CN112946118B - 一种药物指纹图谱的测定方法及其指纹图谱 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种药物组合物指纹图谱的测定方法，通过高效液相色谱法测定该药物组合物的指纹图谱从而有效监控该药物质量。该方法包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：取药物适量，溶于流动相C中，摇匀，滤过，取续滤液；(2)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为甲醇，流动相C为磷酸水溶液；检测波长260～300nm；(3)测定吸取上述供试品溶液注入液相色谱仪，使用高效液相色谱法进行测定，得到药物指纹图谱；其中，所述药物选自丹参药材或丹香葡萄糖滴注液中的一种。该检测方法操作方便，效率高效，重复性和稳定性好，易于掌握。

Description

一种药物指纹图谱的测定方法及其指纹图谱
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种药物指纹图谱的测定方法及其指纹图谱。
背景技术
中药指纹图谱是借助于波谱或色谱技术获得的中药化学成分的光谱图或色谱图，是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。目前，美国FDA、英国和印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用植物学会均接受色谱指纹图谱的质控方法。由于中药复方指纹图谱整张图谱是由不同峰群组成，每一峰群都代表一组生物信息，且各种生物信息之间的相互协同及拮抗作用，正好体现了中药复方的配伍和组方理论。此外，这些峰群或峰群之间通过对机体主病及主证的治疗，体现了控制某张中药复方指纹图谱，就可确保其相应药效。目前中药指纹图谱的建立方法主要有：光谱法，如紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)；色谱法，如薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法；以及其他方法，如x射线衍射法、核磁共振法等。其中高效液相色谱法(HPLC)具有分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点，不受样品挥发度和热稳定性的限制，比气相色谱法等其他方法应用范围更广，是构建指纹图谱的主要方法之一。
冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，常常被称为“冠心病”。其主要表现为典型的胸痛或猝死症状，在美国和许多发达国家排在死亡原因的第一位。丹香葡萄糖滴注液主要功效为活血理气，用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风后遗证；冠心病，心绞痛，心肌梗塞及脑梗塞后遗证均属上述证候者，是一种疗效和安全性俱佳的纯中药制剂。
丹香葡萄糖滴注液由丹参、降香和葡萄糖组成，其中，丹参中含有丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡА、丹参酮Ⅱв、隐丹参酮、紫草酸B、丹参隐螺内酯、丹参酸乙、二氢异丹参酮Ⅰ、丹参醇、丹参内酯、替告皂苷元、β-谷固醇、豆固醇、柳杉酚等有效成分，降香中含有异黄酮衍生物的单聚体、双聚体、肉桂烯类衍生物等有效成分，由于丹香葡萄糖滴注液使用的药材丹参和降香均具有复杂的化学成分，导致该注射液成分较为复杂，因此，建立一种包括丹香葡萄糖滴注液的药物的指纹图谱测定方法，特别是通过高效液相色谱法测定指纹图谱信息，从药物物质群整体的角度给予其质量控制具有非常重要的意义。
目前对于丹香葡萄糖滴注液的指纹图谱的测定尚未见报道。由于丹香葡萄糖滴注液所用药材丹参和降香中的药物活性成分都比较多，因此这两种药物同时检测时得到的指纹图谱必须清晰表现出丹参和降香中各自的有效活性成分，避免不同成分的峰出现重叠，这就给其指纹图谱的建立带来了不小的困难。现有技术中，有大量报道丹参药材或含有丹参组分的相关复方制剂的指纹图谱的检测方法，然而，我们通过实验得知现有技术关于丹参或其相关制剂的HPLC指纹图谱检测条件不能用于丹香葡萄糖滴注液指纹图谱的测定，其存在不能有效分离丹参、降香各自的有效活性成分等缺点。例如申请号为CN201810543673.X的中国专利公开了一种丹参川芎嗪注射液的HPLC指纹图谱检测方法，以甲醇为流动相A，0.05％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；申请号为CN01119925.3的中国专利公开了一种丹参药材指纹图谱建立的方法及其标准指纹图谱，以流动相为8∶92∶1的甲醇-水-冰醋酸进行等度洗脱；申请号为CN201310040437.3的中国专利公开了一种丹参药材的指纹图谱鉴别方法，以乙腈-0.01-2％冰醋酸为流动相梯度洗脱，梯度程序为：0min→5min→30min→45min→60min→62min→75min：对应流动相：乙腈：2％→7％→15％→20％→35％→50％→50％；0.01-2％冰醋酸：98％→93％→85％→80％→65％→50％→50％；然而，申请人采用以上检测方法，均未能完全分离丹香葡萄糖滴注液中的有效成分。
发明内容
