CN115166078A - 一种药物组合物的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种药物组合物的检测方法，所述的药物组合物为含有贯叶金丝桃提取物的组合物，利用液相色谱法其进行检测。所述液相色谱检测条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，检测波长为360nm,采用梯度洗脱。该方法具有快速、高效、稳定、准确等优点，能够快速、有效地对药物组合物进行检测。

Description

一种药物组合物的检测方法
本发明是申请日为2016年2月4日，申请号为201610081226.8，名称为“一种药物组合物的检测方法”的中国发明专利的分案申请。
技术领域
本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种药物组合物的检测方法。
背景技术
贯叶金丝桃已经有2400年的使用历史，近年来对贯叶金丝桃的研究热点放在抗抑郁功效方面含有多种具生物活性的化学成分，其中主要是苯并二蒽酮类化合物、金丝桃素和伪金丝桃素；多种芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、间苯三酚类化合物等；其中以芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素为主要化合物。现代药理证明，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素等均对在小鼠FST中均表现出明显的抗抑郁活性，是贯叶金丝桃抗抑郁症的主要活性成分。
舒肝解郁胶囊是由贯叶金丝桃和刺五加为原料，采用现代制药工艺制备而成的中成药，具有疏肝解郁、健脾安神的功效，临床常用于轻、中度抑郁症属肝郁脾虚证者，症见情绪低落、兴趣下迟滞、入睡困难、早醒、多梦、紧张不安、急躁易怒、食少纳呆、胸闷、疲乏无力、多汗、疼痛、舌苔白或腻，脉弦或细。由于舒肝解郁胶囊同时包含了贯叶金丝桃和刺五加两种药材的多种化学成分，包括：金丝桃苷、芦丁、槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、刺五加苷E、紫丁香苷及异嗪皮啶等，在定性和定量检测中常常互相干扰，同时由于贯叶金丝桃提取物中主要活性物质金丝桃苷、芦丁、异槲皮苷、槲皮素母核结构相同、性质相似，要利用HPLC方法准确将目标物质同其他杂质有效分离并且定量分析存在较大难度，成方制剂的质量控制更为困难。
《中国药典(2015版)》和韩林等所介绍的高效液相色谱检测方法[金丝桃苷含量的RP-HPLC法测定，时珍国医国药2012年第23卷第10期]均无法检测出槲皮素；例如钱秋霞等所报道的方法[钱秋霞等，HPLC法测定不同干燥方法的贯叶连翘中黄酮类化合物的含量，中草药,2001，32,5]其分离度达不到分离要求(分离度一般要求大于1.5)，其主要物质峰中还包含大量杂质。因此，建立一种简单、有效、灵敏度高的多成分高效液相色谱检测方法，对于贯叶金丝桃及含有贯叶金丝桃的成方制剂的质量控制和检测来说具有十分重要的意义。
发明内容
本发明解决的技术问题之一是针对含有贯叶金丝桃的药物组合物，如何快速、有效且能准确的检测有效成分，从而更好的控制药物组合物质量，为了解决上述技术问题，本发明提供了下述技术方案：
本发明一方面提供一种药物组合物检测方法，该方法包括以下步骤：取适量药物组合物制备成供试品溶液，利用液相色谱法对其进行检测，其中所述液相色谱的色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，检测波长为360nm，采用梯度洗脱；其中所述药物组合物为含有贯叶金丝桃提取物的药物组合物。
本发明提供的药物组合物的检测方法，其所述的梯度洗脱条件优选为：
Figure BDA0003718073000000021
本发明提供的药物组合物的检测方法，其中所述液相色谱检测条件中，柱温优选为30-35℃，更优选为30℃；流速优选为0.8-1.2ml/min，更优选为1.0ml/min。
本发明提供的药物组合物的检测方法，其中所述供试品溶液的制备方法优选为，取适量药物组合物，用含醇溶液溶解，提取，过滤，即得；其中所述含醇溶液为含有60％或以上的甲醇或乙醇的溶液；更优选为60％乙醇溶液；所述提取方法优选为超声提取。
上述供试品溶液的制备方法优选含有如下步骤：取药物组合物适量，研细，称取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用60％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
上述含贯叶金丝桃的药物组合物中活性成分优选为贯叶金丝桃和刺五加制备而成；更优选为舒肝解郁胶囊。
本发明所使用的色谱柱为常规的以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，如
Figure BDA0003718073000000022
C18(2)5um 250x4.6mm、SHI MaDzu VP-ODS(250×4.6mm,5μm)、AgilentC18(250×4.6mm,5μm)、Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)、Phenomenex Luna C18(150×4.6mm,5μm)等；以规格为250×4.6mm,5μm效果更优。
