CN107976488B - 一种药物组合物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种药物组合物的检测方法，所述的药物组合物为含有贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物或二者的混合提取物的药物组合物，利用液相色谱法其进行检测。所述液相色谱检测条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为弱酸溶液，检测波长为260nm,流速为1.0ml/min，柱温为35℃,采用梯度洗脱。该方法具有快速、高效、稳定、准确等优点，能够快速、有效地对药物组合物进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种药物组合物的检测方法。
背景技术
贯叶金丝桃已经有2400年的使用历史，近年来对贯叶金丝桃的研究热点放在抗抑郁功效方面含有多种具生物活性的化学成分，其中主要是苯并二蒽酮类化合物、有机酸类化合物、金丝桃素和伪金丝桃素；多种芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、穗花杉双黄酮、间苯三酚类化合物等；其中以芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、穗花杉双黄酮为主要化合物。现代药理证明，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、绿原酸、萹蓄苷等均对在小鼠FST中均表现出明显的抗抑郁活性，是贯叶金丝桃抗抑郁症的主要活性成分。最新研究证实，穗花杉双黄酮（AF）在小鼠动物模型中表现出显著的抗抑郁和抗焦虑作用其作用强度均高于传统药物丙咪嗪和地西泮，且药物安全谱宽，没有不良影响（ISHOLA IO，CHATTERJEE M，TOTA S，et a1．Antidepressant and anxiolytic effectsofamentoflavone isolated from Cnestis fer-ruginea in mice．Pharmacol BiochemBehav，2012，103(2)：322—33）。
刺五加为五加科植物刺五加的干燥根和根茎或茎，具有益气健脾、补肾安神、益精壮骨之功效。现代研究表明，刺五加中含有丰富的具有广泛药理活性的皂苷类、黄酮类及有机酸类化合物，如刺五加苷A、B、C、D、E、绿原酸等（刺五加的研究进展，国土与自然资源研究，李丽辉等，2008）。2010年版《中国药典》虽以紫丁香苷(刺五加苷B)质量分数作为刺五加主要质量控制指标，但文献研究表明刺五加尚含有小分子有机酸如绿原酸、原儿茶酸等主要活性成分，紫丁香苷和绿原酸均是刺五加发挥药效作用的主要成分（HPLC法测定刺五加、五加皮与红毛五加皮中3种成分的含量，广东药学院学报，2015年10月第31卷第5期）。由此可见，可见紫丁香苷、绿原酸均是刺五加十分重要的指标性成分。
舒肝解郁胶囊是由贯叶金丝桃和刺五加为原料，采用现代制药工艺制备而成的中成药，具有疏肝解郁、健脾安神的功效，临床常用于轻、中度抑郁症属肝郁脾虚证者，症见情绪低落、兴趣下迟滞、入睡困难、早醒、多梦、紧张不安、急躁易怒、食少纳呆、胸闷、疲乏无力、多汗、疼痛、舌苔白或腻，脉弦或细。由于舒肝解郁胶囊同时包含了贯叶金丝桃和刺五加两种药材的多种化学成分，包括：金丝桃苷、芦丁、槲皮素、槲皮苷、萹蓄苷、异槲皮苷、穗花杉双黄酮以及紫丁香苷、绿原酸等，这些化学成分分别涉及黄酮类、有机酸类、糖类化合物等不同化学结构，理化性质各有不同，在定性和定量检测中常常互相干扰，要利用HPLC方法准确将目标物质同其他杂质有效分离并且定量分析存在较大难度，成方制剂的质量控制更为困难。
《中国药典（2015版）》和韩林等所介绍的高效液相色谱检测方法（金丝桃苷含量的RP-HPLC法测定，时珍国医国药2012年第23卷第10期）均无法检测出槲皮素；例如钱秋霞等所报道的方法，（HPLC法测定不同干燥方法的贯叶连翘中黄酮类化合物的含量，中草药,2001，32,5）其分离度达不到分离要求（分离度一般要求大于1.5），其主要物质峰中还包含大量杂质；李萍等人（HPLC测定贯叶金丝桃中黄酮的含量，李萍等，药学学报，2002）采用乙腈-磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长254nm，用于检测贯叶金丝桃中4中黄酮类成分（芦丁、金丝桃苷、萹蓄苷、槲皮素）的检测，申请人将该方法用于金丝桃苷、芦丁、槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷及紫丁香苷同时测定时发现在上述色谱条件下，紫丁香苷和异槲皮苷的分离度分别为0.8和1.47，均不符合要求，且槲皮素附近基线起伏较大，无法进行准确定量；魏淑梅等人（HPLC法测定刺五加总苷总黄酮软胶囊中刺五加苷E含量，魏淑梅等，黑龙江医药，2011）建立了以乙腈-0.1%冰乙酸（14:86）为流动相，流速1.0ml/min，检测波长210nm的HPLC方法，用于刺五加总苷总黄酮软胶囊中刺五加苷E的含量测定，但该方法用于上述6种化学成分的同时测定时，紫丁香苷分离度仅1.2，且附近基线波动较大，黄酮类成分响应太低，且75min内未见槲皮素出峰。可见，现有技术公开的单一种类化学成分的检测方法无法满足舒肝解郁胶囊中多种类化学成分的同时定性和定量。为了能更全面、更有效的进行舒肝解郁胶囊的质量控制，有必要建立一个快速、简便、准确可靠的分析方法，以用于舒肝解郁胶囊中多种指标成分的同时定性和定量分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、简便、准确可靠的分析方法，用于含有贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物或二者的混合物中多种指标成分的同时定性和定量分析。
