.5ml离心管盖子中部及底部垂直打孔，孔径大小使得所述固相萃取柱的柱管顶端能刚好穿过；将柱管从上至下依次穿过离心管盖子及底部的孔径，固定于离心管中，柱管前端露出离心管底部的距离为8mm；
S3、向步骤S1所述柱管中放入200μl的固相萃取填料Cleanert C8/SCX，得固相萃取柱。
使用上述固相萃取柱富集生物胺，包括如下步骤：
S1、生物胺待测样品前处理：向1克待测样品中加入300μl 0.5％三氯乙酸水溶液(w/v)，旋涡震荡5min，以15000转/min，离心15min，取上清液，得到生物胺待测样品溶液；
S2、取本实施例制备的固相萃取柱；
S3、活化固相萃取柱：将固相萃取柱放入5ml tube管中，向萃取柱中加入500μl甲醇，1000转/min，离心200s，弃去tube管底部的流出液；加入500μl水进行活化，1000转/min，离心200s，弃去tube管底部的流出液；
S4、上样：向固相萃取柱中加入100μl生物胺待测样品溶液进行上样，8000转/min，离心200s，弃去tube管底部的流出液；
S5、淋洗：向固相萃取柱中加入100μl 2％甲酸溶液(v/v)进行淋洗，8000转/min，离心200s，弃去tube管底部的流出液；
S6、洗脱：将固相萃取柱移入新5ml tube管中，向固相萃取柱中加入300μl 20％氨水甲醇溶液(v/v)进行洗脱，8000转/min，离心200s，tube管中的收集洗脱液；
S7：浓缩干燥洗脱液：32℃，转速500rpm，浓缩离心1小时。
实施例6
一种富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，包括以下步骤：
S1、固相萃取柱的柱管为200μl移液枪枪头，将孔径30μm，直径3mm的聚四氟乙烯下筛板置于移液枪枪头的底部；
S2、将0.5ml离心管盖子中部及底部垂直打孔，孔径大小使得所述固相萃取柱的柱管顶端能刚好穿过；将柱管从上至下依次穿过离心管盖子及底部的孔径，固定于离心管中，柱管前端露出离心管底部的距离为5mm；
S3、向步骤S1所述柱管中放入100μl的固相萃取填料Cleanert C8/SCX；得固相萃取柱。
用上述固相萃取柱富集生物胺，包括如下步骤：
S1、生物胺待测样品前处理：向0.5克待测样品中加入200μl 0.8％三氯乙酸水溶液(w/v)，旋涡震荡10min，以8000转/min，离心10min，取上清液，得到生物胺待测样品溶液；
S2、取本实施例制备的固相萃取柱；
S3、活化固相萃取柱：将固相萃取柱放入2ml tube管中，向萃取柱中加入300μl甲醇，1500转/min，离心80s，弃去tube管底部的流出液；加入300μl水进行活化，1500转/min，离心80s，弃去tube管底部的流出液；
S4、上样：向固相萃取柱中加入50μl生物胺待测样品溶液进行上样，4000转/min，离心80s，弃去tube管底部的流出液；
S5、淋洗：向固相萃取柱中加入50μl 1％甲酸溶液(v/v)进行淋洗，4000转/min，离心80s，弃去tube管底部的流出液；
S6、洗脱：将固相萃取柱移入新的2ml tube管中，向固相萃取柱中加入300μl 10％氨水甲醇溶液(v/v)进行洗脱，4000转/min，离心80s，收集tube管中的洗脱液；
S7：浓缩干燥洗脱液：28℃，转速200rpm，浓缩离心3小时。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，包括以下步骤：
S1、将下筛板置于固相萃取柱柱管内部的下方；
S2、将离心管盖子中部及离心管底部垂直打孔，将步骤S1所述柱管从上至下依次穿过所述离心管盖子及离心管底部的孔，固定于离心管中，所述柱管前端露出离心管底部的距离为3～13mm；
S3、向所述柱管中放入固相萃取填料。
2.根据权利要求1所述富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，其特征在于，步骤S1所述下筛板，孔径为10～60μm，直径为1～5mm，材质为聚乙烯或聚四氟乙烯。
3.根据权利要求1所述富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，其特征在于，步骤S1所述柱管为200μl或1000μl移液枪枪头。
4.根据权利要求3所述富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，其特征在于，步骤S2所述离心管为：步骤S1所述200μl的柱管，对应步骤S2所述离心管为0.5ml；步骤S1所述1000μl的柱管，对应步骤S2所述离心管为1.5ml。
5.根据权利要求1所述富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，其特征在于，步骤S2所述离心管盖子的孔，孔径与步骤S1所述柱管上部的直径相同。
6.根据权利要求1所述富集生物胺的固相萃取柱的制备方法，其特征在于，步骤S3所述固相萃取填料为C18，Thermo HyperSep Retain-CX，Cleanert C8/SCX，Waters Oasis MCX中的一种，添加量为10～200μl。
7.一种富集生物胺的方法，包括如下步骤：
S1、生物胺待测样品的前处理：向0.01～1g待测样品中加入100～500μl0.01～1％三氯乙酸水溶液，旋涡震荡1～10min，5000～15000转/min、离心5～15min，取上清液，得到生物胺待测样品溶液；
S2、取权利要求1至5任一方法制备的富集生物胺的固相萃取柱；
S3、活化固相萃取柱：将所述富集生物胺的固相萃取柱放入tube管中，向萃取柱中加入100～500μl甲醇，500～2000转/min、离心30～200s，弃去tube管底部的流出液；加入100～500μl水进行活化，500～2000转/min、离心30～200s，弃去tube管底部的流出液；
S4、上样：向固相萃取柱中加入10～100μl生物胺待测样品溶液进行上样，1000～8000转/min、离心30～200s，弃去tube管底部的流出液；
S5、淋洗：向固相萃取柱中加入10～100μl 0.1％～3％甲酸溶液(v/v)进行淋洗，1000～8000转/min、离心30～200s，弃去tube管底部的流出液；
S6、洗脱：将固相萃取柱移入新的2ml或5ml tube管中，向固相萃取柱中加入100～500μl 5％～20％氨水甲醇溶液(v/v)进行洗脱，1000～8000转/min、离心30～200s，收集tube管中的洗脱液；
S7：浓缩干燥洗脱液：28～32℃，转速200～500rpm，浓缩离心1～3小时。
8.根据权利要求7所述富集或检测生物胺的方法，其特征在于，步骤S3所述tube管为：步骤S2所述柱管为200μl的固相萃取柱，对应步骤S3所述tube管为2ml；步骤S2所柱管为1000μl的述固相萃取柱，对应步骤S3所述tube管为5ml。
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