本发明通过考察二极管阵列检测器(DAD检测器检测)检测含有贯叶金丝桃提取物的药物组合物(如舒肝解郁胶囊内容物)时，获知吸收波长在254nm、300nm和360nm附近均出现吸收峰值，其中检测波长为254nm时，梯度基线漂移大；检测波长为300nm时，各目标物质峰的吸收度较小；检测波长为360nm时，背景以及其它杂峰干扰小，且出峰结果稳定，检测效果最佳。
本发明申请人考察了柱温对含有贯叶金丝桃提取物的药物组合物(如舒肝解郁胶囊内容物)检测效果的影响，包括25℃、30℃、35℃等不同温度，结果显示30℃、35℃均能达到较好的分离效果，30℃的分离效果最佳。
本发明申请人考察流速对含有贯叶金丝桃提取物的药物组合物(如舒肝解郁胶囊内容物)检测效果的影响，包括0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min等不同流速，结果显示，各目标物质峰均能达到较好的分离效果，其中流速为1.0ml/min的分离效果最优。
本发明药物组合物在制备成供试品溶液时，其提取方式可以采用常规提取方法如：超声、回流、振摇等提取方式，其中超声提取效果更优。针对提取液考察发现含醇溶液如甲醇、60％甲醇、乙醇、60％乙醇溶液用以提取含有贯叶金丝桃提取物的药物组合物(如舒肝解郁胶囊内容物)，都能达到提取效果，其中60％乙醇溶液提取的效果更好。
本发明申请人还进一步考察了当药物组合物为0.2g时，提取溶剂量对提取含有贯叶金丝桃提取物的药物组合物(如舒肝解郁胶囊内容物)的影响，当利用10ml、25ml、50ml、75ml、100ml的60％乙醇溶液时，结果显示，上述提取溶剂量均能实现提取目的，其中提取溶剂用量为25-100ml时[即所述药物组合物与含醇溶液的质量体积比(g/ml)为0.2:25-100]提取效果更优；当提取溶剂用量为25ml[即所述药物组合物与含醇溶液的质量体积比(g/ml)为0.2:25]提取效果最好。
本发明更进一步提供一种药物组合物的检测方法，其包含以下步骤：
1)、供试品溶液的制备：取舒肝解郁胶囊内容物，研细，称取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用60％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)、对照品溶液的制备：取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦丁80μg、金丝桃苷60μg、异槲皮苷60μg、槲皮素80μg的混合溶液，即得；
3)、含量检测：取对照品和供试品溶液各10μl注入液相色谱柱，进行检测，其中色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，检测波长为360nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，梯度洗脱条件如下：
Figure BDA0003718073000000031
Figure BDA0003718073000000041
本发明所提供的药物组合物检测方法，与现有技术相比具有以下显著优势：
1、检测时间合理，目标物质出峰时间短，大大提高了样品的检测效率；
2、分离度好，基线波动不大，背景干扰小，能够准确检测供试样品中的成分；
3、通过对该药物组合物测定方法重复性、回收率、线性等发明考察，结果显示该检测方法稳定性高，重复性好，线性好，回收率高。
附图说明
图1对比例1中供试品的高效液相色谱图，其中1为芦丁，2为金丝桃苷，3为异槲皮苷，4为槲皮素，5为萹蓄苷，6为槲皮苷；
图2对比例2供试品的高效液相色谱图；
图3对比例3供试品的高效液相色谱图；
图4对比例4供试品的高效液相色谱图；
图5对比例5贯叶金丝桃提取物的高效液相色谱图；
图6对比例6贯叶金丝桃提取物的高效液相色谱图；
图7实施例1供试品的高效液相色谱图；
图8实施例2供试品的高效液相色谱图；
图9实施例3供试品的高效液相色谱图；
图10实施例4供试品的高效液相色谱图；
图11实施例5供试品的高效液相色谱图；
图12实施例6供试品的高效液相色谱图；
图13实施例7供试品的高效液相色谱图；
图14实施例8供试品的高效液相色谱图；
图15实施例9多批样品的的高效液相色谱图；
具体实施方式
本发明通过以下实施例对本发明的内容作进一步的详细说明，该说明并不能用于限制本发明的保护范围。
本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，高效液相色谱仪，(Agilent1100、Agilent 1200，美国安捷伦公司)；
Agilent Chemstation化学工作站；
十万分之一电子天平(BP-211D，德国赛多利斯sartorius)；
超声波清洗器(KQ250DE，昆山市仪器有限公司)；
超纯水机(UPHW-Ⅱ-90T，四川优普超纯水科技有限公司)；
乙腈色谱级，美国Fisher公司；
磷酸为分析纯，成都科龙化学试剂有限公司；
超纯水；
对照品：芦丁，供含量测定用，91.9％，批号100080-201409；金丝桃苷，供含量测定用，92.5％，批号111521-201406；异槲皮苷，供含量测定用，92.9％，批号111809-201403；槲皮素，供含量测定用，99.1％，批号100081-201408)；槲皮苷，供含量测定用，98％，批号111538-201105)。上述对照品均购自于中国食品药品检定研究院。萹蓄苷，供含量测定用，98％，购于上海科顺生物科技有限公司。
样品：舒肝解郁胶囊(成都康弘药业集团股份有限公司委托四川济生堂药业有限公司生产)，生产批号(150405、150416、150509、150518、150614、150619、150712、150727、150817、150824)。