本发明提供一种药物组合物的质量检测方法，该方法包括以下步骤：取适量药物组合物制备成供试品溶液，利用液相色谱法对其进行检测，其中所述液相色谱的色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为弱酸溶液，采用梯度洗脱；其中所述药物组合物为含有贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物或二者的混合物。
本发明提供的药物组合物的检测方法，其所述的梯度洗脱条件优选为：
本发明提供的药物组合物的检测方法，其中所述液相色谱检测条件中弱酸溶液为乙酸、甲酸、磷酸、三氟乙酸，优选乙酸。
本发明提供的药物组合物的检测方法，其中所述液相色谱检测条件中弱酸溶液浓度为0.1%-0.4%，优选0.2%。
本发明提供的药物组合物的检测方法，其中所述液相色谱检测条件中，柱温为25-35℃，优选35℃；流速为0.8-1.2ml/min，优选1.0ml/min，进样体积为10μl。
本发明提供的药物组合物的检测方法，其中所述供试品溶液的制备方法优选为，取适量药物组合物，用含醇溶液溶解，提取，过滤，即得；其中所述含醇溶液为含有80%或以上的甲醇或乙醇的溶液；更优选为80%甲醇溶液；所述提取方法优选为超声提取。
上述供试品溶液的制备方法优选含有如下步骤：取含有贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物或二者的混合物，混匀，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
上述含贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物或二者的混合物中活性成分优选为贯叶金丝桃和刺五加制备而成；更优选为舒肝解郁胶囊。
本发明所使用的色谱柱为常规的以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，如
C18(2)5μm，250×4.6mm、SHI MaDzu VP-ODS(250×4.6mm,5μm)、AgilentC18(250×4.6mm,5μm)、Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)、Phenomenex Luna C18(150×4.6mm,5μm)等；以规格为250×4.6mm,5μm效果更优。
本发明通过考察二极管阵列检测器（DAD检测器检测）检测含有贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物或二者的混合物（如舒肝解郁胶囊内容物）时，获知吸收波长在205nm、220nm、260nm、300nm和360nm附近均出现吸收峰值，其中检测波长为205、220nm时，梯度基线漂移大；检测波长为300nm和360nm时，紫丁香苷及穗花杉双黄酮目标物质峰的吸收度小甚至消失；最终确定检测波长为260nm时，背景以及其它杂峰干扰小，且各目标成分吸收度较好，出峰结果稳定，检测效果最佳。
本发明申请人考察了柱温对含有贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物或二者的混合物（如舒肝解郁胶囊内容物）检测效果的影响，包括25℃、30℃、35℃等不同温度，结果显示30℃、35℃均能达到较好的分离效果，35℃的分离效果最佳。
本发明申请人考察流速对含有贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物或二者的混合物（如舒肝解郁胶囊内容物）检测效果的影响，包括0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min等不同流速，结果显示，各目标物质峰均能达到较好的分离效果，其中流速为1.0ml/min的分离效果最优。
本发明药物组合物在制备成供试品溶液时，其提取方式可以采用常规提取方法如：超声、回流、振摇等提取方式，其中超声提取效果更优。针对提取液考察发现含醇溶液如甲醇、80%甲醇、乙醇、80%乙醇溶液用以提取含有贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物或二者的混合物（如舒肝解郁胶囊内容物），都能达到提取效果，其中80%甲醇溶液提取的效果更好。
本发明更进一步提供一种药物组合物的检测方法，其包含以下步骤：
1）供试品溶液的制备：取舒肝解郁胶囊内容物，研细，称取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2）对照品溶液的制备：取紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、萹蓄苷、槲皮素、穗花杉双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含紫丁香苷10μg、绿原酸10μg、槲皮苷10μg、穗花杉双黄酮10μg、萹蓄苷10μg、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素各60μg的混合溶液，即得；
3）含量检测：取对照品和供试品溶液各10μl注入液相色谱柱，进行检测，其中色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.2%乙酸溶液，检测波长为260nm，柱温为35℃，流速为1.0ml/min，梯度洗脱条件如下：
本发明所提供的药物组合物检测方法，与现有技术相比具有以下显著优势：
1、能针对含有贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物或二者的混合物中在同一色谱条件下的黄酮类、有机酸类、糖类化合物9个成分进行进行准确的定性和定量，能较全面真实地反映药物组合物的内在质量特征，节约了时间成本和试剂成本；
2、检测时间合理，目标物质出峰时间短，大大提高了样品的检测效率；
