CN1588046A - 中药多指标成分指纹图谱及其构建方法与应用 - Google Patents

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CN1588046A CN 200410058532 CN200410058532A CN1588046A CN 1588046 A CN1588046 A CN 1588046A CN 200410058532 CN200410058532 CN 200410058532 CN 200410058532 A CN200410058532 A CN 200410058532A CN 1588046 A CN1588046 A CN 1588046A
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罗国安
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Abstract

本发明涉及一种中药多指标成分指纹图谱及其构建方法与应用。该方法包括以下步骤：(1)针对研究对象选择样品，按照一般操作规范建立指纹图谱，并满足精密度、重现性、稳定性在内的方法学要求；(2)对指纹图谱中多指标成分进行定性：包括三个层次：第一个层次，采用标准品定性；第二个层次，采用“准标准品”相对定性；第三个层次，根据已知信息对指标成分进行化合物结构指认或推断其结构式；(3)对指纹图谱中多指标成分进行定量，包括两个层次：第一个层次，采用标准品定量；第二个层次，采用“相对响应因子”相对定量。本发明加强了指纹图谱对中药信息的表达能力和规范程度，本发明的指纹图谱可以广泛应用于中药质量评价、中药质量控制和中药新药研发中。

Description

中药多指标成分指纹图谱及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种中药多指标成分指纹图谱及其构建方法与应用。
背景技术
传统的中药质量控制往往照搬西药的做法采用单一指标成分定量的模式，但是实践证明这种模式不符合中医药的特点，不能从整体上评价和控制中药的质量。中药指纹图谱由于体现了中医药的整体、宏观、复杂等特点，很快成为国内外广泛接受的中药质量评价模式。近年来中药指纹图谱的研究进展很快，特别是国家药品监督管理局颁发的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》对中药指纹图谱研究的规范化起到了重要作用，中药指纹图谱研究取得了许多阶段性的成果，奠定了其在现代中药质量标准体系中的核心地位。
但是现有的中药指纹图谱技术尚存在着一定的局限性，例如：1、既往的指纹图谱研究一般尚停留在指纹性鉴别或整体相似度的评价，抓住了宏观特征，也就是总体轮廓，而对于微观特征如具体色谱峰的化学信息和物质含量等没有得到较好的体现。虽然这对于指纹图谱发展初级阶段，将其用于中药鉴别和整体质量控制的阶段性目标是可行的，但是随着现代分析技术的进步，指纹图谱必然向高级阶段发展以扩展其应用范围，而要使指纹图谱的应用进一步有所突破，最关键的问题应该是解决指纹图谱的量化问题，即尽可能多地定性定量地揭示各色谱峰即指标成分的化学特征信息，从而实现宏观信息和微观信息、质与量的统一。这就要求指纹图谱技术要从方法上有所创新。2、由于中药的复杂性和中药指纹图谱信号响应的非线性，指纹图谱相似度的差异与化合物含量的差异不成比例关系，整体相似度对于体现个体成分的含量变化不敏感，因此这种指纹图谱在整体轮廓上的相似性，虽然在一定程度上体现了中药的整体性、宏观性的特征，但是过于模糊和粗放，体现不了指纹图谱的特征成分和指标成分的化学性质和具体含量，对中药信息的表达能力不够。3、传统分析的定性定量方法都是以标准品比对为基础，但是由于中药成分复杂繁多，绝大部分成分没有标准品，一一制备其单体成分是不现实的，因此对中药成分的定性和定量成为制约中药分析的一个瓶颈，仅仅依赖中药标准品对中药指纹图谱色谱峰进行指认和含量测定，现阶段难以大范围推广。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种中药多指标成分指纹图谱及其构建方法与应用，其能够突破中药标准品匮乏的瓶颈，通过多种方法对指纹图谱的多个指标成分进行定性定量分析，表达更丰富的化学组成和含量信息，将中药指纹图谱的整体特征和成分特异性统一起来，进一步扩展和规范指纹图谱在中药领域中的应用。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种多指标成分中药指纹图谱的构建方法，其包括以下步骤：(1)针对具体研究对象选择样品，按照传统中药指纹图谱的一般操作规范，建立样品的提取方法，优化分离条件，建立其指纹图谱，并满足指纹图谱的包括精密度、重现性、稳定性在内的方法学要求；(2)对所述指纹图谱中的多指标成分定性：对中药指纹图谱中多指标成分进行鉴定或鉴别，其包括三个定性层次：第一个层次，采用标准品定性；第二个层次，采用“准标准品”相对定性；第三个层次，在所述第二个层次的基础上，根据已知信息对指标成分进行化合物结构指认或推断其结构式；(3)对指纹图谱中多指标成分进行定量，对中药指纹图谱中的指标成分进行定量或相对定量，其包括两个层次：第一个层次，采用标准品定量；第二个层次，采用“相对响应因子”相对定量。