本发明提供的一种药物指纹图谱的测定方法，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种药物指纹图谱的测定方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)供试品溶液的制备：取药物适量，溶于流动相C中，摇匀，滤过，取续滤液；(2)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为甲醇，流动相C为磷酸水溶液；检测波长260～300nm；(3)测定吸取上述供试品溶液注入液相色谱仪，使用高效液相色谱法进行测定，得到药物指纹图谱；其中，所述药物选自丹参药材或丹香葡萄糖滴注液中的一种。所述步骤(2)中检测波长为280～300nm；流速为0.8-1.2mL/min，柱温为25-35℃，进料量为5-20μL。
优选的，所述步骤(2)中检测波长为295nm；流速为1mL/min，柱温为30℃，进料量为10μL。
优选的，所述流动相C为0.08％磷酸水溶液。
优选的，所述药物为丹参药材时，供试品溶液的制备方法为：取丹参药材粉末1.0-2.0g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加水50mL，称定重量，超声处理25min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加流动相C使混悬，转移至5mL量瓶中，加流动相C稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
本发明中，所述丹香葡萄糖滴注液时，供试品溶液的制备方法为：精密量取2-5mL丹香葡萄糖滴注液，置25mL量瓶中，加流动相C稀释至刻度，摇匀，即得。
本发明中，(a)步骤中所述色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为甲醇，流动相C为磷酸水溶液；
其中，梯度洗脱程序为：
0-2min时，流动相A为0，流动相B为5％的甲醇；流动相C为95％的0.08％磷酸水溶液；
10min时，流动相A为5％的乙腈，流动相B为5％的甲醇；流动相C为90％的0.08％磷酸水溶液；
20min时，流动相A为15％的乙腈，流动相B为0％的甲醇；流动相C为85％的0.08％磷酸水溶液；
60min时，流动相A为25％的乙腈，流动相B为0％的甲醇；流动相C为75％的0.08％磷酸水溶液；
61min时，流动相A为0，流动相B为5％的甲醇；流动相C为95％的0.08％磷酸水溶液；
70min时，流动相A为0，流动相B为5％的甲醇；流动相C为95％的0.08％磷酸水溶液。
其中，所述色谱柱为Shimadu shim-pack C18色谱柱，色谱柱规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm。
本发明中，所测得的丹参药材指纹图谱中共有10个指纹峰，保留时间分别为：1号峰为20.98，2号峰为24.02,3号峰为28.02,4号峰为32.43,5号峰为38,36，6号峰为39.61,7号峰为47.04,8号峰为52.73，9号峰为57.86,10号峰为59.30。
本发明中，所测得的丹香葡萄糖注射液指纹图谱中共有11个指纹峰为：1号峰为8.67,2号峰10.89,3号峰15.20,4号峰31.98，5号峰32.37,6号峰为34.04,7号峰为38.41,8号峰为43.96，9号峰52.70，10号峰为57.88,11号峰为59.35。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明建立的丹香葡萄糖滴注液HPLC指纹图谱的测定方法及其指纹图谱，对于其有效成分丹参和降香中的大部分药理活性物质进行了有效表征，实现了最大可能的对其化学成分进行检测；同时，本发明提供了一种通过整体的指纹图谱信息对丹香葡萄糖滴注液质量进行评价的方法，避免了只测定其中一、二个化学成分就对丹香葡萄糖滴注液整体质量判断的片面性，使得丹香葡萄糖滴注液质量控制更加客观和准确；
2、本发明所提供的指纹图谱的检测方法具有良好的精密度、重现性和稳定性；
3、本发明所提供的指纹图谱的检测方法能较好的分离丹香葡萄糖滴注液中丹参和降香中的大部分药理活性物质，分离度较好。
附图说明
图1为实施例1的HPLC色谱图；
图2为实施例2的HPLC色谱图；
图3为实施例3的HPLC色谱图；
图4为实施例4的HPLC色谱图；
图5为实施例5的HPLC色谱图；
图6为实施例6中采用回流提取法提取丹参药材的HPLC色谱图；
图7为实施例6中采用超声提取法提取丹参药材的HPLC色谱图；
图8为本发明中有效成分对照品HPLC色谱图；
其中：1为丹参素钠；2为原儿茶醛；3为迷迭香酸；4为咖啡酸；5为丹酚酸B；6为丹参酮IIA；7为隐丹参酮。
图9为本发明中丹参药材的HPLC指纹图谱；
图10为本发明中丹香葡萄糖滴注液的精密度图谱。
图11为本发明中10批丹香葡萄糖滴注液HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例来进一步说明本发明的具体使用方式。
实施例1：丹香葡萄糖滴注液指纹图谱的测定1
1、试剂：丹参素钠(中国食品药品检定研究院，纯度98.8％，批号110855-201413)；丹参酮IIA(中国食品药品检定研究院，纯度99％，批号110766-201520)；隐丹参酮(中国食品药品检定研究院，批号110885-200102)；咖啡酸(中国食品药品检定研究院，纯度99.5％，批号110766-201520)；丹酚酸B(中国食品药品检定研究院，纯度94.1％，批号111562-201416)；迷迭香酸(中国食品药品检定研究院，纯度90.5％，批号111871-201404)；原儿茶醛(中国食品药品检定研究院，纯度98.2％，批号110810-201007)。