分离度(R)检测方法：
分离度(R)为相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R<1时，两峰有部分重叠；当R＝1.0时，分离度可达98％；当R＝1.5时，分离度可达99.7％。通常用R＝1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4％，内侧峰基重叠约2％。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7％。R≥1.5称为完全分离。根据《中国药典》规定，R应大于1.5。
分离度(R)计算公式如下：
R＝2(tR2-tR1)/(W1+W2)
tR2:相邻两峰中后一峰的保留时间；
tR1:相邻两峰中前一峰的保留时间；
W1、W2:此相邻两峰的峰宽
对比例1
1)供试品溶液制备：取舒肝解郁胶囊内容物，研细，称取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用60％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)对照品溶液制备：取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷和槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦丁80μg、金丝桃苷60μg、异槲皮苷60μg、槲皮素80μg、萹蓄苷10μg和槲皮苷5μg的混合溶液，即得；
3)含量检测：
供试品溶液10μl注入液相色谱柱，进行检测。其中色谱条件：色谱柱为PhenomenexLuna C18(250×4.6mm,5μm)；以乙腈-0.1％磷酸溶液(16：84)为流动相；检测波长为360nm；理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于3000；
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图1所示。根据图1结果可知，无法检测出槲皮素。
对比例2
色谱条件：色谱柱为YWG-C18(250×4.6mm,5μm,天津特纳科学仪器有限公司)，流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液(70:30，v/v),流速：1.0ml/min,检测波长370nm,柱温：室温。
供试品溶液和对照品溶液制备如对比例1。
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图2所示。根据图2结果可知，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素4个色谱峰全部重叠在一起，无法有效分离芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素等成分。
对比例3
色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(250×4.6mm,5μm,)；流动相乙腈-0.1％磷酸溶液(15：85)，流速1.2ml/min，检测波长256nm,柱温35℃，进样量20μl.在该色谱条件下，理论板数按金丝桃苷峰计算不低于3000，分离度大于1.5；
供试品溶液和对照品溶液制备如对比例1。
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图3所示。根据图3结果可知，无法检测出槲皮素。
对比例4
色谱条件：色谱柱为：shim-pack，CLC-ODS(150*6.0mm，5μm，日本岛津)，检测波长254nm,流动相为：流动相A：水(用磷酸调解pH 3.1-3.5)，流动相B：乙腈，并按照如下洗脱程序进行梯度洗脱：
时间(分钟) 流动相A％ 流动相B％
0-28 82 18
28-35 70 30
35-40 60 40
40-50 60 40
供试品溶液和对照品溶液制备如对比例1。
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图4所示。根据图4结果可知，异槲皮苷的分离度小于1.5，且槲皮素的检测基线有漂浮。
对比例5
贯叶金丝桃提取物的制备：贯叶金丝桃提取物的制备(常规工艺)：1800克贯叶金丝桃加70％乙醇加入多功能提取罐回流提取2次，第一次加入10倍的量(体积重量比)，第二次加入8倍的量(体积重量比)，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液浓缩至三效节能浓缩器相对密度为1.10(70℃)，在高速离心喷干机喷雾干燥得到贯叶金丝桃提取物。
供试品溶液和对照品溶液制备如对比例1。
色谱条件：色谱柱为：shim-pack，CLC-ODS(150*6.0mm，5μm，日本岛津)，检测波长254nm流动相为：流动相A：水(用磷酸调解pH 3.1-3.5)，流动相B：乙腈，并按照如下洗脱程序进行梯度洗脱：
时间(分钟) 流动相A％ 流动相B％
0-28 82 18
28-35 70 30
35-40 60 40
40-50 60 40
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图5所示。根据图5结果可知，异槲皮苷分离度为1.47，无法与金丝桃苷峰完全分离，且槲皮素的检测基线有漂浮。
对比例6
贯叶金丝桃提取物的制备：同对比例5
供试品溶液和对照品溶液制备：同对比例1。