所述“准标准品”相对定性，就是采用现代分析仪器多维联用技术，如液相色谱/二极管阵列检测器/质谱/质谱(HPLC/DAD/MS/MS)等，得到指纹图谱中色谱峰的保留时间、在线紫外光谱、分子量，以及结构信息等表征化合物的基本化学信息(建立标识该化合物的“条形码”)，将具备了这些基本化学信息的而且具有重复性和稳定性的色谱峰所代表的化合物作为“准标准品”(不一定推断出化合物的结构式)，通过将相同条件下获取的样品指纹图谱色谱峰的相关信息与“准标准品”对照(类似于比对两者的“条形码”信息)，对未知样品色谱峰的指认和专属性鉴别。
所述采用“相对响应因子”相对定量是指：在相同条件下标定中药成分A与结构性质相近的标准品B的峰面积比值，如果通过实验证实，该比值在指纹图谱测定条件下具有稳定性，则把该比值称为化合物A对B的相对响应因子，在实际样品分析时，仅计算所述中药成分A对标准品B的相对峰面积，结合相对响应因子和标准品B的具体含量，求出所述中药成分A实际的含量。
一种用上述多指标成分指纹图谱的构建方法得到的多指标成分指纹图谱。
上述多指标成分中药指纹图谱在中药质量评价中，或中药质量控制中，或中药新药开发中的应用。
与过去的指纹图谱相比，本发明具有以下明显优点：1、本发明将指纹图谱与多指标成分定性定量相结合，引入“准标准品”、“相对响应因子”等新概念，采用标准品或结合现代分析仪器多维联用技术的“准标准品”，对指纹图谱中多个指标成分进行定性和相对定性，并采用标准品或相对响应因子对多个指标成分进行精确定量或相对定量，从而赋予中药指纹图谱更多更明确的化学信息和含量信息。2、本发明引入“准标准品”、“相对响应因子”等新概念，解决了中药成分定性、定量分析中面临的中药标准品匮乏的瓶颈，保证了本发明方法的实用性和可操作性。3、本发明在构建指纹图谱的方法中引入了多指标成分定性定量新方法，突破了传统指纹图谱的过于模糊性，对指纹图谱的主要成分进～步明确和量化，将中药指纹图谱的整体特征和成分特异性统一起来，从而可以满足技术进步和新的发展需求。本发明不仅可以用于中药的质量评价和质量控制，而且可以作为中药新药研发以及中医药理论基础研究的重要工具，例如中药组效关系研究，中药的药代动力学研究等。
附图说明
图1是麻黄药材HPLC标准指纹图谱
图2是6种麻黄生物碱标准品的HPLC色谱图
图3是某麻黄药材指纹图谱(部分放大)未知色谱峰定性与指认
图4是丹参药材HPLC标准指纹图谱
图5是丹参素对照品色谱图
图6是原儿茶醛对照品色谱图
图7是咖啡酸对照品色谱图
图8是迷迭香酸对照品色谱图
图9是丹酚酸B对照品色谱图
图10是隐丹参酮对照品色谱图
图11是丹参酮I对照品色谱图
图12是丹参酮IIA对照品色谱图
具体实施方式
下面结合附图和实施例，进一步说明本发明多指标成分中药指纹图谱的构建方法及应用。
实例一：麻黄多指标成分定量指纹图谱构建方法及应用
1、色谱指纹图谱的获取及方法学验证
(1)实验仪器与试剂
高效液相色谱仪HPLC(waters公司，带自动进样器)；
色谱柱Phenomenex Synergi PolarRP(4.6×150mm，4μm)；
固相萃取柱SPE(6mL，500mg SCX)；
甲醇(色谱纯，Fisher公司)；
磷酸二氢钾(分析纯)；
磷酸(分析纯，85％)；
氨水(分析纯，25％-28％)；
6种麻黄生物碱标准品(购自ChromaDex公司，纯度98％以上)：去甲基麻黄碱(NE)；去甲基伪麻黄碱(NPE)；麻黄碱(E)；伪麻黄碱(PE)；N-甲基麻黄碱(ME)；N-甲基伪麻黄碱(MPE)；
(2)待测样品
据《中华人民共和国药典(2000年版)》，入药麻黄指麻黄科植物草麻黄(Ephedrasinica Stapf)、中麻黄Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Mey.)或木贼麻黄(Ephedraequisetina Bge.)的干燥草质茎。在全国范围内分别对三个品种不同产地的麻黄药材进行了采集及采购。
(3)样品处理
试剂的准备：
A、流动相缓冲溶液
称取13.6g KH2PO4，溶解于1000mL二次水中备用。
B、流动相
取970mL上述流动相缓冲溶液，加入30mL甲醇，用0.45μm尼龙膜过滤后备用。
C、稀释液
取30mL甲醇和970mL水，加入1.3g KH2PO4，搅拌溶解。
D、50mM H3PO4
在100mL水中加入345μL 85％H3PO4混合均匀。
E、500mM H3PO4
100mL水中加入3.5mL 85％H3PO4混合均匀。
F、固相萃取(SPE)洗脱液
将5mL氨水和95mL甲醇混合。