水为纯净水；乙腈、甲醇为色谱纯；其它试剂均为分析纯。
1、仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪；电子分析天平(NETTLER TOLEDONewClassic MS,瑞士梅特勒-托利多集团)。
2、供试品溶液的制备：精密量取丹香葡萄糖滴注液(贵州金桥药业有限公司，批号150401)，滤过，取续滤液，即得。
3、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料(Shimadu shim-pack C18色谱柱(150mm*4.6mm，5μm))，流动相以0.08％磷酸为流动相A，乙腈为流动相C，进行梯度洗脱，梯度条件为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相C(％)
0-10 5 95
10-30 5→95 95→5
30-50 95 5
50-51 95→5 5→95
51-55 5 95
流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为295nm，进样体积：10ul。
4、结果：上述条件检测方法分离度、对称因子较差。检测结果见图1。
实施例2：丹香葡萄糖滴注液指纹图谱的测定2
与实施例1基本相同，其不同之处在于，采用的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料(Shimadu shim-pack C18色谱柱(150mm*4.6mm，5μm))，流动相以甲醇为流动相B，1.0％醋酸水溶液为流动相C，进行梯度洗脱，梯度条件为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相C(％)
0-10 5 95
10-30 5→95 95→5
30-50 95 5
50-51 95→5 5→95
51-55 5 95
流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为295nm，进样体积：10ul。
结果：上述条件检测方法分离度、对称因子较差。检测结果见图2。
实施例3：丹香葡萄糖滴注液指纹图谱的测定3
与实施例1基本相同，其不同之处在于，所述采用的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料(Shimadu shim-pack C18色谱柱(150mm*4.6mm，5μm))，流动相以流动相A为乙腈，流动相B为甲醇，流动相C为0.08％磷酸水溶液，梯度条件为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 流动相C(％)
0-2 0 5 95
2-10 0→5 5 95→90
10-55 5→10 5→40 95→50
55-65 10→15 40→80 50→5
65-66 15→0 80→5 5→95
66-70 0 5 95
流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为295nm，进样体积：10ul。
结果：上述条件检测方法分离度、对称因子较好且基线较平。检测结果见图3。故采用该梯度进行样品检测。
实施例4：丹香葡萄糖滴注液指纹图谱的测定4
1、试剂：丹参素钠(中国食品药品检定研究院，纯度98.8％，批号110855-201413)；丹参酮IIA(中国食品药品检定研究院，纯度99％，批号110766-201520)；隐丹参酮(中国食品药品检定研究院，批号110885-200102)；咖啡酸(中国食品药品检定研究院，纯度99.5％，批号110766-201520)；丹酚酸B(中国食品药品检定研究院，纯度94.1％，批号111562-201416)；迷迭香酸(中国食品药品检定研究院，纯度90.5％，批号111871-201404)；原儿茶醛(中国食品药品检定研究院，纯度98.2％，批号110810-201007)。
水为纯净水；乙腈、甲醇为色谱纯；其它试剂均为分析纯。
2、仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪；电子分析天平(NETTLER TOLEDONewClassic MS,瑞士梅特勒-托利多集团)。
3、供试品溶液的制备：精密量取丹香葡萄糖滴注液(贵州金桥药业有限公司，批号150401)，滤过，取续滤液，即得。
4、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料：Waters Xbridge C18色谱柱(250mm*4.6mm，5μm))。以流动相A为乙腈，流动相B为甲醇，流动相C为0.08％磷酸水溶液，梯度条件为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 流动相C(％)
0-2 0 5 95
2-10 0→5 5 95→90
10-55 5→10 5→40 95→50
55-65 10→15 40→80 50→5
65-66 15→0 80→5 5→95
66-70 0 5 95
流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为295nm，进样体积：10ul。
