CN1844912A - 一种地龙指纹图谱的建立方法和地龙药材的鉴别方法 - Google Patents
一种地龙指纹图谱的建立方法和地龙药材的鉴别方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种中药地龙HPLC指纹图谱建立的方法及其标准指纹图谱。首先制备地龙药材溶液，取地龙适量，精密称重，以0.9％生理盐水作为溶剂室温浸泡16小时，离心，取上清液用微孔滤膜(0.45um)过滤，作为地龙标药材溶液；其次制备参照物溶液，取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、稀释，制成参照物溶液；最后，进行测定，分别精密吸取地龙标准品溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录50分钟色谱，其中高效液相色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液和50％甲醇的梯度洗脱液，检测波长为254nm。将待测地龙样品指纹图谱与标准指纹图谱对比，比较其异同。本发明的优点是方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握。
Description
技术领域
本发明涉及一种地龙指纹图谱的建立方法和地龙药材的鉴别方法，具体来说，是采用高效液相色谱法(HPLC)来建立地龙药材指纹图谱以及用指纹图谱来鉴别地龙药材。
背景技术
地龙作为传统中药，具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效，为中国药典所收载。中国药典收载的地龙药材品种有四种，其中作为药用主要品种为钜引科动物参环毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))，习称广地龙。地龙的主药成分为蛋白质、氨基酸、核酸、酶、糖类等。对地龙中蛋白质、氨基酸等成分的定性、定量研究已有报道。其中小分子成分主要为次黄嘌呤及含氮化合物。
地龙药材成分复杂，如果单用其中个别活性成分来说明地龙药材内在质量，具有一定的片面性。要控制地龙药材质量，最好采用它的物质群整体予以控制。中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，对于有效控制中药材或中成药的质量，具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA.Guidance of Industry：Botanical Drug(Draft).2000 August)。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已经成为国际共识。
发明内容
截至目前，关于地龙指纹图谱的建立方法却未见报道。为此，发明人对地龙指纹图谱的建立方法进行了研究，对地龙10批药材进行了测定，建立起地龙指纹图谱测定方法。
本发明的目的是通过对地龙水溶性提取物HPLC指纹图谱的研究，摸索出一种地龙药材质量控制的方法，确立建立地龙的标准指纹图谱的方法，借此可将地龙指纹谱作为质量控制及真伪鉴别的指标之一。本发明还同时提供了地龙的标准指纹图谱。
本发明通过下列步骤实施：
一种地龙指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
(1)地龙药材溶液的制备：取地龙药材适量，精密称重，以氯化钠溶液作为溶剂，优选用生理盐水，进行提取，提取液经微孔滤膜过滤，作为地龙药材溶液；
(2)参照物溶液的制备：取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、稀释，制成参照物溶液；
(3)测定：分别精密吸取地龙药材溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定地龙指纹图谱，其中高效液相色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸盐-水-甲醇梯度洗脱液，检测波长为220nm～300nm，其中，磷酸盐优选用磷酸二氢钾。
其中，所述的地龙药材，可以为粗粉或地龙段，例如能全部通过筛孔内径为2000±70um或10目筛、但混有能通过筛孔内径为355±13um或50目筛不超过20％的最粗粉，或者长度为1cm的地龙段，其中优选使用1cm地龙段。
其中，所述的提取可以为冷浸提取或常温(室温)浸泡提取，其中优选使用常温(室温)浸泡提取。提取时间可以为12～36小时，优选为室温浸泡提取16小时。
其中，流动相为磷酸盐-水-甲醇不同比例溶液，优选用磷酸二氢钾水溶液和甲醇水溶液按梯度配比作为流动相。
其中，检测波长可以选用230nm、254nm、294nm三中波长，其中优选使用254nm。
其中，建立地龙标准指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)地龙药材溶液的制备：取地龙最粗粉或地龙段适量，精密称重，以0.9％生理盐水作为溶剂室温浸泡16小时，离心，取上清液用微孔滤膜(0.45um)过滤，作为地龙药材溶液；
