CN113671055A - 一种检测中药材银杏叶中咖啡因含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测中药材银杏叶中咖啡因含量的方法，所述方法，步骤如下：1)供试品溶液的制备：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀,称取粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇8‑12mL，密塞，称重，超声提取8‑12min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液，高速离心10‑20min，转数10000‑15000转/分钟，得上清液；2)对照品溶液的制备：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL溶液；3)检测：取供试品溶液、对照品溶液，注入液质联用仪，以咖啡因对照品峰为参照峰，记录峰面积，根据峰面积可以计算出供试品溶液中的咖啡因含量。

Description

一种检测中药材银杏叶中咖啡因含量的方法
技术领域
本发明涉及一种药材中有关微量物质的检测方法，特别涉及一种检测中药材银杏叶中咖 啡因含量的方法。
背景技术
银杏叶，为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶。秋季叶尚绿时采收，及时干燥。 具有活血化瘀，通络止痛，敛肺平喘，化浊降脂的功效。用于瘀血阻络，胸痹心痛，中风偏 瘫，肺虚咳喘，高脂血症。
2015年版《中国药典》中写明，银杏叶中含总黄酮醇苷类、萜类内酯，后者主要包括银 杏内酯A(C20H24O9)、银杏内酯B(C20H24O10)、银杏内酯C(C20H24O11)和白果内酯(C15H18O8)。
现代药理研究表明，银杏叶具有抗氧化、抗凋亡、改善脑血流、神经保护、抑制血小板 活性等多种药理作用，可用于心脑血管等疾病的治疗。
因此，银杏叶及银杏叶制剂被广泛应用于临床。
近年来，有研究先后运用高效液相色谱-串联质谱法和超高效液相-串联质谱法分别检测 出银杏叶制剂、银杏叶中含有咖啡因成分，咖啡因作为第二类精神药品，其影响包括心悸、 心率失常、中枢神经系统过度兴奋等不良反应，尤其是其具有成瘾性，可能对人体造成危害。
由于银杏叶中咖啡因含量极少，因此建立一种简单快速的检测方法专门用来测定银杏叶 中咖啡因的含量十分必要。
咖啡因的检测方法已有报道，如：食品中西布曲明等化合物的测定(BJS 201701)，该方 法用来规定并检测食品(含保健食品)基质中西布曲明等(含咖啡因)33种违法添加化合物 的高效液相色谱-串联质谱测定方法，该方法得到的图谱、数据质量较好，结果准确、可靠， 并且其定量的线性范围下限达到0.1ng/mL。但是，该方法所检测的咖啡因是外源性物质，无 法直接用于银杏叶。
发明内容
本发明提供了一种银杏叶药材中微量成分咖啡因含量的测定方法，所述方法以BJS 201701方法(食品中西布曲明等化合物的测定(BJS 201701，简称文献1)为基础，对其检 测条件进行了改进，以适应银杏叶药材，同时，筛选得到特别优选的仪器，溶剂，流动相，温度，时间等条件，特别适合银杏叶药材的检测。
本发明的检测方法，采用超高效液相色谱-串联质谱测定方法，其中，采用特定仪器， Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪串联Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪，进 行测定。
本发明所述的方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：
2)对照品溶液的制备：
3)检测：取供试品溶液和对照品溶液，注入液质联用仪，以咖啡因对照品峰为参照峰， 记录峰面积，根据峰面积计算供试品溶液中的咖啡因含量。
优选的，本发明所述的方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：取银杏叶样品加入甲醇提取，提取液过滤，取续滤液离心得到上 清液；
2)对照品溶液的制备：取咖啡因对照品用甲醇溶解并稀释至刻度；
3)检测取供试品溶液和对照品溶液，注入液质联用仪，以咖啡因对照品峰为参照峰，记 录峰面积，根据峰面积计算供试品溶液中的咖啡因含量，其中，液质联用仪的色谱、质谱条 件采用的仪器是Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪串联Xevo TQ-Smicro三重四 极杆质谱仪，
其中，所述液质联用仪的液相色谱条件如下：色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×100 mm,2.7μm)；流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5 min，95％A；5～22min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A；流速：0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL；质谱参数条件：正离 子模式；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1000 L/h；多反应监测模式(MRM)；离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)； 驻留时间分别为0.165s、0.165s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0 V。
具体的，本发明所述的方法，其中，
步骤1)供试品溶液的制备方法如下：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀, 称取粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇8-12mL，密塞，称重，超声提取8-12min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过 滤，取续滤液，高速离心10-20min，转数10000-15000转/分钟，得上清液，即为供试品溶液。
其中，步骤2)对照品溶液的制备方法如下：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于 5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL咖啡因对照品溶液。
