CN110487938B - 罗汉松实药材的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种罗汉松实药材的质量控制方法，其特征在于将药材中的化学成分川芎嗪作为质量控制指标，建立了薄层色谱鉴别药材中川芎嗪的方法以及高效液相色谱测定药材中川芎嗪含量的方法。所建立的薄层鉴别法，结果显示斑点清晰，无其它成分干扰；高效液相色谱目标峰分离度高，峰形好，无其它杂峰干扰，专属性强，重现性好，准确度高；具有普遍的适用性。该法能科学有效的控制罗汉松实药材质量。

Description

罗汉松实药材的质量控制方法

技术领域

本发明属于中药学、天然药物化学、中药分析学和医药技术领域，具体涉及一种罗汉松实药材的质量控制方法。

背景技术

罗汉松为罗汉松科罗汉松属植物，主要分布在我国江苏、浙江、福建、湖南、湖北、江西、四川、贵州、云南、广东和广西等地，在广西北海市种植面积达1.5万亩。罗汉松实是罗汉松Podocarpus macrophyllus(Thunb.)D.Don或短叶罗汉松Podocarpus macrophyllus(Thunb.)D.Don var.maki(Sieb.)Endl.的果实，由种子和花托构成。据《中药大辞典》记载，罗汉松实是一种药材，具有补肾益肺，治血虚面色萎黄和心胃痛的功效。据调研，目前罗汉松实主要用于植物育种，市场上没有以罗汉松实药材作为原料的中成药制剂。罗汉松实也极少作为药材在市场上流通。罗汉松实药材的加工方法和相关产品的开发研究亟待开展。近年来，越来越多的学者开始关注罗汉松实药材的药用价值，文献报道了罗汉松实的氨基酸和矿质元素含量；罗汉松实种子挥发油的化学成分及挥发油中的川芎嗪；罗汉松实中的总黄酮；罗汉松实花托醇提物的降血脂、抗氧化和保肝作用。然而，至今为止，关于罗汉松实药材的质量控制方法尚无报道。由于罗汉松实药材产地较多，随着含罗汉松实产品研究的不断开展和深入，很有必要建立罗汉松实药材的质量控制方法，以合理控制罗汉松实药材的质量，确保相关产品的质量。

关于罗汉松实药材的国内发明专利，已公开的不多，主要有以下5件：

发明专利CN201910288948.4公开了一种响应面法优化罗汉松实黄酮的提取工艺，该专利以水为溶剂采用超声提取法提取罗汉松实黄酮，用芦丁较大吸收峰处吸光度的大小来衡量提取液黄酮浓度的高低，获得了最佳提取工艺。

发明专利CN201910050934.9公开了罗汉松实多糖的抗肿瘤用途。该专利申请保护了罗汉松实多糖的抗肝癌作用及相关制剂。

发明专利CN201610460262.5公开了一种从罗汉松种子高效提取分离高纯度川芎嗪的方法，该专利通过水蒸气蒸馏法提取罗汉松种子挥发油，以石油醚萃取后分离获得高纯度川芎嗪。该专利未建立有罗汉松实中川芎嗪的含量测定方法。

张明洞(CN201110095608和CN201110095609)公开了罗汉松实酒和罗汉松实提取物及制品的生产方法，这两个专利主要涉及含罗汉松实或罗汉松实提取物食品的制备方法。

除此之外，还有一些以罗汉松实为中药复方组分之一，用于治疗各种疾病的专利申请。所有这些专利都没有涉及罗汉松实药材的质量控制方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的控制罗汉松实药材质量的方法。该法简便易行，可以有效的控制罗汉松实药材的质量。

本发明所述的方法包括如下步骤：

(1)薄层鉴别：取川芎嗪对照品约20mg，精密称定，加甲醇溶解制成每1ml含川芎嗪1mg的对照品溶液；另取干燥的罗汉松实药材粉末200g，过20目筛，以95％乙醇回流提取2次，每次500ml，每次提取1小时，合并两次提取液，60℃减压回收乙醇，得浸膏，80℃真空干燥，得干膏，取干膏约20mg，精密称定，加甲醇50ml溶解，加入活性炭1g，超声处理60分钟，过滤，滤液蒸干，再加入甲醇定容至1ml，制成供试品溶液；

