CN109917045B - 一种同时测定制狗脊饮片中5种成分含量的hplc方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种同时测定制狗脊饮片中5种成分含量的HPLC方法，该方法使用一个色谱条件同时对制狗脊中的曲酸、5‑HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛5种成分进行含量测定，操作简便，分析数据准确。梯度洗脱条件合理，在兼顾目标成分色谱峰峰形和分离度的条件下，大大缩短了检测时间；5个成分同时检测节省了分析人员的分析时间，提高了工作效率；流动相中有机相比例低，降低了检验成本，减少了环境污染。

Description

一种同时测定制狗脊饮片中5种成分含量的HPLC方法
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种同时测定制狗脊饮片中5种成分含量的HPLC方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
现行《中国药典》采用原儿茶酸作为狗脊饮片质量控制标准，其方法为：照高效液相色谱法(四部0512)测定。色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-1％冰醋酸溶液(5：95)为流动相；检测波长为260nm。理论板数按原儿茶酸峰计算应不低于3000。对照品溶液的制备：取原儿茶酸对照品适量，精密称定，加甲醇-1％冰醋酸溶液(70：30)混合溶液制成每1ml含50μg的溶液，即得。供试品溶液的制备：取本品粉末(过三号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇-1％冰醋酸溶液(70：30)混合溶液25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇-1％冰醋酸溶液(70：30)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含原儿茶酸(C7H6O4)不得少于0.020％。
发明人发现如上药典所载方法，由于原儿茶酸存在于多种植物中，专属性不强，无法得到准确的分析结果，无法提高药材的可控性、无法确保其临床疗效。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种同时测定制狗脊饮片中5种成分含量的HPLC方法，该方法具有较好的专属性，在提高分析数据准确性的同时，操作简便，能够大大缩短检测时间，同时提高药材的可控性，确保其临床疗效和广大患者的身体健康。
具体地，本发明的通过如下技术方案实现：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种同时测定制狗脊饮片中5种成分含量的方法，所述五种成分分别为曲酸、5-HMF(5-羟甲基糠醛)、原儿茶酸、麦芽酚和原儿茶醛。
本发明全文包含实施例中所述的制狗脊饮片为：
蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibcnium barometz(L.)J.S m.的干燥根茎，秋、冬二季采挖，除去泥沙，干燥；或去硬根、叶柄及金黄色绒毛，切厚片，干燥，为“生狗脊片”；取该“生狗脊片”，照《中国药典》2015年版通则0213炮制，即得制狗脊饮片(即炮制后的饮片)，比如在本发明的一些实施方式中，所述制狗脊饮片为取上述“生狗脊片”照烫法(通则0213)用砂烫至鼓起，放后除去残存绒毛，即得烫狗脊饮片。
现有研究发现，狗脊在炮制过程中会发生化学反应并伴随成分及其含量的变化，这些成分或含量的变化可能是炮制品活性增强的原因。与狗脊生品(未经炮制的狗脊，比如上述的“生狗脊片”)相比，制狗脊比如烫狗脊饮片中，会出现新增成分及原有成分含量的增加，在众多增量成分及新增成分中，本发明以以下五种成分为本发明的检测成分，包括增量成分原儿茶酸、原儿茶醛、曲酸和麦芽酚，以及新增成分5-HMF，其中，原儿茶酸、原儿茶醛及曲酸是狗脊中主要的抗炎、抗氧化的有效成分；5-HMF具有改善认知功能、抗氧化活性；麦芽酚具有促进成骨细胞分化作用；曲酸为酪氨酸酶抑制剂。
现行《中国药典》采用原儿茶酸作为狗脊质量控制标准以及有技术中也有同时检测原儿茶醛和原儿茶酸的方法，但原儿茶醛和原儿茶酸都可以存在于多种植物中，专属性不强，无法得到准确的分析结果，无法提高药材的可控性、无法确保其临床疗效。这也是本发明技术方案提出的初衷所在，本发明根据制狗脊的性质，在测定原儿茶醛和原儿茶酸的同时，还选择同时测定曲酸、5-HMF(5-羟甲基糠醛)、麦芽酚这3种活性成分以控制其质量，提高方法专属性，确保药效。通过本发明的方法在同一条件下对这些成分进行检测，根据含量的变化及特定成分的检出，还可为制狗脊饮片与其他生药饮片、制狗脊饮片与生狗脊片的区分提供依据。