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)，流动相为：流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸，检测波长为360nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min；
按照下列程序进行梯度洗脱：
Figure BDA0003718073000000081
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图6所示。根据图6结果可知，芦丁保留时间为21.956min，分离度为29.25，金丝桃苷保留时间为24.395min，分离度为2.89，异槲皮苷保留时间为26.255min，分离度为2.07，槲皮素保留时间为36.457，分离度为21.54。其他成分萹蓄苷保留时间为32.432，分离度为11.06，槲皮苷保留时间为32.722，分离度为1.53。以上结果显示，该检测方法快速，能够准确定量分析。
实施例1
1)供试品溶液制备：取舒肝解郁胶囊内容物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用60％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)对照品溶液制备：取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷和槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦丁80μg、金丝桃苷60μg、异槲皮苷60μg、槲皮素80μg、萹蓄苷10μg和槲皮苷5μg的混合溶液，即得；
3)含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测。其中，色谱条件：流动相为；流动相A：乙腈，流动相B为0.05％磷酸,色谱柱为Phenomenex LunaC18(250×4.6mm,5μm)，按照如下洗脱程序进行梯度洗脱：
Figure BDA0003718073000000082
柱温：30℃，流速：1.0ml/min；检测波长为360nm；
按照所述方法进行高效液相色谱检测。结果如图7所示,根据图7结果可知，萹蓄苷、槲皮苷的基线较高，且无法有效分离。
实施例2
色谱条件：流动相为：流动相A：乙腈，流动相B为0.2％磷酸,色谱柱为PhenomenexLuna C18(250×4.6mm，5μm)，按照如下洗脱程序进行梯度洗脱：
Figure BDA0003718073000000091
柱温：30℃，流速：1.0ml/min；检测波长为360nm；
供试品溶液和对照品溶液制备如实施例1。
取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，结果如图8所示。根据图8结果可知，萹蓄苷、槲皮苷的基线较高，且无法有效分离。
实施例3
色谱条件：流动相为：乙腈：0.1％磷酸(25:75)，色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)，柱温：30℃，流速：1.0ml/min；检测波长为360nm；
供试品溶液和对照品溶液制备如实施例1。
取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，结果如图9所示。根据图9结果可知，芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷的分离度较差，与旁边的其他峰也无法有效分离，且也无法有效分离萹蓄苷和槲皮苷。
实施例4
色谱条件：流动相为：乙腈：0.1％磷酸(20:80)，色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)，柱温：30℃，流速：1.0ml/min；检测波长为360nm；
供试品溶液和对照品溶液制备如实施例1。
取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，结果如图10所示。根据图10结果可知，金丝桃苷和异槲皮苷的分离度差，未能有效分离，与旁边的其他峰也无法有效分离。且槲皮素出峰时间接近50min左右，加上色谱柱冲洗时间，整个检测时间需要耗费更长。
实施例5
色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)，流动相为：流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸，并按照下列程序进行梯度洗脱：
Figure BDA0003718073000000101
柱温：30℃，流速：1.0ml/min；检测波长为360nm；
供试品溶液和对照品溶液制备如实施例1。
取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，结果如图11所示。根据图11结果可知，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷等成分的分离度差，与旁边的其他峰也无法有效分离。
实施例6
色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)，流动相为：流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸，并按照下列程序进行梯度洗脱：
Figure BDA0003718073000000102