3、各目标成分分离度好，基线波动小，背景干扰小，能够准确检测供试样品中的成分；
4、通过对该药物组合物测定方法重复性、回收率、线性等发明考察，结果显示该检测方法稳定性高，重复性好，线性好，回收率高。
附图说明
图1对比例1供试品的高效液相色谱图
图2对比例2供试品的高效液相色谱图；
图3对比例3供试品的高效液相色谱图；
图4对比例4供试品的高效液相色谱图；
图5对比例5贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物及其混合物的高效液相色谱图；
图6-10实验一供试品的高效液相色谱图；
图11-15实验二供试品的高效液相色谱图；
图16实施例1贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物及其混合物的高效液相色谱图；
图17实施例2供试品的高效液相色谱图；
图18实施例3供试品的高效液相色谱图；
图19实施例4供试品的高效液相色谱图；
图20实施例5供试品的高效液相色谱图；
图21实施例6供试品的高效液相色谱图；
图中1为紫丁香苷，2为绿原酸，3为芦丁，4为金丝桃苷，5为异槲皮苷，6为萹蓄苷，7为槲皮苷，8为槲皮素，9为穗花杉双黄酮。
具体实施方式
本发明通过以下实施例对本发明的内容作进一步的详细说明，该说明并不能用于限制本发明的保护范围。
本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，高效液相色谱仪，
（Agilent1100、Agilent 1200，美国安捷伦公司）；
Agilent Chemstation化学工作站；
十万分之一电子天平(BP-211D，德国赛多利斯sartorius)；
超声波清洗器(KQ250DE，昆山市仪器有限公司)；
超纯水机（UPHW-Ⅱ-90T，四川优普超纯水科技有限公司）；
乙腈色谱级，美国Fisher公司；
磷酸为分析纯，成都科龙化学试剂有限公司；
超纯水；
对照品：紫丁香苷，供含量测定用，94.9%，批号111574-201504；绿原酸，供含量测定用，置五氧化二磷减压干燥器中干燥1小时，批号110753-200413；芦丁，供含量测定用，91.9%，批号100080-201409；金丝桃苷，供含量测定用，92.5%，批号111521-201406；异槲皮苷，供含量测定用，92.9%，批号111809-201403；槲皮素，供含量测定用，99.1%，批号100081-201408）；槲皮苷，供含量测定用，98%，批号111538-201105）。上述对照品均购自于中国食品药品检定研究院。萹蓄苷，供含量测定用，98.2%，购于上海科顺生物科技有限公司；穗花杉双黄酮，供含量测定用，97.6%，购于上海源叶生物科技有限公司。
样品：舒肝解郁胶囊（成都康弘药业集团股份有限公司委托四川济生堂药业有限公司生产），生产批号（160701、160702、160703、160704、160705、160706、160707、160708、160709、1607010）。
分离度（R）检测方法：
分离度（R）为相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R<1时，两峰有部分重叠；当R=1.0时，分离度可达98%；当R=1.5时，分离度可达99.7%。通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。当R=1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R=1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。根据《中国药典》规定，R应大于1.5。
分离度（R）计算公式如下：
R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)
tR2:相邻两峰中后一峰的保留时间；
tR1:相邻两峰中前一峰的保留时间；
W1、W2:此相邻两峰的峰宽
对比例1
供试品溶液制备：取装量差异下的舒肝解郁胶囊内容物，混匀，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液制备：取紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷和槲皮苷、穗花杉双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含紫丁香苷10μg、槲皮苷10μg、绿原酸10μg、穗花杉双黄酮10μg、萹蓄苷10μg、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素各60μg的混合溶液，即得。
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测。其中，色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)；以乙腈-0.1％磷酸溶液（16：84）为流动相；检测波长为360nm；理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于3000。
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图1所示。根据图1结果可知，无法检测出槲皮素、穗花杉双黄酮，且紫丁香苷与绿原酸峰重叠，绿原酸分离度为小于1.5，达不到分离要求。
对比例2
供试品溶液和对照品溶液制备：同对比例1；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测。其中，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃，检测波长为220mn。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于10000。