本发明所述方法采用高效液相法(照《中国药典》2015年版通则0512的高效液相色谱法测定)。
其中，色谱条件为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
以甲醇为流动相A，以甲酸-甲酸铵溶液为流动相B。
采用梯度洗脱方试，梯度洗脱程序如表1所示。
表1梯度洗脱程序
Figure BDA0002026197590000031
流速0.8-1.0mL·min-1；柱温35℃，理论板数不低于2000。
曲酸、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛的检测波长为280nm，5-HMF的检测波长为260nm。
进样量为5-20μL。
所述的梯度洗脱方式为梯度性地改变洗脱液的组分(成分、离子强度等)或pH，以期将色谱柱上不同的组分在合理的时间内洗脱出来的方法。
申请人对波长条件进行了筛选，申请人发现在280nm处，5种成分均有吸收，但5-HMF在此波长下灵敏度过高，部分样品色谱峰饱和，影响测定准确度，申请人经进一步选择后发现5-HMF在260nm处虽然吸收相对较弱，但能够实现较好的测定效果，故选择吸收相对较弱的260nm进行测定。
关于柱温的选择，申请人在实验过程中发现，当柱温在35℃以下时，比如为25-30℃时，色谱峰无法基线分离，保留时间延后，增加分析时长。比如在某些实施方式中，柱温为25℃时，色谱峰分离度差，尤其原儿茶酸和麦芽酚的分离度小于1.5，并且各色谱峰保留时间延长20-45％不等，增加了分析时间。
现有方法常选用甲醇-0.1％磷酸溶液或者乙腈-1％冰醋酸溶液或者甲醇-1％冰醋酸作为流动相检测原儿茶醛和/或原儿茶酸，比例为4-15：85-96，比如甲醇-0.1％磷酸溶液(15:85)、甲醇-0.1％磷酸溶液(10:90)、甲醇-1％冰醋酸(4:96)或者乙腈-1％冰醋酸(5:95)，并且采用等度洗脱的方式，然而，这些流动相无法满足本发明上述五种成分的同时检测，比如，当流动相中含有乙腈时，往往无法实现基线分离，发明人推测原因可能在于待测成分极性大，供试品中含糖量高，洗脱能量过强；比如，甲醇-1％冰醋酸为流动相时，色谱峰拖尾明显，各色谱峰的拖尾因子在0.5-0.87之间，远低于药典规定的0.95-1.05，进一步改变比例，以及改变等度洗脱为梯度洗脱(比如按本发明的梯度洗脱程序)，都无法改善该问题，当流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液时，出现的问题与之相似。
不同于现有方法，本发明以甲醇为流动相A，以甲酸-甲酸铵溶液为流动相B，并按照表1的梯度洗脱程序进行洗脱时，可同时对5种成分进行检测，且各成分均具有较好的峰形、且各成分间分离度较好。在本发明的某些实施方式中，流动相B可选用0.1％甲酸-0.1％甲酸铵溶液(即每100ml水中，含有0.1g甲酸及0.1g甲酸铵)。在本发明的一些实施方式中，甲酸铵的浓度范围可以为0.1％-0.3％，即流动相B的组成可以为每100ml水中，含有0.1g甲酸及0.1-0.3g甲酸铵。
此外，发明人还筛选了多种其他流动相，包括甲醇-0.1％甲酸溶液-0.01％三乙胺溶液、甲醇-1％冰醋酸溶液-0.04％三乙胺溶液、甲醇-0.1％甲酸溶液-0.04％氨溶液等，并在改变配比以及洗脱方式的情况下应用于本发明的技术方案中，结果发现，使用上述流动相时，等度洗脱的效果要优于梯度洗脱，但是均无法获得较好的峰形和分离度，尤其麦芽酚和原儿茶醛的分离度不好，两峰甚至无法分离拖尾情况比较严重。
现有方法中常采用甲醇或甲醇-1％冰醋酸(比如70:30)作为溶剂配制供试品溶液，虽然甲醇-1％冰醋酸能够溶解原儿茶酸、原儿茶醛、5-HMF、曲酸及麦芽酚五种成分，但是直接在狗脊饮片中进行提取的提取率不高，并不利于后续检测。为了更好地实现本发明，本发明以水为溶剂配制供试品溶液。不同于常规认识，本发明以水为溶剂配制供试品溶液。发明人发现水能够很好的溶解5种待测成分，与其他提取溶剂相比，在相同提取时间内能够获得更好的提取率，并且在保证提取率的同时，减少了小极性杂质的含量，对色谱柱污染小，环保廉价。
在本发明的一些实施方式中，供试品溶液的制备包括：精密称取制狗脊饮片细粉适量，精密加入水适量，密塞，称定重量；超声、超声过程中不时振摇，超声后放冷，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述超声时间为2-5h，超声功率为250W，超声频率为40kHz。
在本发明的一个具体的实施方式中，所述供试品溶液的制备包括：精密称取制狗脊饮片细粉约2g，精密加入水25mL，密塞，称定重量；超声2h(超声功率为250W，超声频率为40kHz)，超声过程中不时振摇；超声后放冷，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