更具体的，本发明所述的方法，其中1)供试品溶液的制备方法如下：取银杏叶样品适 量，研成粉末，过四号筛，混匀,称取粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 10mL，密塞，称重，超声提取10min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀， 用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液，高速离心15min，转数12000转/分钟，得上清液 即为供试品溶液。
其中，步骤2)对照品溶液的制备方法如下：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于 5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL咖啡因对照品溶液。
其中步骤3)色谱、质谱条件采用的仪器是Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱 仪串联Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪，具体参数如下：
液相色谱条件：色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×100mm,2.7μm)；流动相：A 为含0.1％甲酸水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5min，95％A；5～22min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A；流 速：0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL
质谱参数条件：正离子模式；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1000L/h；多反应监测模式(MRM)；离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)；驻留时间分别为0.165s、0.165s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0V
特别优选的，本发明所述的方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备方法如下：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀,称取 粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇8-12mL，密塞，称重，超声提取8-12min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续 滤液，高速离心10-20min，转数10000-15000转/分钟，得上清液，即为供试品溶液；
2)对照品溶液的制备方法如下：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL咖啡因对照品溶液；
3)取供试品溶液和对照品溶液，注入液质联用仪，以咖啡因对照品峰为参照峰，记录峰 面积，根据峰面积计算供试品溶液中的咖啡因含量；
其中，液相色谱条件：色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×100mm,2.7μm)；流动 相：A为含0.1％甲酸水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5min，95％A；5～22 min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A； 流速：0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL；质谱参数条件：正离子模式；毛细管电压：0.5 kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1000L/h；多反应监测模式(MRM)； 离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)；驻留时间分别为0.165s、0.165 s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0V。
最优选的，本发明所述的方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备方法如下：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀,称取 粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称重，超声提取10min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液， 高速离心15min，转数12000转/分钟，得上清液即为供试品溶液；
2)对照品溶液的制备方法如下：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL咖啡因对照品溶液；
3)取供试品溶液和对照品溶液，注入液质联用仪，以咖啡因对照品峰为参照峰，记录峰 面积，根据峰面积计算供试品溶液中的咖啡因含量；
其中3)色谱、质谱条件采用的仪器是Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪串 联Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪，具体参数如下：
液相色谱条件：色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×100mm,2.7μm)；流动相：A 为含0.1％甲酸水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5min，95％A；5～22min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A；流 速：0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL
质谱参数条件：正离子模式；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1000L/h；多反应监测模式(MRM)；离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)；驻留时间分别为0.165s、0.165s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0V。