(4)药品提取及纯化
准确称量2.0g(±0.2g)的麻黄药材转移到100mL容量瓶中，加入50mL稀释剂，机械振荡15min，超声45min。溶液平衡到室温，用稀释剂稀释到刻度，混合均匀，样品溶液分析前经过以下固相萃取处理过程：
A、SPE柱的活化
依次通过2mL甲醇和1mL 50mM H3PO4，勿使SPE柱流干。
B、装样
样品溶液：取约10mL样品溶液2000rpm离心10分钟，或者静置至少1小时至澄清。吸取5mL样品溶液加入SPE柱，控制流速不超过2mL/min。使柱子流干，弃去流出液。
C、洗柱
用1mL 50mM H3PO4溶液冲洗SPE柱子，使柱子流干，弃去流出液，接着，用2mL甲醇冲洗，使柱子流干，弃去流出液。
D、洗脱
加入3mL SPE洗脱液，流出液收集到10mL容量瓶中。取下容量瓶，加入5mL500mM H3PO4，平衡到室温后用500mM H3PO4稀释至刻度，混合均匀，作为供试液。
(5)指纹图谱HPLC条件：
色谱柱：Phenomenex Synergi PolarRP(4.6×150mm，4μm)；
操作温度：25℃
流动相：甲醇∶100mM KH2PO4＝3∶97(体积比)
流速：1.5mL/minute
检测波长：210nm
进样体积：20μL
(6)麻黄药材指纹图谱及方法学验证：
在上述色谱条件下对提取的麻黄药材样品依次进样分析，得到各个麻黄药材的HPLC指纹图谱，典型的麻黄药材指纹图谱(如图1所示)中，色谱峰9是去甲基麻黄碱(NE)；10是去甲基伪麻黄碱(NEP)；12是麻黄碱(E)；13是伪麻黄碱(PE)；14是甲基麻黄碱(ME)；15是甲基伪麻黄碱(MPE)。
在麻黄指纹图谱方法学验证中，按照前面已确定的药材提取方法及HPLC方法，以内蒙古科左后旗的麻黄药材(草麻黄)为考察对象，考察了方法的精密度、重现性及稳定性。
A、精密度
按上述方法提取一份麻黄药材，按已建立HPLC分析条件，连续进样5次，选择峰面积最大的10个共有峰，10个峰面积总和占色谱峰总面积的95％以上。计算其保留时间及峰面积及5张色谱图相似度(相关系数)的精密度。相似度计算以5张色谱图的平均谱图为基准。结果表明，主要色谱峰的保留时间稳定(RSD＜1.0％)，峰面积精密度(RSD＜2.0％)满足指纹图谱要求，相关系数也具有较好的精密度(RSD＝0.0022％)。
B、重现性
按照已建立药材提取方法，重复提取5份麻黄药材，然后进行HPLC分析，选择峰面积最大的10个共有峰，10个峰面积总和占色谱峰总面积的95％以上。计算其峰面积及5张色谱图相似度(相关系数)的相对标准偏差(RSD)，考察方法重现性。结果表明方法重现性在误差范围内(RSD＜3.0％)。
C、稳定性
按上述方法提取一份麻黄药材，于室温下放置，在不同时间点进行HPLC分析，选择峰面积最大的10个共有峰，10个峰面积总和占色谱峰总面积的95％以上，计算其峰面积及5张色谱图相似度(相关系数)的相对标准偏差(RSD)，考察样品稳定性。结果表明样品在24小时内是稳定的(RSD＜2.5％)。
通过上述过程，完成了麻黄药材的HPLC指纹图谱的获取，并对其方法学进行了验证，结果满足中药色谱指纹图谱要求。
2、麻黄指纹图谱多指标成分定性
根据掌握的资源和信息对指纹图谱的多指标成分进行不同层次的定性分析：
第一个层次：标准品定性(确认)
采用标准品对照和确认是最可靠的定性层次，分别将6种麻黄生物碱混合标准溶液进行分析，如图2所示，色谱图中标准品的化学信息列表如下(如表1所示)：
                            表1  6种麻黄生物碱标准品化学信息
    化合物 保留时间(min)    UV光谱(λm，nm) 一级质谱MS(ESI正离子)   二级质谱MS/MS   分子量
  去甲基麻黄碱   5.18     211   152，134，117   152(134，117)     151
  去甲基伪麻黄碱   6.04     211   152，134，117   152(134，117)     151
  麻黄碱   8.40     210   166，148，133   166(148，133)     165
  伪麻黄碱   9.92     210   166，148，133   166(148，133)     165
  甲基麻黄碱   13.09     208   180，162，147   180(162，147)     179
  甲基伪麻黄碱   14.29     208   180，162，147   180(162，147)     179
将未知色谱峰的化学信息与标准品进行对照，可以对其进行准确定性或确认。
第二个层次：“准标准品”相对定性
在相同色谱条件下，采用液相色谱/二极管阵列检测器/质谱/质谱多维联用技术，得到麻黄HPLC标准指纹图谱中各色谱峰的保留时间、在线紫外光谱、分子量及结构信息等一系列表征化合物的基本化学信息(如表2所示)：