本发明以甲醇-1％冰醋酸为溶剂配制对照品溶液，在本发明的一些实施方式中，甲醇与1％冰醋酸的体积比为70：30。
在本发明的一些实施方式中，对照品溶液的制备包括：取曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛对照品各适量，精密称定，加甲醇-1％冰醋酸(70：30)溶液配制成浓度分别为103.9、964.0、504.4、104.9及105.8μg·mL-1的混合对照品储备液，精密吸取上述储备液5mL，置于100mL容量瓶中，加甲醇-1％冰醋酸(70：30)溶液稀释至刻度，摇匀，即得含曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛分别为5.20、48.20、25.22、5.24及5.29μg·mL-1的混合对照品溶液。
本发明所述方法包括测定时分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-20μL、优选10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
在本发明的一些实施方式中，本发明以甲醇-1％冰醋酸(70:30)溶液稀释各对照品溶液，依法测定其色谱峰S/N(信噪比)，以S/N为10和3相应的浓度分别作为其LOQ与LOD。
5种成分的定量限和检测限分别为：曲酸的LOQ为0.03μg·mL-1、LOD为0.01μg·mL-1；5-HMF的LOQ为0.20μg·mL-1、LOD为0.05μg·mL-1；原儿茶酸的LOQ为0.35μg·mL-1、LOD为0.07μg·mL-1；麦芽酚的LOQ为0.05μg·mL-1、LOD为0.02μg·mL-1；原儿茶醛的LOQ为0.05μg·mL-1、LOD为0.01μg·mL-1。
在本发明一个较为具体的实施方式中，本发明所述的同时测定制狗脊饮片中5种成分含量的方法，包括以下条件和步骤：
照《中国药典》2015年版通则0512的高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1％的甲酸-0.1％甲酸铵溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→33min→45min→70min；流动相A：4％→4％→95％→4％，采用波长切换方式检测：在280nm波长下检测曲酸、原儿茶酸、麦芽酚、原儿茶醛；在260nm波长下检测5-HMF；柱温35℃；理论板数应不低于2000。
对照品溶液的制备：取曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛对照品各适量，精密称定，加甲醇-1％冰醋酸(70:30)溶液配制成浓度分别为103.9、964.0、504.4、104.9及105.8μg·mL-1的混合对照品储备液；精密吸取上述储备液5mL，置于100mL容量瓶中，加甲醇-1％冰醋酸(70：30)溶液稀释至刻度，摇匀，即得含上述成分分别为5.20、48.20、25.22、5.24及5.29μg·mL-1的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取制狗脊饮片细粉约2g，精密加入水25mL，密塞，称定重量，超声2h，超声功率250W，超声频率40kHz，超声过程中振摇，超声后放冷，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明使用同一个色谱条件，同时对制狗脊饮片中曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛5个成分进行了含量测定，操作简便，分析数据准确。梯度洗脱条件合理，在兼顾目标成分色谱峰峰形和分离度的条件下，大大缩短了检测时间；同时提高了药材的可控性，从而确保了其临床疗效和广大患者的身体健康。此外，本发明的方法也可将制狗脊的质量与产地、批次相联系，为其区分提供一定依据。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1中260nm处混合对照品(A)、260nm处样品(B)、280nm处混合对照品(C)、280nm处样品(D)的HPLC图谱；1代表曲酸、2代表5-HMF、3代表原儿茶酸、4代表麦芽酚、5代表原儿茶醛。
图2为实施例2中其他条件不变，改变洗脱条件时280nm处的HPLC图谱；
其中，(A)为流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液-0.01％三乙胺溶液(4:48:48)等度洗脱时，混合对照品溶液的HPLC图谱；(B)为流动相为甲醇-1％冰醋酸溶液(4:96)等度洗脱时，混合对照品溶液的HPLC图谱；(C)为流动相为甲醇-1％冰醋酸溶液-0.04％三乙胺溶液(4:48:48)等度洗脱时，混合对照品溶液的HPLC图谱；(D)为流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液-0.04％氨溶液(4:48:48)等度洗脱时，混合对照品溶液的HPLC图谱；1代表曲酸、2代表5-HMF、3代表原儿茶酸、4代表麦芽酚、5代表原儿茶醛。