结果：采用上述色谱柱检测，色谱峰较少。检测结果见图4。
实施例5：丹香葡萄糖滴注液指纹图谱的测定5
与实施例4基本相同，其不同之处在于，所述采用的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料：Waters Xbridge C18色谱柱(150mm*4.6mm，5μm)，流动相以流动相A为乙腈，流动相B为甲醇，流动相C为磷酸水溶液，梯度条件为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 流动相C(％)
0-2 0 5 95
2-10 0→5 5 95→90
10-55 5→10 5→40 95→50
55-65 10→15 40→80 50→5
65-66 15→0 80→5 5→95
66-70 0 5 95
流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为295nm，进样体积：10ul。
结果：采用上述色谱柱检测，分离效果差，峰对称性较差。检测结果见图5。
由于不同色谱柱对化学成分分离有一定影响，将以上实施例4、实施例5与实施例3的色谱检测方法进行分析比较，考验长柱(250mm)及短柱(150mm)对各色谱峰的影响，可知采用以下色谱方法进行指纹图谱的测定时，检测结果最好，即色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料(Shimadu shim-pack C18色谱柱(150mm*4.6mm，5μm))，流动相以流动相A为乙腈，流动相B为甲醇，流动相C为0.08％磷酸水溶液，梯度条件为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 流动相C(％)
0-2 0 5 95
2-10 0→5 5 95→90
10-55 5→10 5→40 95→50
55-65 10→15 40→80 50→5
65-66 15→0 80→5 5→95
66-70 0 5 95
流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为295nm，进样体积：10ul。
结果：丹香葡萄糖滴注液的指纹图谱个色谱峰的保留时间为：1号峰为8.67,2号峰10.89,3号峰15.20,4号峰31.98，5号峰32.37,6号峰为34.04,7号峰为38.41,8号峰为43.96，9号峰52.70，10号峰为57.88,11号峰为59.35。如图3所示。
实施例6：丹参药材不同提取方法的考察
(1)回流提取1法：取丹参粉末(过三号筛，批号141101)约1.6g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入水50mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加水使混悬，转移至5mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)回流提取2法：取丹参粉末(过三号筛，批号141101)约1.6g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入水50mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加甲醇使混悬，转移至5mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)回流提取3法：取丹参粉末(过三号筛，批号141101)约1.6g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入水50mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加流动相C使混悬，转移至5mL量瓶中，加流动相C稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
通过对上述三中方法回流提取的丹参药材有效成分采用上述实施例3的色谱条件检测方法进行HPLC检测，则回流提取图谱，如图6所示。
(4)超声提取1法：取丹参粉末(过三号筛，批号141101)约1.6g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入水50mL，称定重量，超声25min(功率：200W,频率：40KHz)，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加水使混悬，转移至5mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(5)超声提取2法：取丹参粉末(过三号筛，批号141101)约1.6g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入水50mL，称定重量，超声25min(功率：200W,频率：40KHz)，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加甲醇使混悬，转移至5mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(6)超声提取3法：取丹参粉末(过三号筛，批号141101)约1.6g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入水50mL，称定重量，超声25min(功率：200W,频率：40KHz)，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加流动相C使混悬，转移至5mL量瓶中，加流动相C稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