取对照品溶液和供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷∶乙酸乙酯(2∶1)的溶液作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾溶液，日光检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)高效液相色谱法测定药材中川芎嗪含量：取川芎嗪对照品约20mg，精密称定，加甲醇溶解制成每1ml含川芎嗪60μg的对照品溶液；取干燥的罗汉松实药材粉末100g，过20目筛，用水蒸气蒸馏法提取挥发油；取挥发油约100mg，精密称定，加甲醇5ml，超声处理10分钟，以甲醇定容至10ml容量瓶中，摇匀，制成供试品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.1％磷酸(60∶40)为流动相；柱温为室温；检测波长为298nm；理论塔板数以川芎嗪峰计算应不低于20000；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标一点法计算含量。

所述的罗汉松实药材的质量控制方法，按干燥品计算，每1g罗汉松实药材含川芎嗪不少于0.2μg。

本发明针对目前无罗汉松实药材质量控制标准的问题，发明人在现有技术基础上，对薄层鉴别的供试品制备方法、展开剂条件和显色方法等进行了反复深入研究；对药材的质量控制指标成分进行了深入分析比较；对川芎嗪含量测定的色谱条件进行了反复探索；最终建立了一种科学、可靠和有效的罗汉松实药材质量控制方法。建立的薄层鉴别法，在供试品色谱图中，与对照品色谱相应位置上，显示相同的黄色斑点，且斑点清晰，无其它成分干扰，能很好的鉴别出药材中所含的川芎嗪，即四甲基吡嗪(见附图1)。建立的高效液相色谱测定药材中川芎嗪含量的方法，目标峰分离度高，峰形好，无其它杂质峰干扰，专属性强，重复性好，准确度高，简便易行(见附图2)。本发明所提供的罗汉松实药材质量控制方法，填补了当前的技术空白，可有效保证罗汉松实药材质量。

附图说明

图1罗汉松实药材薄层鉴别图，图中A对照品，B供试品，C95％乙醇提取物(未脱色)

图2高效液相色谱图，图中A对照品，B供试品，C阴性对照。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施例。

实施例1

薄层鉴别

取川芎嗪对照品约20mg，精密称定，加甲醇溶解制成每1ml含川芎嗪1mg的对照品溶液；另取干燥的罗汉松实药材粉末200g，过20目筛，以95％乙醇回流提取2次，每次500ml，每次提取1小时，合并两次提取液，60℃减压回收乙醇，得浸膏，80℃真空干燥，得干膏，取干膏约20mg，精密称定，加甲醇50ml溶解，加入活性炭1g，超声处理60分钟，过滤，滤液蒸干，再加入甲醇定容至1ml，制成供试品溶液；

取对照品溶液和供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷∶乙酸乙酯(2∶1)的溶液作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾溶液，日光检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显黄色的斑点。

实施例2

含量测定

1仪器与材料

Agilent1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，电子天平(瑞士梅特勒-托利仪器有限公司)，XS-205DU十万分之一天平(瑞士梅特勒-托利仪器有限公司)，KQ-500DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，CD-UPH-II-20T型超纯水器(成都超纯科技有限公司)，万能粉碎机(无锡久平仪器有限公司)。

罗汉松实鲜品采自广西北海，经鉴定为罗汉松科植物短叶罗汉松P.macrophyllus(Thunb.)D.Don var.maki Endl.的果实。川芎嗪对照品(上海雅吉生物科技有限公司)，甲醇为色谱纯，磷酸，石油醚和无水硫酸钠均为分析纯，水为去离子水。

2方法与结果

2.1溶液的制备

对照品溶液制备：取川芎嗪对照品约20mg，精密称定，加甲醇溶解并定容于25ml量瓶中得浓度为0.7572mg/ml的对照品储备液。精密移取2.0ml对照品储备液，置于25ml量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得浓度为0.06058mg/ml的川芎嗪对照品溶液。