图3为实施例2中其他条件不变，柱温25℃时，供试品溶液的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中未注明具体来源的试剂及原料，通常可通过常规途径购买获得，其使用方式按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：一种同时测定制狗脊饮片中5成分含量的HPLC方法，步骤如下：
照《中国药典》2015年版四部0512的高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，0.1％甲酸-甲酸铵溶液为流动相B，按表1梯度洗脱；流速1.0mL·min-1；柱温35℃；检测波长280nm(曲酸、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛)、260nm(5-HMF)；进样量10μL。在该色谱条件下，各检测成分均达到基线分离，理论塔板数均大于2000。
表1梯度洗脱程序
Figure BDA0002026197590000081
对照品溶液的制备：取曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛对照品(曲酸、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛对照品购自天津希恩思生化科技有限公司，纯度分别为98％、97％、99％、98％，批号分别为K-60000、D-52430、H-65915、D-14233；5-HMF对照品购自上海士锋生物科技有限公司，纯度≥99％，批号18071109。)各适量，精密称定，加甲醇-1％冰醋酸(70:30)溶液配制成浓度分别为103.9、964.0、504.4、104.9及105.8μg·mL-1的混合对照品储备液。精密吸取上述储备液5ml，置于100ml容量瓶中，加甲醇-1％冰醋酸(70:30)溶液稀释至刻度，摇匀，即得含上述成分分别为5.20、48.20、25.22、5.24及5.29μg·mL-1的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取制狗脊饮片细粉(购于山东省建联嘉盛中药有限公司)约2g，精密加入水25ml，密塞，称定重量。超声2h(功率250W，频率40kHz)，超声过程中振摇。超声后放冷，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。其中，测得曲酸、5-HMF、原儿茶酸、原儿茶醛及麦芽酚的保留时间、拖尾因子(对称因子)及相邻峰之间的分离度如表2所示。HPLC图谱如图1所示，各成分均具有较好的峰形、且各成分间分离度较好。根据中国药典2015版，以峰高定量时，拖尾因子用于评价色谱峰的对称性，根据中国药典2015版，高效液相色谱法通则0512要求，拖尾因子(也称对称因子)以峰高定量应在0.95～1.05之间；以及，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5。
表2
保留时间(min) 拖尾因子 分离度
曲酸 7.02 0.993 9.83
5-HMF 13.64 0.968 11.57
原儿茶酸 19.68 0.955 8.35
原儿茶醛 12.41 0.992 1.97
麦芽酚 31.4 1.07 9.17
实施例2含量测定实验
1、仪器、试药和供试样品
共收集制狗脊饮片(定义如发明内容中所述)11批次，见表3。曲酸、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛对照品购自天津希恩思生化科技有限公司，纯度分别为98％、97％、99％、98％，批号分别为K-60000、D-52430、H-65915、D-14233；5-HMF对照品购自上海士锋生物科技有限公司，纯度≥99％，批号18071109。色谱纯甲醇、甲酸及甲酸铵购自美国Tedia公司，实验用水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。安捷伦公司Agilent 1260高效液相色谱仪(配备G1311B四元梯度泵，G1367E自动进样器，G1316A柱温箱，G4212B二极管阵列检测器，Agilent色谱工作站)；梅特勒公司Mettler AG135十万分之一电子分析天平；昆山市超声仪器有限公司KQ5200DE数控超声清洗仪。
表3制狗脊饮片样品来源