                  表2麻黄药材指纹图谱中6种“准标准品”基本化学信息
色谱峰编号   保留时间(min)    UV光谱(λm，nm)   一级质谱MS(ESI正离子)   二级质谱MS/MS 可能分子量 化合物代码
  9   5.21     211   152，134，117   152(134，117)   151   A
  10   6.05     211   152，134，117   152(134，117)   151   A’
  12   8.43     210   166，148，133   166(148，133)   165   B
  13   9.82     210   166，148，133   166(148，133)   165   B’
  14   12.95     208   180，162，147   180(162，147)   179   C
  15   14.20     208   180，162，147   180(162，147)   179   C’
具备了这些基本化学信息的色谱峰就可以作为“准标准品”，表1中色谱峰9号和10号除了保留时间差异之外，UV光谱和质谱信息极其相似，可能是一对结构极其相似的同分异构体(如手性异构体)，因此命名为化合物A和A’，同样可命名B和B’及C和C’，这六个化合物就成为“准标准品”，可用于指纹图谱色谱峰的指认和专属性鉴别。例如将相同条件下获取的某麻黄样品的指纹图谱(如图3所示)的色谱峰相关信息与“准标准品”对照，就可以准确对未知色谱峰进行指认，指认结果(如表3所示)：
                        表3某麻黄药材样品指纹图谱色谱峰的指认
色谱峰编号   保留时间(min)   UV光谱(λm，nm)    一级质谱MS(ESI正离子)   二级质谱MS/MS 可能分子量 化合物指认
    9   5.18     211   152，134，117   152(134，117)     151     A
    10   6.03     211   152，134，117   152(134，117)     151     A’
    13   8.39     210   166，148，133   166(148，133)     165     B
    14   9.87     210   166，148，133   166(148，133)     165     B’
    16   13.08     208   180，162，147   180(162，147)     179     C
    17   14.31     208   180，162，147   180(162，147)     179     C’
第三个层次：尽可能推断和指认色谱峰对应化合物的结构式
根据文献报道的麻黄药材中化学成分研究，化合物B和B’的UV光谱，分子量及二级质谱与麻黄碱和伪麻黄碱非常吻合，另外根据文献报道，在麻黄的反相液相色谱图中左旋碱往往比右旋的手性异构体保留值小，因此推断B为麻黄碱而B’为伪麻黄碱，A和C系列分别比B系列少或多一个甲基(分子量差14)，同样根据文献资料，可以推断其结构式分别为去甲基麻黄碱，去甲基伪麻黄碱，甲基麻黄碱，甲基伪麻黄碱。
通过上述第一个层次6种标准品确认分析，也验证了第二个层次和第三个层次的定性指认是正确的，合理的，因此对于中药指纹图谱中很多指标成分在得不到标准品的条件下，根据情况采取第二个层次或第三个层次的定性分析是一条必要的而且可行的多指标成分定性分析的手段。
(3)麻黄指纹图谱多指标成分定量
A、精确定量：
去甲基麻黄碱、麻黄碱、甲基麻黄碱3种麻黄生物碱标准品获取相对容易，可以采用外标法精确定量。分别建立去甲基麻黄碱、麻黄碱、甲基麻黄碱的标准曲线，计算麻黄样品中3种指标成分的精确含量(如表4所示)：
  表4不同品种麻黄药材中3种麻黄生物碱精确定量(单位：μg/g)
    样品编号   去甲基麻黄碱NE   麻黄碱E 甲基麻黄碱ME
    草麻黄：
    1     127     5820     510
    2     394     10006     899
    3     254     15471     1888
    4     180     6728     713
    5     708     11452     906
    6     446     4474     646
    7     308     5996     434
    8     61.4     2973     267
    木贼麻黄：
    19     2958     27625     458
    20     2969     27934     472
    21     758     16863     522
    22     783     17265     586