柱温：30℃，流速：1.0ml/min；检测波长为360nm；
供试品溶液和对照品溶液制备如实施例1。
取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，结果如图12所示。根据图12结果可知，槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷峰的基线较高，且分离度较差，与旁边的其他峰也无法有效分离。
实施例7
色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)，流动相为：流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸，并按照下列程序进行梯度洗脱：
Figure BDA0003718073000000103
柱温：30℃，流速：1.0ml/min；检测波长为360nm；
供试品溶液和对照品溶液制备如实施例1。
取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，结果如图13所示。根据图13结果可知，芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷等成分的分离度差，未能效分开，且芦丁与旁边的其他峰也无法有效分离。
实施例8
1)供试品溶液制备：取舒肝解郁胶囊内容物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用60％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)对照品溶液制备：取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦丁80μg、金丝桃苷60μg、异槲皮苷60μg、槲皮素80μg、萹蓄苷10μg和槲皮苷5μg的混合溶液，即得；
3)含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)，流动相为：流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸，检测波长为360nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min；
按照下列程序进行梯度洗脱：
Figure BDA0003718073000000111
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图14所示。根据图14结果可知，芦丁保留时间为21.218min，分离度为12.36，金丝桃苷保留时间为23.374min，分离度为2.97，异槲皮苷保留时间为25.208min，分离度为2.37，槲皮素保留时间为36.436，分离度为23.46。其他成分萹蓄苷、槲皮苷等分离度均大于1.5。以上结果显示，该检测方法快速，能够准确定量分析。
实施例9
对本发明所提供的药物组合物检测方法进行了以下方法学实验验证。以下方法学验证中相对标准偏差(RSD)表示分析测试结果的精密度，其计算公式为：RSD％＝标准偏差(SD)/计算结果的算术平均值(X)该值通常用来表示分析测试结果的精密度，其中标准偏差(SD):
Figure BDA0003718073000000112
1)供试品溶液制备：取舒肝解郁胶囊内容物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用60％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)对照品溶液制备：取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦丁80μg、金丝桃苷60μg、异槲皮苷60μg、槲皮素80μg的混合溶液，即得；
3)含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)，流动相为：流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸，检测波长为360nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min；
按照下列程序进行梯度洗脱：
Figure BDA0003718073000000121
线性关系：
取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素混合对照品溶液(其中芦丁浓度为0.3235mg/ml、金丝桃苷浓度为0.2322mg/ml、异槲皮苷浓度为0.3214mg/ml、槲皮素浓度为0.3439mg/ml)，用移液管精密量取0.5ml、1ml、2.5ml、5ml、10ml到10ml容量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀。按上述色谱条件，分别吸取5μl注入液相色谱仪，测定峰面积。
以芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的进样量(μg)为横坐标，以芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，分别得芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的标准曲线。结果表明，各成分在相应浓度范围呈良好线性关系，线性范围、回归方程、相关系数参见表1