Figure BDA0002026197590000091
Figure BDA0002026197590000101
2、检测波长的选择
在280nm处，5种成分均有吸收，但5-HMF在此波长下灵敏度过高，部分样品色谱峰饱和，影响测定准确度。发明人经进一步选择后发现5-HMF在260nm处虽然吸收相对较弱，但能够实现较好的测定效果，故选择吸收相对较弱的260nm进行测定。
3、流动相选择
有机相(流动相A)筛选了甲醇及乙腈，由于待测成分极性大，供试品中含糖量高，乙腈洗脱能量过强，无法实现基线分离；水相(流动相B)筛选了0.1％甲酸溶液、1％冰醋酸溶液与氨水、三乙胺、醋酸铵或甲酸铵的配伍，并尝试了多种比例及洗脱方式，使用上述流动相(除1％甲酸-甲酸铵溶液外)时，等度洗脱的效果要优于梯度洗脱，但是均无法获得较好的峰形和分离度，尤其麦芽酚和原儿茶醛的分离度不好，两峰甚至无法分离，拖尾情况比较严重。为举例说明，发明人提供了几组流动相的比较，除流动相及梯度洗脱方式的不同外，其他检测步骤及条件同实施例1，检测结果如图2所示。其中，(A)为流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液-0.01％三乙胺溶液(4:48:48)等度洗脱时，混合对照品溶液的HPLC图谱；(B)为流动相为甲醇-1％冰醋酸溶液(4:96)等度洗脱时，混合对照品溶液的HPLC图谱；(C)为流动相为甲醇-1％冰醋酸溶液-0.04％三乙胺溶液(4:48:48)等度洗脱时，混合对照品溶液的HPLC图谱；(D)为流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液-0.04％氨溶液(4:48:48)等度洗脱时，混合对照品溶液的HPLC图谱。
此外，为了更好地了解流动相的选择对检测结果的影响，发明人进一步提供了图2中相关参数(包括保留时间、拖尾因子、分离度)的数据，如下表4-6所示。根据中国药典2015版，以峰高定量时，拖尾因子用于评价色谱峰的对称性，根据中国药典2015版，高效液相色谱法通则0512要求，拖尾因子(也称对称因子)以峰高定量应在0.95～1.05之间；以及，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5。
表4
Figure BDA0002026197590000111
表5
Figure BDA0002026197590000112
表6
Figure BDA0002026197590000113
综合上述实验，最终确定有机相为甲醇，水相为0.1％甲酸-甲酸铵，且按照表1所示梯度洗脱程序进行洗脱时，各待测组分分离度及色谱峰对称性最佳。
4、梯度洗脱条件的选择
对照品溶液的制备：取曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛对照品各适量，精密称定，加甲醇-1％冰醋酸(70：30)溶液配制成浓度分别为103.9、964.0、504.4、104.9及105.8μg·mL-1的混合对照品储备液。精密吸取上述储备液5mL，置于100mL容量瓶中，加甲醇-1％冰醋酸(70：30)溶液稀释至刻度，摇匀，即得含上述成分分别为5.20、48.20、25.22、5.24及5.29μg·mL-1的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取制狗脊饮片细粉约2g，精密加入水25mL，密塞，称定重量。超声2h(功率250W，频率40kHz)，超声过程中振摇。超声后放冷，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
通过摸索，发现按表1梯度进行洗脱时，供试品溶液5个成分均能达到基线分离，色谱峰对称性良好。
图2为其他条件不变时，改变洗脱条件时280nm处的HPLC图谱。其中(A)为流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液-0.01％三乙胺溶液(4:48:48)等度洗脱时，混合对照品溶液的HPLC图谱；(B)为流动相为甲醇-1％冰醋酸溶液(4:96)等度洗脱时，混合对照品溶液的HPLC图谱；(C)为流动相为甲醇-1％冰醋酸溶液-0.04％三乙胺溶液(4:48:48)等度洗脱时，混合对照品溶液的HPLC图谱，(D)为流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液-0.04％氨溶液(4:48:48)等度洗脱时，混合对照品溶液的HPLC图谱；1代表曲酸、2代表5-HMF、3代表原儿茶酸、4代表麦芽酚、5代表原儿茶醛。将表4-6中的数据进行比较，此处4种洗脱条件各色谱峰拖尾明显，或无法基线分离，故优选实施例1中的洗脱条件为最佳洗脱条件。