    中麻黄
    23     368     1935     223
    24     474     3073     318
    25     360     3843     524
    26     76.4     3613     380
    27     371     1974     221
    28     1091     8319     1322
    伪品(节节草)     ＜25     ＜25     ＜25
B、相对响应因子定量：
去甲基伪麻黄碱、伪麻黄碱、甲基伪麻黄碱分别为去甲基麻黄碱、麻黄碱、甲基麻黄碱的旋光异构体，可以采用相对响应因子定量。这些相对响应因子数值具有良好的稳定性和重现性，因此在计算样品中去甲基伪麻黄碱、伪麻黄碱、甲基伪麻黄碱的含量时，可以不必要每次都要求用标准品建立标准曲线，而采用相对响应因子数值参与计算。
首先利用标准品分别标定去甲基伪麻黄碱对去甲基麻黄碱、伪麻黄碱对麻黄碱、甲基伪麻黄碱对甲基麻黄碱的相对响应因子，分别计算去甲基伪麻黄碱对去甲基麻黄碱、伪麻黄碱对麻黄碱、甲基伪麻黄碱对甲基麻黄碱的相对峰面积；
去甲基伪麻黄碱、伪麻黄碱公式、甲基伪麻黄碱的含量计算公式为：
分析物含量＝相对响应因子×相对峰面积×参照物质含量，或者
分析物含量＝相对响应因子×相对含量
其中：相对含量是指按照参照物质的标准曲线计算得到的待测物质含量，计算结果如下(如表5所示)：
          表5相对响应因子法计算麻黄药材中3种麻黄生物碱含量(单位：μg/g)
样品编号   相对响应因子NPE/NE 1.024   相对响应因子PE/E 1.053  相对响应因子MPE/ME 0.979
  相对峰面积NPE/NE NPE含量   相对峰面积PE/E PE含量  相对峰面积PE/E MPE含量
  草麻黄
    1     10.112     1315     0.792     4720     -     ＜25
    2     0.146     58.9     0.290     3060     -     ＜25
    3     1.050     273     0.105     1710     -     ＜25
    4     1.563     288     0.577     4090     -     ＜25
    5     1.263     916     0.330     3980     -     ＜25
    6     0.755     345     0.548     2580   -     ＜25
    7     3.995     1260     0.645     4070   -     ＜25
    8     5.933     373     0.731     2290   -     ＜25
  木贼麻黄
    19     1.692     5126     0.235     6850   -     ＜25
    20     1.678     5103     0.234     6870   -     ＜25
    21     2.708     2102     0.207     3670   -     ＜25
    22     2.639     2116     0.208     3790   -     ＜25
  中麻黄
    23     3.023     1139     6.094     12416   2.025     442
    24     1.834     890     3.534     11435   1.831     570
    25     3.605     1329     3.015     12200   0.669     343
    26     10.379     812     1.254     4770   0.075     28
    27     3.077     1169     5.927     12320   0.227     49.2
    28     1.049     1172     1.330     11650   0.036     46.6
  伪品(节节草) - ＜25 - 81.1 - 36.6
C、计算结果验证：
为了验证相对响应因子定量计算的可行性，还同时采用去甲基伪麻黄碱、伪麻黄碱公式、甲基伪麻黄碱3种标准品外标法对上述3种成分进行了精确定量，结果表明相对响应因子法定量计算的结果与标准品精确定量结果无显著差异，计算结果比较列表如下(如表6所示)：
                表6相对响应因子法和外标法定量结果比较(单位：μg/g)
样品编号     去甲基伪麻黄碱NPE     伪麻黄碱PE   甲基伪麻黄碱MPE