| 时间（分钟） | 流动相A% | 流动相B% |
| 0-20 | 10—20 | 90—80 |
| 20-30 | 20-25 | 80-75 |
| 30-40 | 25-40 | 75-60 |
| 40-50 | 40-10 | 60-90 |
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图2所示。根据图2结果可知,金丝桃苷与异槲皮苷不能完全分离，异槲皮苷分离度小于1.5，达不到分离要求，且槲皮素的检测梯度基线漂移较大。
对比例3
供试品溶液和对照品溶液制备：同对比例1；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测。其中，色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(250×4.6mm,5μm,)；流动相乙腈-0.1%磷酸溶液（15：85），流速1.2ml/min，检测波长256nm,柱温35℃，进样量20μl.在该色谱条件下，理论板数按金丝桃苷峰计算不低于3000，分离度大于1.5。
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图3所示。根据图3结果可知，无法检测出槲皮素和穗花杉双黄酮，且紫丁香苷与绿原酸峰重叠，绿原酸分离度为小于1.5，达不到分离要求。
对比例4
供试品溶液和对照品溶液制备如对比例1；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测。其中，色谱条件：色谱柱为：shim-pack，CLC-ODS（150*6.0mm，5μm，日本岛津），检测波长254nm流动相为：流动相A：水（用磷酸调解pH 3.1-3.5），流动相B：乙腈，并按照如下洗脱程序进行梯度洗脱：
| 时间（分钟） | 流动相A% | 流动相B% |
| 0-28 | 82 | 18 |
| 28-35 | 70 | 30 |
| 35-40 | 60 | 40 |
| 40-50 | 60 | 40 |
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图4所示。根据图4结果可知，紫丁香苷与绿原酸不能完全分离，绿原酸分离度为小于1.5，达不到分离要求，且金丝桃苷与异槲皮苷不能完全分离，异槲皮苷分离度小于1.5，达不到分离要求。
对比例5
贯叶金丝桃提取物：贯叶金丝桃,加70%乙醇回流提取二次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度约为1.10（70℃）的浸膏，喷雾干燥，即得；
刺五加提取物：刺五加，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18（70℃）的浸膏，喷雾干燥，即得；
混合物：取贯叶金丝桃提取物和刺五加提取物和适量辅料，按需要的比例混合均匀，即得；供试品溶液和对照品溶液制备如对比例1；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测。其中，色谱条件：色谱柱为：shim-pack，CLC-ODS（150*6.0mm，5μm，日本岛津），检测波长254nm流动相为：流动相A：水（用磷酸调解pH 3.1-3.5），流动相B：乙腈，并按照如下洗脱程序进行梯度洗脱：
| 时间（分钟） | 流动相A% | 流动相B% |
| 0-28 | 82 | 18 |
| 28-35 | 70 | 30 |
| 35-40 | 60 | 40 |
| 40-50 | 60 | 40 |
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图5所示。根据图5结果可知，紫丁香苷与绿原酸不能完全分离，绿原酸分离度为小于1.5，达不到分离要求，且金丝桃苷与异槲皮苷不能完全分离，异槲皮苷分离度小于1.5，达不到分离要求。
为了能更全面、更有效的进行舒肝解郁胶囊的质量控制，建立一个快速、简便、准确可靠的分析方法，以用于舒肝解郁胶囊中多种指标成分的同时定性和定量分析。本发明通过对检测条件进行了大量摸索实验研究，其摸索实验及考察结果如下：
实验一：不同洗脱条件对检测结果的影响：
供试品溶液制备：取舒肝解郁胶囊内容物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
对照品溶液制备：取紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含紫丁香苷10μg、槲皮苷10μg、绿原酸10μg、穗花杉双黄酮10μg、萹蓄苷10μg、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素各60μg的混合溶液，即得；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测。其中，色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)；以乙腈为流动相A，以0.2％乙酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm，柱温35℃，流速为1.0ml/min。取混合提取物样品溶液进样检测，对不同梯度洗脱条件进行考察，结果见表1：
表1梯度洗脱条件对检测结果的影响
实验二：酸的浓度对检测结果的影响
供试品溶液和对照品溶液制备：同实验一；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测。其中，色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)；以乙腈为流动相A，以不同浓度的乙酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm，柱温35℃，流速为1.0ml/min。