本发明的的检测方法，是经过筛选获得的，筛选过程如下：
一、现有方法的改进
BJS 201701方法(食品中西布曲明等化合物的测定(BJS 201701，简称文献1)检测的 对象为食品(含保健食品)这一类物质，在对银杏叶中的咖啡因进行检测时，直接用文献1 方法检测结果较差，具体原因前面已经论述，今，发明人对BJS 201701方法进行改进，方法 检测的对象针对银杏叶生药样品。主要有：
1、进样量的改进
采用文献1中供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱质谱条件。
对进样量进行筛选，结果显示：0.1ng/mL咖啡因对照品进样量为1μL时峰面积为361， 信噪比为12.21，仅略超过定量限S/N＝10，由于信噪比的计算结果具有一定的波动幅度，导 致结果不准；当进样量为2μL时峰面积为618，信噪比为20.24，超过定量限2倍，用于定量 结果较为准确。进样量大于等于2μL，均能满足实验要求，且2μL更节省样品用量，对仪器 和色谱柱的污染程度更小。
2、提取容器的改变
文献1的容器为具塞试管，由于具塞试管形状狭长，银杏叶药材粉末堆积在试管底部， 超声提取时，粉末多在下部，溶剂多在上部，使得每批银杏叶粉末与溶剂接触充分程度不一 致，导致结果差异性较大。而用具塞锥形瓶，超声时药材粉末与提取溶剂接触充分，结果稳 定性较好。
用具塞试管为提取容器的数据(同一批银杏叶样品平行实验结果)结果分别为255、372、 2443。峰面积波动很大，RSD值为123.28％。
用具塞锥形瓶为提取容器的数据(同一批银杏叶样品平行实验结果)结果分别为3029、 3057、3003。峰面积RSD值为0.89％。
3、样品处理的改进
文献1中将食品(含保健食品)直接研细使用，无去除杂质、过筛等步骤。由于银杏叶 药材含有杂质，使用文献1中方法会因杂质的存在干扰检测结果，使检测结果不准确。本方 法中取银杏叶药材，除去非银杏叶药用部分的杂质后，取全叶用打粉机粉碎，过四号筛，备 用。
文献1方法中使用“用微孔滤膜过滤，取续滤液，根据实际浓度适当稀释至线性范围内， 备用”，本发明方法中“用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液，高速离心15min，转数12000转/分钟，取上清液，备用”，本方法增加离心、取上清液步骤，进一步去除银杏叶样 品中的杂质，使检测结果更准确，同时也减少样品对色谱柱、仪器的污染程度。
二、银杏叶提取工艺条件的确定
以甲醇浓度、提取时间、料液比为因素条件进行单因素试验，分别考察各因素对银杏叶 中咖啡因提取率的影响，见表1。
表1：单因素试验因素和水平
Figure BDA0002492543850000061
1、甲醇浓度对银杏叶中咖啡因提取率的影响
称取1g银杏叶粉末，提取时间为10min，料液比(g:mL)为1:10，超声温度为30℃时，采用100％、70％、30％体积分数的甲醇溶液提取银杏叶中咖啡因，以甲醇浓度为横坐标，咖啡因提取率(ng/g)为纵坐标作图，见图1-1。
由图1-1可知，甲醇浓度为100％、70％时提取率较高，提取时选择二者皆可，又考虑到 溶剂回收的方便性，选用100％甲醇则更有利于甲醇溶剂的回收，因此本实验选用100％甲醇 作为提取溶剂。
2、不同提取时间对银杏叶中咖啡因提取率的影响
称取1g银杏叶粉末，甲醇浓度为100％，料液比(g:mL)为1:10，超声温度为30℃时，分别超声10min、35min、60min提取银杏叶中咖啡因，以提取时间为横坐标，咖啡因提取 率(ng/g)为纵坐标作图，见图1-2。
由图1-2可知，提取时间为10min时提取率最高，且超声10min具有节约时间、成本的 优点，因此本实验选择提取时间为超声10min。
3、不同料液比对银杏叶中咖啡因提取率的影响
称取1g银杏叶粉末，甲醇浓度为100％，提取时间为10min，超声温度为30℃时，分别采用料液比(g:mL)为1:10、1:30、1:50、1:100的溶剂量提取银杏叶中咖啡因，以料液比(g:mL)为横坐标，咖啡因提取率(ng/g)为纵坐标作图，见图1-3。
由图1-3可知，料液比在1:10～1:100的范围内，随着料液比的增大，提取率越高，且提 取率均较好，由此可知料液比在1:10～1:100的范围内皆可，在料液比为1:10时，峰面积的响 应值最高，且更节省溶剂，因此本实验选用的料液比为1:10(即称1g样品，溶剂用量为10mL)。
综上，因此本实验采用100％甲醇超声提取10min，料液比为1：10。
三、现有方法改进二
本发明的方法与现有文献“超高效液相-串联质谱法研究银杏叶提取物提取过程咖啡因的 转移规律(张苹苹等，食品工业科技，2019年22期，34-49，下面简称文献2)”方法的比较
1、提取溶剂单一，溶剂用量少，提取时间短，提取方法简单。
(1)现有文献2中银杏叶的提取方法：准确称取1.0g(精确到0.0001)银杏叶，置于250mL锥形瓶中，加入100mL 30％甲醇溶液超声1h，超声温度为30℃±0.5℃，根据实 际浓度适当稀释至线性范围内，用0.22μm滤膜过滤，装小瓶，供高效液相色谱－串联质谱 仪测定。
(2)本发明方法：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀。称取粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称重，超声提取10min，放冷， 再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液，高速离 心15min，转数12000转/分钟，取上清液，备用。
(3)对比：
a文献2需甲醇30mL(提取溶剂为30％甲醇溶液，100mL溶液中含有30mL甲醇)， 本发明方法仅需甲醇10mL，节省了2倍的甲醇用量。
b文献2提取的溶剂为30％甲醇水溶液，本发明方法提取溶剂为纯甲醇。
c同样为超声提取，文献2提取时间为1h，而本发明方法仅需超声10min，节约时间50 min。
优势：本方法与现有文献2的方法在都能检测出银杏叶中咖啡因的基础上，具有节省溶 剂、溶剂单一、节省时间、回收便捷的优点，可用于快速、简便地检测银杏叶中的咖啡因等 成分。
四、总结
1、用本方法检测银杏叶中的咖啡因，检测限、定量限均低于现有方法。
(1)现有文献2方法检测限为5μg/kg，定量限为15μg/kg。
(2)本发明方法分别以信噪比S/N＝3、S/N＝10定义检测限和定量限，检测限、定量限 均在0.1ng/ml(即1μg/kg)以下。
2、本发明方法得到的咖啡因色谱峰峰形较好，目标峰与杂质峰分离效果明显。
采用文献2的方法得到的图见图2-1