外标法   相对响应因子法   相对偏差(％) 外标法  相对响应因子法   相对偏差(％) 外标法   相对响应因子法 相对偏差(％)
草麻黄
    1  1326  1315  -0.83  4697  4720  0.49 ＜25 ＜25  -
    2  56.9  58.9  3.51  2993  3060  2.24 ＜25 ＜25  -
    3  261   273 4.60   1652  1710   3.51  ＜25   ＜25  -
    4  276   288 4.35   4072  4090   0.44  ＜25   ＜25  -
5 908 916 0.88 3993 3980 -0.33 ＜25 ＜25 -
    6  334   345 3.29   2536  2580   1.74  ＜25   ＜25  -
    7  1263   1260 -0.24   4020  4070   1.24  ＜25   ＜25  -
    8  366   373 1.91   2224  2290   2.97  ＜25   ＜25  -
木贼麻黄
    19  5219   5126 -1.78   6831  6850   0.28  ＜25   ＜25  -
    20  5263   5103 -3.04   6859  6870   0.16  ＜25   ＜25  -
    21  2149   2102 -2.19   3604  3670   1.83  ＜25   ＜25  -
    22  2216   2116 -4.51   3762  3790   0.74  ＜25   ＜25  -
中麻黄
    23  1159   1139 -1.73   12568  12416   -1.21  459   442  -3.70
    24  895   890 -0.56   11524  11435   -0.77  595   570  -4.20
    25  1349   1329 -1.48   12274  12200   -0.60  355   343  -3.38
    26  801   812 1.37   4751  4770   0.40  25   28  12.00
    27  1188   1169 -1.60   12520  12320   -1.60  47.4   49.2  3.80
    28  1180   1172 -0.68   11714  11650   -0.55  44.8   46.6  4.02
伪品(节节草) ＜25 ＜25 - 81.1 36.6
上述结果表明相对响应因子法定量分析是可行的，一般来说，待测物与参照物质结构和性质越相似，其相对响应因子越接近于1，因此在待测物缺乏标准品的情况下也可以不须标定相对响应因子，近似计算取相对响应因子数值为1。因此在当前很多中药标准品制备困难或价格昂贵的条件下，对于中药指纹图谱中很多指标成分，可以根据情况选取不同层次的定量分析方法，这为实现中药指纹图谱的多指标成分定量提供了一条现实的途径。
(4)应用
麻黄多指标成分定量指纹图谱可应用于麻黄药材质量评价，药材种属鉴别和真伪鉴别。例如，伪品节节草的鉴别，从指纹图谱相似度看，节节草指纹图谱与麻黄(草麻黄)标准指纹图谱的相似度系数(夹角余弦法计算)仅有0.23，而麻黄药材均在0.85以上；进一步从6种生物碱的定量数据看，节节草含有微量伪麻黄碱和甲基伪麻黄碱，但与麻黄药材的含量相差10倍以上，而麻黄药材中都含有的另外四种生物碱在节节草中没有检测到，因此进一步验证该样品为伪品。
实例二：丹参多指标成分定性定量指纹图谱构建方法
1、指纹图谱的获取及方法学验证
(1)药材粉碎
丹参药材样品在分析之前必须进行粉碎，粉碎量至少为一次分析所需量的20倍，粉碎前将药材切成小段，粉碎后所有药材通过2号筛。
(2)样品制备
(A)精确称取约0.2g丹参粉末，加入10mL甲醇。
(B)超声提取30分钟。
(C)约3000转下离心5分钟。
(D)将上清夜转移到25mL容量瓶内。
(E)将残渣用约10mL双蒸水转移到50mL烧杯中。
(F)记录烧杯与样品重量。
(G)烧杯口覆盖铝膜。
(H)微沸提取30分钟。
(I)烧杯冷却后加水补重。
(J)将溶液转移至离心试管中，约3000转下离心5分钟。
(K)将上清夜转移到同一个25mL容量瓶内。
(L)冷却后甲醇定容。
(M)HPLC分析前过0.2μm微孔滤膜。
(3)色谱条件
仪器：        Agilent 1100 series HPLC
色谱柱：      Alltima C18(5μm，4.6mm×250mm)
检测波长：    280nm
流速：        1.0mL/min
柱温：        室温
进样量：      20μL
流动相(如表7所示)：
                 表7流动相的梯度设置
