CN111184763A - 一种云南獐牙菜提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有较强抗氧化活性的云南獐牙菜提取物，该提取物中9‑脱氧‑9‑(1,3,5,8‑四羟基
酮7‑基)‑‑龙胆内酯、1,3,5,8‑四羟基
酮、以及雏菊叶龙胆酮的总含量为0.580～0.620mg/g；上述提取物以云南獐牙菜干燥全草为原料，通过以下步骤制备得到：采用浓度为75％～85％乙醇热回流提取1～2次，每次提取2小时，合并提取液，浓缩得浸膏；取浸膏2倍体积的水悬浮浸膏，得悬浮药液；将悬浮药液进行柱层析，依次采用2倍柱体积蒸馏水、4倍柱体积乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压干燥，即得所述云南獐牙菜提取物。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种具有较强抗氧化活性的云南獐牙菜提取物。
背景技术
云南獐牙菜(Swertia yunnanensis Burk.)为龙胆科(Gentianaceae)獐牙菜属(Swertia L.)植物，产于云南。该属植物有170多种，我国约有70多种，其中约20种可作为药用，主要用于治疗肝胆疾病和炎症性疾病。云南獐牙菜全草入药，有清肝利胆，清热除湿的功效，主治急性黄疸型肝炎、胆囊炎等。
在前期对云南獐牙菜的活性成分研究中，分离得到三种具有强抗氧化活性的单体成分：9-脱氧-9-(1,3,5,8-四羟基
酮7-基)--龙胆内酯、1,3,5,8-四羟基
酮、以及雏菊叶龙胆酮。作为单体，各成分都具有较强的抗氧化活性，但其分离步骤复杂，且三种成分分别位于不同的提取分离部位，不易于同时得到，同时纯化过程对经验判断要求高，不易产业化。并且由于单体的得率低，也不适合大批量生产。
发明内容
本发明的目的是为了得到一种制备工艺简单、且能够标准化生产的云南獐牙菜提取物，该提取物具有较强抗氧化活性。
为了达到上述目的，本发明提供了一种云南獐牙菜提取物，该云南獐牙菜提取物中9-脱氧-9-(1,3,5,8-四羟基
酮7-基)--龙胆内酯、1,3,5,8-四羟基
酮、以及雏菊叶龙胆酮的总含量为0.580～0.620mg/g；上述提取物以云南獐牙菜干燥全草为原料，通过以下步骤制备得到：采用浓度为75％～85％乙醇热回流提取1～2次，每次提取2小时，合并提取液，浓缩得浸膏；取浸膏2倍体积的水悬浮浸膏，得悬浮药液；将悬浮药液进行柱层析，依次采用2倍柱体积蒸馏水、4倍柱体积乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压干燥，即得所述云南獐牙菜提取物；乙醇热回流提取时，每次提取用乙醇与原料云南獐牙菜干燥全草的用量比为4L:1Kg；柱层析用填料采用D101、AB-8或HP-20型大孔树脂，柱体积与悬浮药液体积比为1:1；柱层析时洗脱用乙醇浓度为50％～60％。
优选的，乙醇热回流提取用乙醇浓度为85％。
优选的，柱层析时洗脱用乙醇浓度为50％。
优选的，乙醇热回流提取次数为2次。
优选的，柱层析用填料采用D101型大孔树脂。
本发明还提供了上述云南獐牙菜提取物在制备具有抗氧化活性药物方面的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明以具有强抗氧化活性的三种单体化合物含量、总提物得率及抗氧化活性为指标，对云南獐牙菜总提物制备进行简易化、标准化研究，得到最佳制备工艺条件。在本发明工艺参数下制备得到的云南獐牙菜产量高、且具备较强的抗氧化活性，方便对其进一步拓展药用研究，并能够快速、有效地实现批量生产。
附图说明
图1为本发明采用的三种标准品化合物混标的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
总提物提取分离工艺筛选试验
提取分离步骤：
取云南獐牙菜干燥全草，采用4倍体积质量比(L/kg)的乙醇热回流提取，每次提取2小时，合并提取液，浓缩得浸膏；取浸膏2倍体积的水悬浮浸膏，得悬浮药液；将悬浮药液进行柱层析，依次采用2倍柱体积蒸馏水、4倍柱体积乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压干燥，即得。
以乙醇热回流提取浓度(B)、提取次数(A)、柱层析填料(C)、乙醇洗脱浓度(D)为关键因子，进行正交试验，正交试验提取因素水平表如下表1所示。
表1正交试验提取因素水平表
对得到的总提物产率、三种单体化合物含量进行测定。
三种单体化合物的含量测定条件(HPLC法)如下：
色谱条件与系统适应性试验：采用Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈(A)-磷酸水(B)为流动相，按表2的条件进行梯度洗脱；柱温为20℃；检测波长为254nm；
表2流动相设置条件
标准品(三种单体化合物混标)制备：精密称三个对照品适量，用甲醇配成含9-脱氧-9-(1,3,5,8-四羟基
酮7-基)--龙胆内酯、1,3,5,8-四羟基
酮、以及雏菊叶龙胆酮浓度分别为550.1、443.2、324.2μg·mL-1的混合对照品储备液，备用。
如图1所示，为标准品HPLC色谱图，三种单体化合物9-脱氧-9-(1,3,5,8-四羟基
酮7-基)--龙胆内酯、1,3,5,8-四羟基
酮、以及雏菊叶龙胆酮依次于11.5min、46.5min、48.8min洗脱出峰。
正交试验各提取物产率、三种单体化合物总含量如下表3所示。
表2正交试验(34)直观分析表
表3综合评分方差分析结果
| 因素 | 偏差平方和 | 自由度 | F比 | F临界值 | 显著性 |