另外申请人考察了其他梯度洗脱条件，为保证待测物质全部出峰，甲醇：0.1％甲酸-甲酸铵溶液(4:96)洗脱时间不能少于33分钟；为将色谱柱上小极性杂质洗脱干净，甲醇：0.1％甲酸-甲酸铵溶液(95:5)洗脱时间不得少于12分钟；用0.1％甲酸-甲酸铵溶液(4:96)平衡色谱柱时间不得少于25分钟，否则平衡效果不佳，影响下一次进样。
5、柱温的选择
柱温35℃以下时，色谱峰无法基线分离，保留时间延后，增加分析时长。
图3为其他条件不变时，柱温25℃时，供试品溶液的HPLC图谱。可见相较于柱温35℃时，对照品3、4色谱峰分离度差，尤其原儿茶酸和麦芽酚的分离度远小于1.5，各色谱峰保留时间延长20-45％不等，增加分析时间。
6、标准曲线和线性关系的考察
取曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛对照品各适量，精密称定，加甲醇-1％冰醋酸(70：30)溶液配制成浓度分别为103.9、2410.0、504.4、104.9及105.8μg·mL-1的混合对照品溶液。分别稀释5、10、20、50、100、200倍，吸取以上6个浓度对照品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱方法测定，记录峰面积。各成分的进样量为横坐标，相应峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果表明各成分在相应浓度范围内线性关系良好(见表7)。
表7线性考察结果
Figure BDA0002026197590000131
7、精密度试验
精密吸取混合对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，各连续测定6次，记录峰面积，曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛对照品峰面积RSD值分别为0.47％、0.38％、0.40％、0.91％、0.27％(根据中国药典2015版，该值应不超过2％)。表明仪器精密度良好。
8、稳定性试验
取制备的同一供试品溶液分别于0h、2h、6h、10h、16h、24h进样，记录峰面积。曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛对照品峰面积RSD值分别为1.79％、0.50％、0.51％、1.30％、0.78％(根据中国药典2015版，该值应不超过2％)。表明供试品在24h内稳定性良好。
9、重复性试验
取同一批次制狗脊饮片，照“4、梯度洗脱条件筛选”项下方法平行制备6份供试品溶液，按上述方法测定，以外标法计算5种成分含量。样品中曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛平均含量分别为0.007％、0.272％、0.050％、0.004％及0.011％；RSD值分别为4.35％(根据中国药典2015版，该值应不超过6％)、1.00％(根据中国药典2015版，该值应不超过3％)、2.01％(根据中国药典2015版，该值应不超过4％)、4.12％(根据中国药典2015版，该值应不超过6％)及2.84％(根据中国药典2015版，该值应不超过4％)。表明方法重复性良好。
10、回收率试验
取“9、重复性试验”项下已测知含量的样品，每份1g，分别精密加入与1g样品中各成分等量各对照品溶液，照“4、梯度洗脱条件筛选”项下方法平行制备6份供试品溶液，按上述方法测定，以外标法计算5种成分含量。曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛回收率分别88.9％(根据中国药典2015版，该值应在80％-115％)、102.8％(根据中国药典2015版，该值应在90％-108％)、99.7％(根据中国药典2015版，该值应在85％-110％)、85.2％(根据中国药典2015版，该值应在80％-115％)、85.9％(根据中国药典2015版，该值应在80％-115％)；RSD值分别为3.35％(根据中国药典2015版，该值应不超过6％)、1.03％(根据中国药典2015版，该值应不超过3％)、1.95％(根据中国药典2015版，该值应不超过4％)、3.70％(根据中国药典2015版，该值应不超过6％)及0.41％(根据中国药典2015版，该值应不超过4％)。表明该方法的准确度良好。
11、LOQ/LOD(定量限/检测限)
以甲醇-1％冰醋酸(70:30)溶液稀释各对照品溶液，依法测定其色谱峰S/N(信噪比)，以S/N为10和3相应的浓度分别作为其LOQ与LOD。结果见表8。
表8 LOQ/LOD结果
Figure BDA0002026197590000151
12、样品测定
取表3中11批次样品，照“4、梯度洗脱条件筛选”项下方法制备供试品溶液，每批次平行3份，依实施例1方法分别测定，以外标法计算每批次饮片中各成分含量。结果见表9。