供试品溶液的制备：取干燥的罗汉松实，粉碎，过20目筛，称取100g置圆底烧瓶中，加入1000ml蒸馏水浸泡12小时后，保持微沸蒸馏6h。馏出液用石油醚萃取3次，每次50ml，合并醚层，加入无水硫酸钠脱水，50℃减压回收溶剂，得到具芳香气味的淡黄色液体，即为挥发油。取挥发油约100mg，精密称定，加甲醇超声溶解并定容至10ml量瓶中，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。

阴性对照溶液的制备：以甲醇为阴性对照溶液。

2.2色谱条件及系统适应性

色谱柱：GL Inertsil ODS-3C₁₈柱(250mm×4.6mm，5.0μm)；流动相：甲醇-0.1％磷酸(60∶40)，等度洗脱；流速：0.8ml/min；检测波长：298nm；柱温：室温；进样量：20μl。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液进样测定。在该色谱条件下，理论塔板数以川芎嗪峰计大于20000，分离度大于1.5。对照品、供试品和阴性对照溶液色谱图见附图2。

2.3方法学考察

2.3.1线性关系考察

精密吸取对照品储备液0.005、0.01、0.02、0.04、0.05、0.1、0.2和0.3ml，分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释，摇匀，定容，即得系列对照品溶液。按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以川芎嗪的进样浓度为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归。得回归方程为：y＝82.182x+11.538(r＝0.9998)。结果表明，川芎嗪进样浓度在0.38～22.72μg/ml范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

2.3.2精密度试验

取“2.1”项下的对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件，连续进样6次，测定川芎嗪的峰面积。结果川芎嗪峰面积RSD值为0.32％，表明精密度良好。

2.3.3重复性试验

取罗汉松实药材6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进样测定。结果药材中川芎嗪平均含量为0.211μg/g，RSD为1.60％。表明方法重复性良好。

2.3.4稳定性试验

取“2.1”项下的供试品溶液，室温放置0、2、4、8、12、24h，按“2.2”项下色谱条件进样测定，测得川芎嗪峰面积RSD为0.50％。表明供试品溶液在24h内稳定。

2.3.5加样回收试验

取已知含量的罗汉松实药材6份，精密称定，分别置于容量瓶中，各精密加入一定质量的川芎嗪对照品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，平均回收率为99.42％，RSD为1.31％。结果见表1。

表1加样回收率实验结果

2.3.5样品含量测定

取罗汉松实药材3批，分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，结果见表2。

表2样品含量测定结果

结果表明，罗汉松实药材中川芎嗪的平均含量为0.21μg/g。考虑到药材采收季节及产地等因素对川芎嗪的含量有一定影响，因此，将药材中川芎嗪含量的最低控制标准拟定为0.2μg/g。

Claims (2)

1.一种罗汉松实药材的质量控制方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤：

(1)薄层鉴别：

对照品溶液的制备：取川芎嗪对照品约20mg，精密称定，加甲醇溶解制成每1ml含川芎嗪1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取干燥的罗汉松实药材粉末200g，过20目筛，以95％乙醇回流提取2次，每次500ml，每次提取1小时，合并两次提取液，60℃减压回收乙醇，得浸膏，80℃真空干燥，得干膏；取干膏约20mg，精密称定，加甲醇50ml溶解，加入活性炭1g，超声处理60分钟，过滤，滤液蒸干，再加入甲醇定容至1ml，即得；

检测方法：取对照品溶液和供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷∶乙酸乙酯，体积比为2∶1的溶液作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾溶液，日光检视；

(2)高效液相色谱法测定川芎嗪含量：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.1％磷酸=60∶40为流动相；柱温为室温；检测波长为298nm；理论塔板数以川芎嗪峰计算应不低于20000；

对照品溶液的制备：取川芎嗪对照品约20mg，精密称定，加甲醇溶解制成每1ml含川芎嗪60μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取干燥的罗汉松实药材粉末100g，过20目筛，用水蒸气蒸馏法提取挥发油；取挥发油约100mg，精密称定，加甲醇5ml，超声处理10分钟，以甲醇定容至10ml容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标一点法计算含量，即得。

2.根据权利要求1所述的罗汉松实药材的质量控制方法，其特征在于：按干燥品计算，每1g罗汉松实药材含川芎嗪不少于0.2μg。

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