通过对上述三中方法超声提取的丹参药材有效成分采用上述实施例3的色谱条件检测方法进行HPLC检测，则回流提取图谱，如图7所示。
对比图6与图7所示，对色谱峰的个数、各峰峰面积以及各峰分离度进行对比，发现加热回流和超声提取差异不大，因此选择超声提取，操作简便。通过对比不同溶剂对指纹图谱的影响，结果甲醇溶解峰峰面积比较小，而用流动相C进行溶解峰分离度较好，所以选择流动相C作为溶解溶剂，最终确定够供试品溶液的制备方法采用上述超声提取3法制备。
实施例7：丹参药材指纹图谱的测定7
1、试剂：丹参素钠(中国食品药品检定研究院，纯度98.8％，批号110855-201413)；丹参酮IIA(中国食品药品检定研究院，纯度99％，批号110766-201520)；隐丹参酮(中国食品药品检定研究院，批号110885-200102)；咖啡酸(中国食品药品检定研究院，纯度99.5％，批号110766-201520)；丹酚酸B(中国食品药品检定研究院，纯度94.1％，批号111562-201416)；迷迭香酸(中国食品药品检定研究院，纯度90.5％，批号111871-201404)；原儿茶醛(中国食品药品检定研究院，纯度98.2％，批号110810-201007)。
水为纯净水；乙腈、甲醇为色谱纯；其它试剂均为分析纯。
2、仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪；电子分析天平(NETTLER TOLEDONewClassic MS,瑞士梅特勒-托利多集团)。
3、供试品溶液的制备：取丹参粉末(过三号筛)约1.6g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入水50mL，称定重量，超声处理25min(功率：200W,频率40KHz)，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加流动相C使混悬，转移至5mL量瓶中，加流动相C稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料：Waters Xbridge C18色谱柱(250mm*4.6mm，5μm))。以流动相A为乙腈，流动相B为甲醇，流动相C为磷酸水溶液，梯度条件为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 流动相C(％)
0-2 0 5 95
2-10 0→5 5 95→90
10-55 5→10 5→40 95→50
55-65 10→15 40→80 50→5
65-66 15→0 80→5 5→95
66-70 0 5 95
流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为295nm，进样体积：10ul。
结果：丹参药材的指纹图谱个色谱峰的保留时间为：1号峰为20.98，2号峰为24.02,3号峰为28.02,4号峰为32.43,5号峰为38,36，6号峰为39.61,7号峰为47.04,8号峰为52.73，9号峰为57.86,10号峰为59.30。如图9所示。
实施例8：丹香葡萄糖滴注液指纹图谱中有效成分的鉴定
本发明还对上述得到的丹香葡萄糖滴注液指纹图谱中化合物的结构进行了研究，通过将上述丹香葡萄糖滴注液的HPLC检测方法与有效成分对照品液相色谱数据对比，鉴定上述丹香葡萄糖滴注液指纹图谱中共有吸收峰的化学成分，即通过将色谱峰的保留时间同有效成分对照品的保留时间对比，最终确认其成分。其中有7个化合物是通过与有效成分对照品保留时间进行对照从而进行鉴定的。
其中对照品的高效液相色谱测定方法为：
(1)有效成分对照品：丹参素钠(中国食品药品检定研究院，纯度98.8％，批号110855-201413)；丹参酮IIA(中国食品药品检定研究院，纯度99％，批号110766-201520)；隐丹参酮(中国食品药品检定研究院，批号110885-200102)；咖啡酸(中国食品药品检定研究院，纯度99.5％，批号110766-201520)；丹酚酸B(中国食品药品检定研究院，纯度94.1％，批号111562-201416)；迷迭香酸(中国食品药品检定研究院，纯度90.5％，批号111871-201404)；原儿茶醛(中国食品药品检定研究院，纯度98.2％，批号110810-201007)。
(2)有效成分对照品溶液的制备：分别取适量的对照品，加流动相C使溶解，转移至5mL量瓶中，加流动相C稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)液相色谱条件和测定方法同本实施例中“丹香葡萄糖滴注液指纹图谱的测定”中的液相色谱条件和测定方法相同。
结果：通过对比丹香葡萄糖滴注液指纹图谱与上述有效成分对照品的指纹图谱可知，2号峰为丹参素钠,3号峰为原儿茶醛,5号为峰迷迭香酸,7号峰为咖啡酸，9号峰为丹酚酸B,10号峰为丹参酮IIA,11号峰为隐丹参酮。
实施例9：精密度实验