| A | 77.374 | 2 | 1.756 | 19.000 | |
| B | 2028.405 | 2 | 46.036 | 19.000 | P<0.05 |
| C | 44.061 | 2 | 1 | 19.000 | |
| D | 232.22 | 2 | 5.27 | 19.000 | |
| 误差 | 44.06 | 2 |
根据直观分析和方差分析结果，综合评分的极差大小显示各因素作用主次为B>D>A>C，即乙醇的提取浓度对有效成分含量影响最大，其次为乙醇洗脱浓度、提取次数、大孔树脂填料种类，最优水提醇沉工艺组合为A2B3C1D2。即：云南獐牙菜干燥全草用85％乙醇热回流提取2次，每次提取2小时，合并提取液，将提取液浓缩得到浸膏，再用2倍体积水混悬，得到混悬药液。上样到大孔树脂D101进行吸附，用2倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，再用4倍柱体积50％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压干燥，得到云南獐牙菜有效部位提取物。
实施例2
抗氧化活性研究
(1)材料、仪器与试剂
实验材料：云南獐牙菜干燥全草按照表1中A1B1C1D1、A1B2C2D2、A1B3C3D3、A2B1C2D3、A2B2C3D1、A2B3C1D2、A3B1C3D2、A3B2C1D3、A3B3C2D1工艺提取的提取物。
仪器与试剂
(2)供试液的配制
①待测化合物标准液的配制
分别将提取物精确称取10mg至10ml容量瓶中，用乙醇定容，通过超声、加热等方法使物质完全溶解于乙醇溶剂中，如果样品溶解性不好，可以加入不超过溶液体积1％的DMSO溶剂助溶使之完全溶解，静置待用。
②对照品Trolox标准液的配制
精确称取Trolox 5.6mg至2ml容量瓶中，用乙醇定容，静置待用。
③待测液的配制
分别以待测化合物和对照品的标准液为基准，依次稀释，所得溶液静置待用。
(2)DPPH溶液的配制
精确称取DPPH试剂0.5g至2ml容量瓶中，以乙醇定容至2ml，避光保存，待用。
(3)测量样品在492nm下的吸光度
向100μL DPPH溶液中加入100μL样品稀释液。混匀，25℃下暗处放置40min，在492nm下测定吸光值Ai。同时测定100μL的DPPH溶液与100μL乙醇混合液的吸光值Ao，以及100μL的样品稀释液与100μL乙醇混合液的吸光值Aj。
(4)数据处理
自由基清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ao]×100％
(5)结论
以上试验目的主要研究不同提取方法提取的云南獐牙菜提取物清除自由基的能力，不同浓度供试液的活性数据如下表4所示(所有样品浓度值均为终浓度)。
表4不同提取物的抗氧化活性
将各组的活性与对照品Trolox进行比对，可以发现提取物A1B2C2D2、A1B3C3D3、A2B3C1D2具有较强的抗氧化活性，且以提取物A2B3C1D2为最佳；提取物A3B3C2D1、A2B2C3D1次之，化合物A1B1C1D1、A2B1C2D3、A3B1C3D2、A3B2C1D3的活性较差。
综合实施例1提取分离工艺筛选试验，以A2B3C1D2为提取工艺条件制备得到的提取物为最佳产物。
实施例3
以50kg云南獐牙菜干燥全草，用200L 85％乙醇热回流提取2次，每次提取2小时，收集提取液，将提取液浓缩得到浸膏，再用2倍体积水混悬，得到混悬药液。上样到大孔树脂D101进行吸附，用2倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，再用4倍柱体积50％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压干燥，得到云南獐牙菜有效部位提取物3.815kg。HPLC法测定该有效部位提取物中9-脱氧-9-(1,3,5,8-四羟基
酮7-基)--龙胆内酯、1,3,5,8-四羟基
酮、以及雏菊叶龙胆酮三种物质的含量分别为0.095、0.206、0.286。
Claims (6)
1.一种云南獐牙菜提取物，其特征在于：该提取物以云南獐牙菜干燥全草为原料，通过以下步骤制备得到：采用浓度为75％～85％乙醇热回流提取1～2次，每次提取2小时，合并提取液，浓缩得浸膏；取浸膏2倍体积的水悬浮浸膏，得悬浮药液；将悬浮药液进行柱层析，依次采用2倍柱体积蒸馏水、4倍柱体积乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压干燥，即得所述云南獐牙菜提取物；所述乙醇热回流提取时，每次提取用乙醇与原料云南獐牙菜干燥全草的用量比为4L:1Kg；所述柱层析用填料采用D101、AB-8或HP-20型大孔树脂，柱体积与悬浮药液体积比为1:1；所述柱层析时洗脱用乙醇浓度为50％～60％；所述云南獐牙菜提取物中9-脱氧-9-(1,3,5,8-四羟基
酮7-基)--龙胆内酯、1,3,5,8-四羟基
酮、以及雏菊叶龙胆酮的总含量为0.580～0.620mg/g。
2.根据权利要求1所述的云南獐牙菜提取物，其特征在于：所述乙醇热回流提取用乙醇浓度为85％。
3.根据权利要求2所述的云南獐牙菜提取物，其特征在于：所述柱层析时洗脱用乙醇浓度为50％。
4.根据权利要求3所述的云南獐牙菜提取物，其特征在于：所述乙醇热回流提取次数为2次。
5.根据权利要求4所述的云南獐牙菜提取物，其特征在于：所述柱层析用填料采用D101型大孔树脂。
6.权利要求1至5任一所述云南獐牙菜提取物在制备具有抗氧化活性药物方面的应用。
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