(2)参照物溶液的制备：取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、稀释，制成参照物溶液；
(3)测定：分别精密吸取地龙药材溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录50分钟色谱，其中高效液相色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(A)和50％甲醇(B)的梯度洗脱液，检测波长为254±1nm。
其中，所述的流动相梯度为：按体积比计算，A：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，B：50％甲醇
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 10 | 99 | 1 |
| 50 | 0 | 100 |
其中，柱温为室温；流速为0.8～1ml/min，优选为0.8ml/min，理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于9000。
其中，上述所述的地龙标准指纹图谱建立方法，得到的地龙标准指纹图谱中，共有特征指纹峰有9个，其峰面积总和占总峰面积的90％以上。非共有峰的峰面积占总峰面积小于10％。
以次黄嘌呤的色谱峰(标号为S)的相对保留时间和相对峰面积为1，所得到的地龙标准指纹图谱中共有特征指纹峰为：
3号峰：相对保留时间0.528～0.557，相对峰面积0.089～0.657；
4号峰：相对保留时间0.596～0.639，相对峰面积0.023～0.126；
5号峰：相对保留时间0.779～0.799，相对峰面积0.017～0.188；
S号峰(参照峰)：相对保留时间1，相对峰面积1；
6号峰：相对保留时间1.198～1.209，相对峰面积0.062～0.514；
7号峰：相对保留时间1.332～1.433，相对峰面积0.097～0.445；
9号峰：相对保留时间1.609～1.790，相对峰面积0.040～2.927；
10号峰：相对保留时间1.678～1.835，相对峰面积0.049～1.281；
12号峰：相对保留时间2.054～2.263，相对峰面积0.024～0.367。
优选，以次黄嘌呤的色谱峰(标号为S)的相对保留时间和相对峰面积为1，所得到的地龙标准指纹图谱中共有特征指纹峰为：
3号峰：相对保留时间0.543，相对峰面积0.284；
4号峰：相对保留时间0.618，相对峰面积0.070；
5号峰：相对保留时间0.792，相对峰面积0.067；
S号峰(参照峰)：相对保留时间1，相对峰面积1；
6号峰：相对保留时间1.204，相对峰面积0.198；
7号峰：相对保留时间1.386，相对峰面积0.243；
9号峰：相对保留时间1.700，相对峰面积1.066～1.560；
10号峰：相对保留时间1.753，相对峰面积0.468；
12号峰：相对保留时间2.164，相对峰面积0.137。
其中，3号峰非常稳定，峰形良好；4、5号峰比较稳定，但峰值较小；6号峰基本稳定，峰形良好，有时峰值小；S号峰非常稳定，峰形极好；7号峰在理论板数9500以下时有一肩峰；9号峰非常稳定，峰形极好；10号峰为一未分开峰，积分面积合并计算；12号峰较稳定，有时峰值小。
作为本发明的另一目的，本发明还提供了一种地龙药材的鉴别方法，包括如下步骤：
(1)测定待测地龙样品的指纹图谱；
(2)将待测地龙样品的指纹图谱与地龙标准指纹图谱对比，筛选符合地龙标准指纹图谱的地龙药材；
其中，步骤(1)是按照上述所述的地龙标准指纹图谱建立方法进行测定，步骤(2)的地龙标准指纹图谱即为上述所述的地龙标准指纹图谱。
本发明的优点主要有：
(1)以地龙水溶性提取物、优选地龙生理盐水提取物建立起来的HPLC指纹图谱，代表着地龙大部分药理活性，能有效地表征地龙药材的质量。地龙的主要活性成分为氨基酸、多肽、多糖、次黄嘌呤、蚓激酶等水溶性成分，故用地龙的水提取物成分作为监控指标就更具有代表性。
(2)以地龙整个指纹图形作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定地龙整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价地龙的质量提供了新的对照标准，将为提高地龙及其成方制剂的质量及疗效做出贡献。
(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。而本发明只需用水常温提取，样品处理大为简便，节约了检验的成本和时间。
附图说明
图1：参照物次黄嘌呤HPLC图谱
图2：地龙标准(对照)指纹图谱(0～50分钟)
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。
实施例1：地龙标准指纹图谱的建立方法