  时间(min)   A：水/甲酸/乙腈(90∶0.4∶10)     B：乙腈
    0     100％     0％
    40     70％     30％
    50     20％     80％
    70     15％     85％
(4)丹参药材指纹图谱
典型的丹参药材HPLC指纹图谱(如图4所示)中，水溶性的丹酚酸类物质和酯溶性的二萜类(丹参酮类)物质在这张指纹图谱中得到了同时体现。图4中，1为丹参素，2为原儿茶酸，3为原儿茶醛，4为咖啡酸，5为丹酚酸F，6为丹酚酸D，7为丹酚酸J/异构体，8为丹酚酸E，9为迷迭香酸，10为紫草酸，11为丹酚酸B，12为丹酚酸E/异构体，13为丹酚酸A，14为二氢丹参酮I，15为四氢丹参酮/异构体，16为隐丹参酮，17为丹参酮I，18为丹参酮IIA。其中1～4、9～11、14、16～18号峰系用标准对照品鉴定，5～8、12、13、15号峰系用HPLC/MS/MS结果判别。
(5)指纹图谱方法学验证
对建立的丹参药材指纹图谱进行了系统的方法学考察，结果如下：
a、系统适应性：按参照成分迷迭香酸色谱峰峰计，理论塔板数＞100000，迷迭香酸与相邻的色谱峰分离度＞2.0；
b、准确度：按参照物质迷迭香酸计算，其高、中、低三个水平的加样回收率为98.8～101.2％；
c、精密度：5份供试品11种指标成分的相对保留时间RSD小于0.5％，相对峰面积RSD小于2.5％；
d、重复性：5次连续测定11种指标成分的相对保留时间RSD小于1.0％，相对峰面积RSD小于4.3％；
e、稳定性：样本在15小时内具有较好稳定性，5次间隔测定11种指标成分的相对保留时间RSD小于0.5％，相对峰面积RSD小于2.7％；
f、系统耐受性：流动相主成分配比变化的10％范围内指纹图谱无明显漂移，柱温箱恒温设定在25±1℃温度变化指纹图谱无明显漂移；不同仪器具有较好的重现性，在三台不同厂家仪器测试得到的指纹图谱相似系数大于0.97；
g、测试范围：样本测试范围按参照物质浓度标示值80～120％范围，11种指标成分色谱峰面积与浓度呈同比线性范围，线性相关系数大于0.997；
2、丹参指纹图谱多指标成分定性
第一个层次：标准品定性(确认)
采用已有的11种标准品对其中11种指标成分进行了确认(如图5～图12所示)。
第二个层次：采用液相色谱/二极管阵列检测器/质谱/质谱多维联用技术，得到丹参HPLC标准指纹图谱中18个指标成分色谱峰的保留时间、在线紫外光谱、分子量及结构信息等一系列表征化合物的基本化学信息(如表8所示)，作为“准标准品”。
                   表8丹参指纹图谱指标峰化学特征数据、结构推断及确认
   Peak  tR(min) 化合物分子量     MS-MS碎片(m/z)   结构推断 标准品确认(√)
    1     6.8     198   197，179，137   丹参素     √
    2     10.3     154   153   原儿茶酸     √
    3     13.6     138   137   原儿茶醛     √
    4     16.5     180   179，135   咖啡酸     √
    5     21.9     314   313，269，159   丹酚酸F     √
    6     26.1     418   417，373   丹酚酸D
    7     27.8     538   537，339，493，296   丹酚酸J/异构体
    8     29.2     718   717，519，537   丹酚酸E
    9     30.3     360   359，161，197，179   迷迭香酸     √
    10     31.2     538   537，493，295，383   紫草酸     √
    11     33.6     718   717，519，321，537   丹酚酸B     √
    12     34.6     718   717，519，537   丹酚酸E/异构体
    13     37.2     494   493，296   丹酚酸A
    14     50.8     278   279，261，233   二氢丹参酮I     √
    15     51.6     280   281，263，235   四氢丹参酮/异构体
    16     53.2     296   297，269，251   隐丹参酮     √
    17     54.2     276   277，249，259，231   丹参酮I     √
    18     57.6     294   295，277，249   丹参酮IIA     √
第三个层次：尽可能推断和指认色谱峰对应化合物的结构式