取丹香葡萄糖滴注液(批号：150401)，根据上述实施例1中供试品溶液的制备项下制备供试品溶液，按照上述实施例3中用于检测指纹图谱的色谱条件进样分析，连续进样6次，记录指纹图谱，考察共有峰2和3相对峰面积和相对保留时间RSD，如图10所示。
其中精密度实验结果(相对保留时间)如下表所示：
实验次数 峰2 峰3
1 0.697 1.000
2 0.695 1.000
3 0.696 1.000
4 0.696 1.000
5 0.696 1.000
6 0.695 1.000
平均值 0.696 1.000
RSD(％) 0.11 0.00
精密度度实验结果(相对峰面积值)如下表所示：
Figure BDA0002926886540000111
Figure BDA0002926886540000121
结果表明2个共有峰相对保留时间和相对峰面积基本一致，相对保留时间RSD小于3.0％，相对峰面积RSD小于5.0％，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。
实施例9：丹香葡萄糖滴注液指纹图谱相似度评价
取10批丹香葡萄糖滴注液与对照指纹图谱比较，其中10批丹香葡萄糖滴注液HPLC图谱如图11所示，计算各批丹香葡萄糖滴注液中共有峰相对峰面积值和相似度，结果见下表所示。
丹香葡萄糖滴注液指纹图谱主要共有峰相对峰面积结果
样品批次 相对峰面积
151101 0.36
151102 0.35
151103 0.34
151201 0.33
151202 0.35
151203 0.38
160101 0.38
160102 0.37
160103 0.36
160104 0.38
丹香葡萄糖滴注液与对照图谱的相似度
Figure BDA0002926886540000122
Figure BDA0002926886540000131
结果显示供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于等于0.90，各批次间相对峰面积差值小于±20％，说明建立的丹香葡萄糖滴注液指纹图谱稳定可靠。
实施例10：丹香葡萄糖滴注液稳定性试验评价
取丹香葡萄糖滴注液(批号150401)，根据实施例1项下制备供试品溶液，分别按照实施例3的方法在0,4,8,12,24,48h进样测定，记录指纹图谱，考察共有峰相对峰面积和相对保留时间RSD。结果见下表所示。
稳定性实验结果(相对保留时间)如下表所示：
实验次数 峰2 峰3
1 0.697 1.000
2 0.695 1.000
3 0.697 1.000
4 0.695 1.000
5 0.695 1.000
6 0.695 1.000
平均值 0.696 1.000
RSD(％) 0.15 0.00
稳定性实验结果(相对峰面积值)如下表所示：
Figure BDA0002926886540000132
Figure BDA0002926886540000141
结果表明峰2和峰3的相对保留时间RSD小于3.0％，相对峰面积RSD小于5.0％，符合指纹图谱要求，表明丹香葡萄糖滴注液供试液指纹图谱在48h内时稳定的。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种药物指纹图谱的测定方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)供试品溶液的制备：取药物适量，溶于流动相C中，摇匀，滤过，取续滤液；(2)色谱条件：色谱柱为Shimadu shim-pack C18色谱柱，色谱柱规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为甲醇，流动相C为0.08％磷酸水溶液；检测波长295nm，流速为1mL/min，柱温为30℃，进料量为10μL；(3)测定吸取上述供试品溶液注入液相色谱仪，使用高效液相色谱法进行测定，得到药物指纹图谱；其中，所述药物为丹香葡萄糖滴注液；
梯度洗脱程序为：
0-2min时，流动相A为0，流动相B为5％的甲醇；流动相C为95％的0.08％磷酸水溶液；
10min时，流动相A为5％的乙腈，流动相B为5％的甲醇；流动相C为90％的0.08％磷酸水溶液；
55min时，流动相A为10％的乙腈，流动相B为40％的甲醇；流动相C为50％的0.08％磷酸水溶液；
65min时，流动相A为15％的乙腈，流动相B为80％的甲醇；流动相C为5％的0.08％磷酸水溶液；
66min时，流动相A为0，流动相B为5％的甲醇；流动相C为95％的0.08％磷酸水溶液；
70min时，流动相A为0，流动相B为5％的甲醇；流动相C为95％的0.08％磷酸水溶液；
所测得的丹香葡萄糖注射液指纹图谱中共有11个指纹峰为：1号峰为8.67,2号峰10.89,3号峰15.20,4号峰31.98，5号峰32.37,6号峰为34.04,7号峰为38.41,8号峰为43.96，9号峰52.70，10号峰为57.88,11号峰为59.35；
其中，2号峰为丹参素钠,3号峰为原儿茶醛,5号峰为 迷迭香酸,7号峰为咖啡酸，9号峰为丹酚酸B,10号峰为丹参酮IIA,11号峰为隐丹参酮；其余峰为丹香葡萄糖滴注液中共有峰。
2.根据权利要求1所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述药物为丹香葡萄糖滴注液时，供试品溶液的制备方法为：精密量取2-5mL丹香葡萄糖滴注液，置25mL量瓶中，加流动相C稀释至刻度，摇匀，即得。
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