1、仪器与试剂
试验中先后在惠普高效液相色谱仪及色谱工作站HP1100、岛津高效液相色谱仪LC2010A进行测试。
甲醇为色谱纯，水为蒸馏水，磷酸二氢钾为分析纯。
次黄嘌呤对照品为上海生化厂进口分装品，经HPLC归一化法测得纯度为99.6％。
地龙药材标准品为广西玉林所产，经黑龙江省药品检验所鉴定为钜引科动物参环毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))，分别编号为11～20。
2、色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：A：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，B：50％甲醇，梯度为：
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 10 | 99 | 1 |
| 50 | 0 | 100 |
检测波长为254nm，柱温为室温；流速为0.8ml/min，理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于9000。
3、指纹图谱测定
(1)地龙指纹图谱制备
参照物溶液的制备：取次黄嘌呤对照品适量10mg，精密称重，置100ml瓶中，加0.01mol/L磷酸二氢钾溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成参照物溶液；
地龙对照药材溶液的制备：取地龙1cm段1g，，精密称重，置离心管中，加0.9％生理盐水10ml，室温放置16小时，离心，取上清液用微孔滤膜(0.45um)过滤，作为地龙对照药材溶液；
分别精密吸取参照物溶液10ul与地龙标准品溶液6ul，注入液相色谱仪，记录50分钟色谱。以次黄嘌呤色谱峰(S峰)的保留时间和峰面积为1，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积比值。
参照物次黄嘌呤HPLC图谱和地龙标准指纹图谱(0～50分钟)，分别见图1和2。
(2)共有峰的确定
根据10批地龙药材指纹图谱给出的相关参数，地龙药材的色谱峰的50分钟内全部出现。比较各批药材的色谱峰，确定了9个共有特征指纹峰，其峰面积总和占总峰面积的90％以上。
以次黄嘌呤的色谱峰(标号为S)的相对保留时间和相对峰面积为1，所得到的地龙标准指纹图谱中共有特征指纹峰的保留时间和峰面积见表1和2。
实施例2：指纹图谱的稳定性试验
按照指纹图谱稳定性测定方法操作，以编号为12的地龙药材为供试品，考察16小时溶液稳定，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积有规定的峰面积进行统计，RSD不超过3％。供试品常温16小时内稳定，符合指纹图谱的技术要求(见表3和4)。
实施例3：指纹图谱的精密度试验
按照指纹图谱精密度规定方法操作，以编号为12的地龙药材为供试品，取1份，连续进样5次，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积有规定的峰面积进行统计，RSD不超过3％，仪器等整个检测系统的精密度良好，基本符合指纹图谱的技术要求(见表5和6)。
实施例4：指纹图谱的重现性试验
按照指纹图谱重现性规定方法操作，以编号为12的地龙药材为供试品，取5份，分别检测指纹图谱，对共有峰的相对保留时间及相对峰面积有规定的峰面积进行统计，RSD不超过3％，符合指纹图谱的技术要求(见表7和8)。
实施例5：以地龙标准指纹图谱鉴别地龙药材
市售药材(购自市药材公司)的指纹图谱的测定方法，同地龙标准指纹图谱的建立方法，记录50分钟色谱。以次黄嘌呤的色谱峰(标号为S)的相对保留时间和相对峰面积为1，以实施例1的地龙标准指纹图谱作为鉴别基础，比较样品的指纹图谱与地龙标准指纹图谱的差异，鉴别两者是否一致。
表1 地龙药材共有峰保留时间和相对保留时间
表2 地龙药材共有峰及非共有峰面积的比值(1)
表2 地龙药材共有峰及非共有峰面积的比值(2)
*非共有峰面积百分比
表3 地龙药材稳定性试验结果(示保留时间和相对保留时间)
表4 地龙药材稳定性试验结果(示峰面积和峰面积比值)
表5 地龙药材精密度试验结果(示保留时间和相对保留时间)
表6 地龙药材精密度试验结果(示峰面积和峰面积比值)
表7 地龙药材重现性试验结果(示保留时间和相对保留时间)
表8 地龙药材重现性试验结果(示峰面积和峰面积比值)
图2中各特征指纹峰相对保留时间和峰面积相对比值：
相对保留时间
3号峰： 0.543 4号峰：0.618 5号峰：0.792 S号峰： 1.000
6号峰： 1.204 7号峰：1.386 9号峰：1.700 10号峰：1.753
12号峰：2.164
特征指纹峰峰面积相对比值
3号峰： 0.284 4号峰：0.070 5号峰：0.067 S号峰： 1.000
6号峰： 0.198 7号峰：0.243 9号峰：1.333±20％ 10号峰：0.468
12号峰：0.137。