由于植化研究工作者对丹参的化学成分进行了大量的研究工作，近百种单体成分得到了分离、鉴定，因此根据这些文献信息对上述指标成分包含的化学信息进行分析，从而对18个指标成分峰指认了化合物归属(如上表8所示)。
上述第一个层次采用已有的11种标准品对其中11种指标成分进行的确认与第二个层次和第三个层次推断的定性结果一致。
(3)丹参指纹图谱多指标成分定量
采用相对响应因子法和外标法两种方法对丹参药材中的11种指标成分的含量进行了测定。下面是四川产丹参样品中11种指标成分的含量测定结果(如表9所示)：
             表9丹参各指标成分的相对响应因子及两者方法定量结果比较
  指标成分   相对响应因子(相对于迷迭香酸)  含量1(mg/g生药)：相对响应因子法 含量2(mg/g生药)：外标法计算       偏差：(含量1-含量2)/含量2
  丹参素     3.007     1.09     1.06     2.83％
  原儿茶酸     0.997     0.011     0.013     -15.38％
  原儿茶醛     0.396     0.061     0.063     -3.17％
  咖啡酸     0.529     0.095     0.098     -3.06％
  迷迭香酸     1.000     1.85     1.85     -
  紫草酸     1.365     2.50     2.56     -2.34％
  丹酚酸B     0.747     21.3     21.9     -2.74％
  二氢丹参酮     0.381     0.087     0.083     4.82％
  隐丹参酮     0.666     0.328     0.332     -1.20％
  丹参酮I     0.408     0.059     0.063     -6.35％
  丹参酮II     0.487     0.796     0.765     4.05％
结果表明两种方法计算的定量数据无显著性差异。因此，如果在标准品不够齐全的情况下，采用相对响应因子法定量就可以有效地获取更多的指标成分的定量数据，从而为实现指纹图谱的多指标成分定量提供了一种可行的方法。
(4)应用
建立的丹参多指标成分定量指纹图谱可应用于药材的真伪鉴别、质量评价以及中药组效相关性研究等。

Claims (8)

1、一种中药多指标成分指纹图谱的构建方法，其包括以下步骤：
(1)针对具体研究对象选择样品，按照传统中药指纹图谱的一般操作规范，建立样品的提取方法，优化分离条件，建立其指纹图谱，并满足包括精密度、重现性、稳定性在内的方法学要求；
(2)对指纹图谱中多指标成分进行定性：对中药指纹图谱中的多指标成分进行鉴定或鉴别，其包括三个层次：第一个层次，采用标准品定性；第二个层次，采用“准标准品”相对定性；第三个层次，在所述第二个层次的基础上，根据已知信息对指标成分进行化合物结构指认或推断其结构式；
(3)对指纹图谱中多指标成分进行定量，对中药指纹图谱中的指标成分进行定量或相对定量，其包括两个层次：第一个层次，采用标准品定量；第二个层次，采用“相对响应因子”相对定量。
2、如权利要求1所述的中药多指标成分指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述“准标准品”相对定性，就是采用现代分析仪器多维联用技术，得到标准指纹图谱中色谱峰的保留时间、在线紫外光谱、分子量的基本化学信息，将具备了这些基本化学信息且具有重复性和稳定性的色谱峰所代表的化合物作为“准标准品”，通过将相同条件下获取的样品指纹图谱的相关信息与所述“准标准品”对照，对未知样品色谱峰进行指认和专属性鉴别。
3、如权利要求2所述的中药多指标成分指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述基本化学信息还包括指标成分的结构信息。
4、如权利要求1或2或3所述的中药多指标成分指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述“相对响应因子”相对定量是指：在相同条件下标定中药成分A与结构性质相近的标准品B的峰面积比值，如果通过实验证实，该比值在指纹图谱测定条件下具有稳定性，则把该比值称为化合物A对B的相对响应因子，在实际样品分析时，仅计算所述中药成分A对标准品B的相对峰面积，结合相对响应因子和标准品B的具体含量，求出所述中药成分A实际的含量。
5、一种用权利要求1或2或3或4所述中药多指标成分指纹图谱的构建方法得到的多指标成分指纹图谱。
6、权利要求5所述的多指标成分中药指纹图谱在中药质量评价中的应用。
7、权利要求5所述的多指标成分中药指纹图谱在中药质量控制中的应用。
8、权利要求5所述的多指标成分中药指纹图谱在中药新药开发中的应用。
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