本发明方法得到的图，见图2-2、2-3、2-4分别为甲醇空白溶剂、咖啡因对照品溶液、银 杏叶供试品溶液在测定条件下的多反应监测模式色谱图。该图表明在选用离子对195.11→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)的测定条件下溶剂中无杂峰影响咖啡因 的测定，咖啡因对照品溶液中咖啡因的色谱峰不受杂质干扰、峰形优美，银杏叶供试品溶液 中咖啡因对应的峰与对照品峰保留时间一致，峰形也一致。该图充分说明该方法的有效、可 靠与成熟性。
本发明提供的方法具有以下优点：
1、方法比较
本发明提供的方法较为成熟，是以《食品中西布曲明等化合物的测定(BJS201701)》这 一标准方法为基础来建立的方法，相对来说，银杏叶中的咖啡因的检测比较难，原因：1)含 量极少(约1.5260×10-6g/kg～61.1070×10-6g/kg)；2)银杏叶粉末在具塞试管中容易聚集、不 易在溶剂中分散的性质；3)银杏叶中的咖啡因属于内源性物质。
基于上述原因，为了能够检测出银杏叶中的咖啡因，发明人进行了如下处理：
1)供试品处理方面：
因为咖啡因的含量太少，因此在银杏叶的处理上，就需要除去银杏叶上及内含的杂质， 本发明增加了两个处理：A研成粉末，过四号筛；B、0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液， 高速离心15min，转数12000转/分钟，取上清液；
2)用纯甲醇溶解银杏叶，超声时间为10min，节省了时间，且溶出效果最佳；使用更合 适的具塞锥形瓶，常规方法中银杏叶药材粉末堆积在试管底部，超声提取时，粉末多在下部， 溶剂多在上部，使得每批银杏叶样品与溶剂接触充分程度不一致，导致结果差异性较大。而 用具塞锥形瓶，超声时药材粉末与提取容器接触充分，结果稳定性较好；
3)改变进样量与银杏叶中咖啡因含量太少有关，因此需适当增加进样量以达到定量标准。
2、本发明提供的方法，结果更加准确、稳定、可靠。
附图说明：
图1-1、1-2、1-3分别为不同浓度甲醇、不同提取时间、不同料液比对银杏叶中咖啡因提 取率的影响；
图2-1为现有方法文献2中咖啡因的色谱图；
图2-2为甲醇空白溶剂多反应监测色谱图(此图为甲醇空白色谱图)；
图2-3为咖啡因对照品多反应监测色谱图(此图为咖啡因对照品色谱图)；
图2-4为银杏叶供试品多反应监测色谱图(此图为银杏叶药材供试品色谱图)；
图3为线性关系考察结果。
具体实施方式
实施例1：一种银杏叶中咖啡因含量的测定方法：
1、提取方法
(1)供试品溶液的制备
取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀,称取粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形 瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称重，超声提取10min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液，高速离心15min，转数12000 转/分钟，取上清液，备用。
(2)对照品溶液的制备
取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL母液，-20℃保存。
2、色谱、质谱条件
(1)液相色谱条件
色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×100mm,2.7μm)；流动相：A为含0.1％甲酸 水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5min，95％A；5～22min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A。流速：0.3mL/min； 柱温30℃；进样量2μL；
其中0.1％甲酸乙腈溶液是将1mL甲酸用1000mL乙腈稀释。
(2)质谱参数条件
正离子模式；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器 流速：1000L/h；多反应监测模式(MRM)；离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)；驻留时间分别为0.165s、0.165s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0V
3、检测方法：按上述供试品、对照品溶液制备方法分别制备供试品、对照品溶液，注入 液质联用仪按上述色谱、质谱条件进行分析，以咖啡因对照品峰为参照峰，记录峰面积。
该方法得到的图，图2-3为咖啡因对照品色谱图，图2-4为银杏叶药材供试品色谱图。
实验例1：方法学考察
1、线性关系考察
取咖啡因母液500μg/ml，分别稀释5×104，1×105，2×105，5×105，1×106，5×106倍， 按上述色谱、质谱条件进样分析。以咖啡因浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线， 见图3。
图3结果显示：线性方程为y＝4004.5x+483.89，R2＝0.999。
结果表明，咖啡因在0.1ng/mL～10ng/mL范围内，线性关系良好。
2、检测限和定量限
取梯度稀释的对照品溶液，按上述色谱、质谱条件注入液质联用仪进行分析，以信噪比 等于10(S/N＝10)为定量限，测得咖啡因在该方法下定量限为1×10-4ng/mL，即1×10-3μg/kg， 检测限(S/N＝3)小于此值。
3、精密度试验
称取1g银杏叶药材(编号YXY-10)，按上述提取方法进行处理，按色谱条件连续进样6 次，以咖啡因对照品峰为参照峰，记录峰面积并计算相对标准偏差(RSD)。
Figure BDA0002492543850000101
其中：
S为标准偏差，计算公式为
Figure BDA0002492543850000102
Figure BDA0002492543850000103
为均值
结果见表2中的含量及精密度RSD可接受的范围。
表2：样品中待测定成分含量、精密度RSD可接受范围和回收率限度
待测定成分含量 重复性(RSD％) 重现性(RSD％) 回收率限度(％)
100％ 1 2 98-101
10％ 1.5 3 95-102
1％ 2 4 92-105
0.1％ 3 6 90-108
0.01％ 4 8 85-110
10μg/g(ppm) 6 11 80-115
1μg/g 8 16 75-120
10μg/kg(ppb) 15 32 70-125
表2结果计算RSD值为5.12％。样品中咖啡因含量约为1ng/mL，即10ng/g＝10μg/kg， 精密度可接受范围在15％以内。
测定结果符合2015年版《中国药典》规定，表明仪器精密度良好。
4、重复性试验