取混合提取物样品溶液进样检测，对酸的不同浓度进行考察，结果见表2：
表2乙酸浓度对检测结果的影响
结果显示，流动相B为水和0.002%乙酸时，绿原酸分离度小于1.5，达不到检测效果,当为0.1%乙酸至0.4%乙酸时，9个指标成分的分离度均大于1.5，均达到检测效果，当乙酸浓度为0.2%时，各指标成分的梯度检测基线最平稳，干扰最小，检测效果最佳。
实验三：验证实验
对本发明所提供的药物组合物检测方法进行了以下方法学实验验证。以下方法学验证中相对标准偏差（RSD）表示分析测试结果的精密度，其计算公式为：RSD%=标准偏差（SD）/计算结果的算术平均值（X）该值通常用来表示分析测试结果的精密度，其中标准偏差(SD):
供试品溶液和对照品溶液制备：同实验1。
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm);以乙腈为流动相A，以0.2％乙酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm，柱温35℃，流速为1.0ml/min。
线性关系：
取紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素及穗花杉双黄酮混合对照品溶液（其中紫丁香苷浓度0.22mg/ml、绿原酸浓度0.28mg/ml、芦丁浓度为0.75mg/ml、金丝桃苷浓度为0.64mg/ml、异槲皮苷浓度为0.58mg/ml、槲皮素浓度为0.68mg/ml、萹蓄苷浓度为0.25mg/ml、槲皮苷浓度为0.31mg/ml及穗花杉双黄酮浓度为0.33mg/ml，用移液管精密量取0.5ml、1ml、2.5ml、5ml、10ml到10ml容量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀。按上述色谱条件，分别吸取10μl注入液相色谱仪，测定峰面积。以紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷及穗花杉双黄酮的进样量（μg）为横坐标，以紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷及穗花杉双黄酮的峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，分别得紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷及穗花杉双黄酮的标准曲线。结果表明，各成分在相应浓度范围呈良好线性关系，线性范围、回归方程、相关系数参见表3。
表3药物组合物中各成分的线性关系
重复性：
取同一批舒肝解郁胶囊样品（批号：160701），精密称定，按上述供试品溶液制备项下方法平行制备供试品溶液6份，按上述色谱条件，进样测定，记录色谱图，计算紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷及穗花杉双黄酮含量的RSD分别为1.2%、1.3%、0.8%、1.1%、0.9%、0.9%、1.0%、1.6%、1.5%，均小于2.0%，表明该方法重复性良好。
稳定性：
取本品（批号:150727）按供试品制备方法制备供试品溶液；分别置不同时间0、2、4、8、12、24h，进样10μl，注入液相色谱仪，分别测定供试品溶液的紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷及穗花杉双黄酮的峰面积。计算RSD。计算紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷及穗花杉双黄酮含量的RSD分别为1.6%、1.4%、1.8%、1.9%、1.7%、1.3%、1.5%、1.4%、1.9%，均小于2.0%，表明该方法稳定性良好。
加样回收率:
取已知含量的舒肝解郁胶囊样品（批号为160701,每粒装0.36g），共6份，每份约0.1g,精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷及穗花杉双黄酮对照品适量，按上述供试品溶液制备方法，制备加样回收供试品溶液，按上述色谱条件，进样测定，记录色谱图，计算紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷及穗花杉双黄酮的加样回收率，结果见表4。
表4回收率测定（n=6）
以上表看出，样品各个成分的加样回收率在95.0%-105.0%之间，RSD%均小于3.0%，试验结果表明加样回收率良好。
实施例1：
贯叶金丝桃提取物：贯叶金丝桃,加70%乙醇回流提取二次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度约为1.10（70℃）的浸膏，喷雾干燥，即得；
刺五加提取物：刺五加，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18（70℃）的浸膏，喷雾干燥，即得；
混合物：取贯叶金丝桃提取物和刺五加提取物和适量辅料，按需要的比例混合均匀，即得；供试品溶液制备：取混合物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
对照品溶液制备：取紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含紫丁香苷10μg、槲皮苷10μg、绿原酸10μg、穗花杉双黄酮10μg、萹蓄苷10μg、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素各60μg的混合溶液，即得；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm);以乙腈为流动相A，以0.2％乙酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm，柱温35℃，流速为1.0ml/min。