Figure BDA0003718073000000122
重复性：
取同一批舒肝解郁胶囊样品(批号：150727)，精密称定，按上述供试品溶液制备项下方法平行制备供试品溶液6份，按上述色谱条件，进样测定，记录色谱图，计算芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素含量的RSD分别为1.657、1.544、1.586、1.847，均小于2.0％，表明该方法重复性良好。
稳定性：
分别取(150727、150405、150416、150509、150518、150614、150619、150727、150817、150824)等10个批次舒肝解郁胶囊(成都康弘药业集团股份有限公司委托四川济生堂药业有限公司委托生产提供)内容物0.2g,按照上述方法进行高效液相色谱检测。结果如图15所示，根据图15结果可知，该检测方法，稳定性好，重现性高。
回收率:
取已知含量的舒肝解郁胶囊样品(批号为150727,每粒装0.36g)，共6份，每份约0.1g,精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素对照品适量，按上述供试品溶液制备方法，制备加样回收供试品溶液，按上述色谱条件，进样测定，记录色谱图，计算芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的加样回收率，结果见表2。
表2回收率测定(n＝6)
Figure BDA0003718073000000131
以上表可以看出，芦丁的平均回收率为98.33％，RSD％为1.88％，金丝桃苷的平均回收率为100.15％，RSD％为1.45％，异槲皮苷的平均回收率为98.91％，RSD％为1.56％，槲皮素的平均回收率为97.32％，RSD％为2.01％，样品各个成分的加样回收率在95％-105％之间，RSD％均小于3.0％，试验结果表明加样回收率良好。

Claims (10)

1.一种药物组合物的检测方法，其特征在于取适量药物组合物制备成供试品溶液，利用液相色谱法对其进行检测；所述液相色谱色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，采用梯度洗脱；所述药物组合物为含有贯叶金丝桃提取物的药物组合物；所述梯度洗脱条件为：
Figure FDA0003718072990000011
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述液相色谱检测条件中柱温为30-35℃；优选为30℃。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述液相色谱检测条件中检测波长为360nm。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征所述液相色谱检测条件中流速为0.8-1.2ml/min；优选为1.0ml/min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述色谱柱规格为250×4.6mm,5μm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述供试品溶液的制备方法包含以下步骤：取适量药物组合物，用含醇溶液溶解，提取，过滤；其中所述含醇溶液优选为含有60％或以上的甲醇或乙醇的溶液，更优选为60％乙醇溶液；所述提取方法优选为超声提取。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述药物组合物与含醇溶液的质量体积比为0.2:25-100；优选为0.2:25。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述含有贯叶金丝桃提取物的药物组合物中活性成分为贯叶金丝桃和刺五加制备而成；优选为舒肝解郁胶囊。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于供试品溶液的制备方法如下：取舒肝解郁胶囊内容物，研细，称取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用60％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
10.根据权利要求1-9所述的检测方法，其特征在于包含以下步骤：
1)、供试品溶液的制备：取舒肝解郁胶囊内容物，研细，称取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用60％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)、对照品溶液的制备：取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦丁80μg、金丝桃苷60μg、异槲皮苷60μg、槲皮素80μg的混合溶液，即得；
3)、含量检测：取对照品和供试品溶液各10μl注入液相色谱柱，进行检测，其中色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，检测波长为360nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，梯度洗脱条件如下：
Figure FDA0003718072990000021
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