Claims (9)
1、一种地龙指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
(1)地龙药材溶液的制备：取地龙药材适量，精密称重，以氯化钠溶液作为溶剂进行提取，提取液经微孔滤膜过滤，作为地龙药材溶液；
(2)参照物溶液的制备：取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、稀释，制成参照物溶液；
(3)测定：分别精密吸取地龙药材溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定地龙指纹图谱，其中高效液相色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸盐-水-甲醇梯度洗脱液，检测波长为220nm～300nm。
2、根据权利要求1所述的方法，其中所述的氯化钠溶液为生理盐水。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的磷酸盐为磷酸二氢钾。
4、一种地龙标准(或对照)指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
(1)地龙药材溶液的制备：取地龙最粗粉或地龙段适量，精密称重，以0.9％生理盐水作为溶剂室温浸泡16小时，离心，取上清液用微孔滤膜(0.45um)过滤，作为地龙药材溶液；
(2)参照物溶液的制备：取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、稀释，制成参照物溶液；
(3)测定：分别精密吸取地龙药材溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录50分钟色谱，其中高效液相色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液和50％甲醇的梯度洗脱液，检测波长为254±1nm。
5、根据权利要求4所述的方法，其中所述的流动相梯度为：按体积比计算，0分钟时100％的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，5分钟时100％的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，10分钟时99％的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液和1％的50％甲醇，50分钟时100％的50％甲醇。
6、根据权利要求4-5所述的方法，其中所述地龙标准指纹图谱中，共有特征指纹峰有9个，其峰面积总和占总峰面积的90％以上。
7、根据权利要求4-6所述的方法，其中所述地龙标准指纹图谱中，以次黄嘌呤的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰选自：
3号峰：相对保留时间0.528～0.557，相对峰面积0.089～0.657；
4号峰：相对保留时间0.596～0.639，相对峰面积0.023～0.126；
5号峰：相对保留时间0.779～0.799，相对峰面积0.017～0.188；
S号峰(参照峰)：相对保留时间1，相对峰面积1；
6号峰：相对保留时间1.198～1.209，相对峰面积0.062～0.514；
7号峰：相对保留时间1.332～1.433，相对峰面积0.097～0.445；
9号峰：相对保留时间1.609～1.790，相对峰面积0.040～2.927；
10号峰：相对保留时间1.678～1.835，相对峰面积0.049～1.281；
12号峰：相对保留时间2.054～2.263，相对峰面积0.024～0.367。
8、根据权利要求4-7所述的方法，其中所述地龙标准指纹图谱中，以次黄嘌呤的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰选自：
3号峰：相对保留时间0.543，相对峰面积0.284；
4号峰：相对保留时间0.618，相对峰面积0.070；
5号峰：相对保留时间0.792，相对峰面积0.067；
S号峰(参照峰)：相对保留时间1，相对峰面积1；
6号峰：相对保留时间1.204，相对峰面积0.198；
7号峰：相对保留时间1.386，相对峰面积0.243；
9号峰：相对保留时间1.700，相对峰面积1.066～1.560；
10号峰：相对保留时间1.753，相对峰面积0.468；
12号峰：相对保留时间2.164，相对峰面积0.137。
9、一种地龙药材的鉴别方法，包括如下步骤：
(1)测定待测地龙样品的指纹图谱；
(2)将待测地龙样品的指纹图谱与地龙标准指纹图谱对比，筛选符合地龙标准指纹图谱的地龙药材；
其中，步骤(1)是按照权利要求4或5所述的方法测定，步骤(2)的地龙标准指纹图谱为权利要求6-8中所述的地龙标准指纹图谱。
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