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图16所示。其色谱峰的保留时间和分离度见下表5：
表5检测结果
以上结果显示，该组合物9个化学成分色谱峰的保留时间适中，分离度均大于1.5，且色谱图基线平稳。因此，该检测方法快速，能够准确定量分析。
实施例2
供试品溶液制备：取舒肝解郁胶囊内容物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
对照品溶液制备：取紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含紫丁香苷10μg、槲皮苷10μg、绿原酸10μg、穗花杉双黄酮10μg、萹蓄苷10μg、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素各60μg的混合溶液，即得；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件以0.2％磷酸为流动相B，其余检测条件同实施例1。
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图17所示。根据图17所示，该组合物9个化学成分色谱峰的保留时间适中，分离度均大于1.5，达到检测效果，但槲皮素、穗花杉双黄酮的检测梯度基线存在漂移。
实施例3
供试品溶液制备与对照品溶液制备：同实施例2；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：以0.2％甲酸为流动相B，其余检测条件同实施例1。
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图18所示。根据图18所示，该组合物9个化学成分色谱峰的保留时间适中，分离度均大于1.5，达到检测效果，但槲皮素、穗花杉双黄酮的检测梯度基线存在漂移。
实施例4
供试品溶液制备与对照品溶液制备同实施例2；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：以0.2％三氟乙酸为流动相B，其余检测条件同实施例1。
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图19所示。根据图19所示，该组合物9个化学成分色谱峰的保留时间适中，分离度均大于1.5，达到检测效果，但槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮的检测梯度基线存在漂移。
实施例5
供试品溶液制备与对照品溶液制备同实施例2；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：以0.1％乙酸为流动相B，其余检测条件同实施例1。
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图20所示。根据图20所示，9个指标成分的分离度均大于1.5，达到检测效果，但槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮的检测梯度基线存在漂移。
实施例6
供试品溶液制备与对照品溶液制备同实施例2；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：以0.4％乙酸为流动相B，其余检测条件同实施例1。
按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图21所示。根据图21所示，9个指标成分的分离度均大于1.5，达到检测效果，但槲皮素、穗花杉双黄酮的检测梯度基线存在漂移。
实施例7
取10批舒肝解郁胶囊样品160701、160702、160703、160704、160705、160706、160707、160708、160709、1607010），取市售贯叶金丝桃提取物和刺五加提取物各2批次，按照实施例1进行样品测定，测定含量结果如下表6：
表6多个批次样品成分含量测定结果
以上表看出，本发明检测方法可在45min内对含有贯叶金丝桃提取物、刺五加提取物或二者混合物的药物组合物中的紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷及穗花杉双黄酮等9种活性成分进行定性和定量，各目标成分色谱峰分离好，无明显干扰。
Claims (1)
1.一种药物组合物的检测方法，其特征在于包含以下步骤：
1)、供试品溶液的制备：取舒肝解郁胶囊内容物，研细，称取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，密塞，精密加入80％甲醇25ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)、对照品溶液的制备：取紫丁香苷、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、萹蓄苷、槲皮素、穗花杉双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含紫丁香苷10μg、绿原酸10μg、槲皮苷10μg、穗花杉双黄酮10μg、萹蓄苷10μg、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素各60μg的混合溶液，即得；
3)、含量检测：取对照品和供试品溶液各10μl注入液相色谱柱，进行检测，其中色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.2％乙酸溶液，检测波长为260nm，柱温为35℃，流速为1.0ml/min，梯度洗脱条件如下：
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