平行称取6份银杏叶药材(编号YXY-10)各1g，按上述提取方法、色谱条件进行操作， 以咖啡因对照品峰为参照峰，记录峰面积，计算得RSD值为5.87％。
测定结果表明：本发明提供的方法重复性较好。
5、稳定性试验
称取1份银杏叶药材(编号YXY-10)1g，按上述前方法处理后，分别于供试品溶液制备后的第0、1、2、4、8、12h按上述检测方法进行检测，以咖啡因对照品峰为参照峰，记 录峰面积，计算得RSD值为7.20％。
测定结果表明：12h内样品的稳定性较好。
6、加样回收率试验
平行称取银杏叶药材6份(编号YXY-10)各0.5g，分别加入5ng咖啡因对照品，精密加入10mL甲醇，提取、检测等均按上述提取、检测方法操作，以咖啡因对照品峰为参照峰，记录峰面积，计算RSD值。
结果见表2(回收率限度)。
表2结果显示：计算的RSD值为6.24％，平均加样回收率为83.29％，符合2015年版《中 国药典》规定，表明该方法回收率良好。最低回收率、最高回收率、平均回收率均在要求范 围内。
实验例2：样品测定
方法学考察项均通过后，可对银杏叶中咖啡因在0.1ng/mL～10ng/mL范围的样品进行定 量研究。
1、采用本发明实施例1提供的方法以及BJS 201701方法(不同在于：将原供试品直接 用银杏叶样品替换，其他方法同)检测10批银杏叶样品含量，样品来源于安徽亳州中药材交 易市场。
结果见表3
表3：样品含量的测定结果
Figure BDA0002492543850000111
Figure BDA0002492543850000121
表3结果显示：
本发明方法检测的银杏叶中咖啡因的含量在0.1526ng/mL～6.1107ng/mL范围内，即银杏 叶中咖啡因的含量1.5260×10-6g/kg～61.1070×10-6g/kg范围内。BJS 201701方法检测的结果 在0.2222～10.2530ng/mL之间，即银杏叶中咖啡因的含量2.2220×10-6g/kg～102.5300×10-6 g/kg范围内。
本发明方法，方法学考察结果说明该方法得到的数据准确可靠；而完全按照BJS201701 方法测定银杏叶中咖啡因的含量，具有咖啡因色谱峰响应低、平行样品检测结果不稳定的缺 点，且本实验仅用外标法对其结果进行简单定量，因此其定量准确性低。
综上，采用本发明提供的方法进行检测，结果更加准确、稳定、可靠。
2、采用BJS 201701方法结合文献2中的银杏叶提取方法(超高效液相-串联质谱法研究 银杏叶提取物提取过程咖啡因的转移规律(张苹苹等，食品工业科技，2019年22期，34-49)， 检测21批银杏叶，样品1-10、11-20分别来源于安徽亳州和河北安国中药材交易市场。
检测结果见表4：
表4：采用BJS 201701方法检测含量的结果
Figure BDA0002492543850000122
Figure BDA0002492543850000131
表4结果显示：两个文献结合的方法检测银杏叶中咖啡因含量大致在0.0623-10.2530 ng/mL之间，即银杏叶中咖啡因的含量0.6230×10-6g/kg～102.5300×10-6g/kg范围内，结果具 有咖啡因色谱峰响应低、平行样品检测结果不稳定的缺点，因此定量准确性低。
结果表明：采用本发明提供的方法进行检测，结果更加准确、稳定、可靠。

Claims (10)

1.一种检测中药材银杏叶中咖啡因含量的方法，所述方法采用超高效液相色谱-串联质谱测定方法，其中，采用特定仪器，Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪串联Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪，进行测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：取银杏叶样品加入甲醇提取，提取液过滤，取续滤液离心得到上清液；
2)对照品溶液的制备：取咖啡因对照品用甲醇溶解并稀释至刻度；
3)检测取供试品溶液和对照品溶液，注入液质联用仪，以咖啡因对照品峰为参照峰，记录峰面积，根据峰面积计算供试品溶液中的咖啡因含量，其中，液质联用仪的色谱、质谱条件采用的仪器是Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪串联Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，液相色谱条件：色谱柱：Waters CORTECST3色谱柱(2.1×100mm,2.7μm)；流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5min，95％A；5～22min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A；流速：0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL；质谱参数条件：正离子模式；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1000L/h；多反应监测模式(MRM)；离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)；驻留时间分别为0.165s、0.165s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0V。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中，步骤1)供试品溶液的制备方法如下：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀,称取粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇8-12mL，密塞，称重，超声提取8-12min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液，高速离心10-20min，转数10000-15000转/分钟，得上清液，即为供试品溶液。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中，步骤2)对照品溶液的制备方法如下：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL咖啡因对照品溶液。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中步骤1)供试品溶液的制备方法如下：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀,称取粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称重，超声提取10min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液，高速离心15min，转数12000转/分钟，得上清液即为供试品溶液。