表9含量测定结果
Figure BDA0002026197590000152
收集的不同产地的11批次的制狗脊饮片在同一条件下均可检出曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚和原儿茶醛，根据测定结果，该来自不同产地的11批次饮片中各成分含量存在差异，因此，该方法也可将制狗脊的质量与产地、批次相联系，为其区分提供一定依据。

Claims (13)

1.一种同时测定制狗脊饮片中5种成分含量的方法，所述五种成分分别为曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚和原儿茶醛；所述方法为高效液相法，
其中，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，甲酸-甲酸铵溶液为流动相B，梯度洗脱，0～33min时，流动相A占总流动相4％；33～45min，流动相A占比由4％升高到95％，45～70min时，流动相A占比回到4％；流速0.8-1.0mL·min-1；柱温35℃，理论板数不低于2000；曲酸、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛的检测波长为280nm、5-HMF的检测波长为260nm；进样量5-20μL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相B为甲酸-甲酸铵溶液，其由甲酸和甲酸铵溶解于水中配制得到，其中，甲酸的浓度为0.1％，0.1％为100ml溶剂中含有0.1g甲酸，甲酸铵的浓度为0.1-0.3％，0.1％-0.3％为100ml溶剂中含有0.1g-0.3g甲酸铵。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相B为0.1％的甲酸-0.1％甲酸铵溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中配制对照品溶液时以甲醇-1％冰醋酸为溶剂，其中甲醇与1％冰醋酸的体积比为70：30。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备包括：取曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛对照品各适量，精密称定，加甲醇-1％冰醋酸溶液配制成浓度分别为103.9、964.0、504.4、104.9及105.8μg·mL-1的混合对照品储备液，精密吸取上述储备液5mL，置于100mL容量瓶中，加甲醇-1％冰醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得含曲酸、5-HMF、原儿茶酸、麦芽酚及原儿茶醛分别为5.20、48.20、25.22、5.24及5.29μg·mL-1的混合对照品溶液；所述甲醇-1％冰醋酸溶液配比为70：30。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中配制供试品溶液时以水为溶剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括：精密称取制狗脊饮片细粉适量，精密加入水适量，密塞，称定重量；超声，超声过程中不时振摇，超声后放冷，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其中超声时间为2-5h，超声功率为250W，超声频率为40kHz。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括：精密称取制狗脊饮片细粉约2g，精密加入水25mL，密塞，称定重量；超声2h，超声过程中不时振摇；超声后放冷，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括测定时分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括测定时分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述制狗脊饮片为将生狗脊片照《中药药典》2015年版通则0213炮制制得；其中，所述生狗脊片为壳蕨科植物金毛狗脊Cibcnium barometz(L.)J.Sm.的干燥根茎，秋、冬二季采挖，除去泥沙，干燥；或去硬根、叶柄及金黄色绒毛，切厚片，干燥，制得生狗脊片。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述制狗脊饮片为烫狗脊，照烫法用砂烫至鼓起，放后除去残存绒毛制得。
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