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中步骤2)对照品溶液的制备方法如下：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL咖啡因对照品溶液。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中步骤3)色谱、质谱条件采用的仪器是Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪串联Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪，具体参数如下：
液相色谱条件：色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×100mm,2.7μm)；流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5min，95％A；5～22min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A；流速：0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL
质谱参数条件：正离子模式；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1000L/h；多反应监测模式(MRM)；离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)；驻留时间分别为0.165s、0.165s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0V 。
9.根据权利要求2-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤如下：
1)供试品溶液的制备方法如下：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀,称取粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇8-12mL，密塞，称重，超声提取8-12min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液，高速离心10-20min，转数10000-15000转/分钟，得上清液，即为供试品溶液；
2)对照品溶液的制备方法如下：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL咖啡因对照品溶液；
3)取供试品溶液和对照品溶液，注入液质联用仪，以咖啡因对照品峰为参照峰，记录峰面积，根据峰面积计算供试品溶液中的咖啡因含量；
其中，液相色谱条件：色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×100mm,2.7μm)；流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5min，95％A；5～22min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A；流速：0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL；质谱参数条件：正离子模式；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1000L/h；多反应监测模式(MRM)；离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)；驻留时间分别为0.165s、0.165s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0V。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤如下：
1)供试品溶液的制备方法如下：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀,称取粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称重，超声提取10min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液，高速离心15min，转数12000转/分钟，得上清液即为供试品溶液；
2)对照品溶液的制备方法如下：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL咖啡因对照品溶液；
3)取供试品溶液和对照品溶液，注入液质联用仪，以咖啡因对照品峰为参照峰，记录峰面积，根据峰面积计算供试品溶液中的咖啡因含量；
其中3)色谱、质谱条件采用的仪器是Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪串联Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪，具体参数如下：
液相色谱条件：色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×100mm,2.7μm)；流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5min，95％A；5～22min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A；流速：0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL
质谱参数条件：正离子模式；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1000L/h；多反应监测模式(MRM)；离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)；驻留时间分别为0.165s、0.165s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0V。
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