CN1900710A - 灵芝孢子、灵芝孢子油指纹图谱的建立及标准指纹图谱 - Google Patents
灵芝孢子、灵芝孢子油指纹图谱的建立及标准指纹图谱 Download PDFInfo
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Abstract
灵芝孢子、灵芝孢子油指纹图谱的建立方法及标准指纹图谱。涉及中药材及其制品的质量控制方法。通过对10批灵芝孢子、灵芝孢子油的高效液相色谱HPLC指纹图谱进行比较，确定了其共有指纹特征，得到标准指纹图谱。指纹图谱中，共有峰有15个，其中超过总峰面积5％的指纹峰有4个。本方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油的品种和质量情况，为灵芝孢子、灵芝孢子油质量控制和真伪鉴别提供了一种全新的方法。
Description
技术领域
本发明涉及中药及其制品的质量控制方法，具体涉及灵芝孢子、灵芝孢子油高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的构建方法和得到的标准指纹图谱。
背景技术
灵芝是担子菌纲多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganoderma)真菌赤芝G.lucidum.karst和紫芝G.japonicumLloyd的总称，具有扶正固本等功效，被《本经》称为上品。灵芝孢子(Ganoderma lucidiumspore)是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的孢子，为灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质，其药用价值也正日益受到重视。灵芝孢子的药理作用主要有抗肿瘤、免疫调节、调节血脂以及对神经、心血管和呼吸系统有调节改善作用。灵芝孢子的化学成分复杂，有以下几类：脂肪酸类、甾醇类、三萜类、生物碱类、内酯、蛋白质和氨基酸类、糖肽类、维生素类、胡萝卜素、和无机离子类等。现代药理研究表明灵芝孢子油是灵芝孢子抗肿瘤的的主力。本研究组通过对灵芝孢子油研究和测试分析表明，灵芝孢子油主为灵芝孢子油酯类、脂肪酸类和麦角甾醇类成分组成。有关灵芝孢子与其脂溶性提取物灵芝孢子油的质量研究报导不多，特别是能从色谱的整体特征面貌上把握灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油的品种和质量情况未见报导。
为了有效地控制灵芝孢子、灵芝孢子油质量，有必要对灵芝孢子、灵芝孢子油的指纹图谱建立的方法进行了研究，并制定了其标准指纹图谱。
发明内容
本发明的目的是为灵芝孢子、灵芝孢子油质量控制和真伪鉴别提供了一种全新的方法。通过建立一种灵芝孢子及灵芝孢子油指纹图谱的方法，以及由此方法所得到的灵芝孢子及灵芝孢子油标准指纹图谱。
本发明的技术方案是：灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油指纹图谱的建立方法包括下列步骤：
供试品溶液的制备：A、灵芝孢子供试品溶液的制备：取灵芝孢子适量，加流动相，精密称重，浸泡，超声处理，取出，放冷，称定重量，加流动相补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液；或B、灵芝孢子油供试品溶液的制备：取灵芝孢子油适量，精密称定，加流动相溶解并定容，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
参照物溶液的制备：取甘油三油酸酯对照品适量，用流动相稀释，制成参照物溶液，理论塔板数以甘油三油酸酯峰计算并作为参照物；
色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈-异丙醇，体积配比为53∶47；蒸发光散射检测器检测；
测定：精密吸取各供试品溶液及参照物溶液，分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，并以面积归一化法计算各峰的相对峰面积，得到灵芝孢子、灵芝孢子油指纹图谱；
所述灵芝孢子、灵芝孢子油指纹图谱中，共有峰有15个，其中超过总峰面积5％的指纹峰有4个，以甘油三油酸酯的色谱峰的相对保留时间为1计算其它色谱峰的相对保留时间并计算相对峰面积，上述4个指纹峰分别是9号峰平均相对保留时间RT为0.778，相对峰面积范围为9.54～15.36％；10号峰的平均RT为0.832，相对峰面积范围为5.76～9.43％；11号峰甘油三油酸酯即参照峰的RT为1.000，相对峰面积范围为22.29～27.80％；12号峰的平均RT为1.075，相对峰面积范围为26.82～37.76％。
在制备供试品溶液A具体操作时可采用：加流动相的量不少于5倍灵芝孢子重量，浸泡2小时，超声处理时间不少于10min；在制备供试品溶液B具体操作时可采用，加流动相的加入量不少于10倍灵芝孢子油重量；流动相为乙腈-异丙醇组成的混合溶剂；参照物浓度为每1ml含0.01～0.5mg。
按照本发明所提供的方法，所得到的灵芝孢子、灵芝孢子油指纹图谱，可通过对10批灵芝孢子、灵芝孢子油HPLC色谱图进行比较，确定其共有特征峰，得到了由其共有特征峰构成的灵芝孢子、灵芝孢子油HPLC标准指纹图谱。该标准指纹图谱有15个特征峰，各峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于2％。其中1号峰的平均RT为0.133，RSD为0.31％，相对峰面积范围为0.10～2.40％；2号峰的平均RT为0.152，RSD为0.32％，相对峰面积范围为0.31～17.51％；3号峰的平均RT为0.239，RSD为1.18％，相对峰面积范围为0.14～1.20％；4号峰的平均RT为0.285，RSD为0.11％，相对峰面积范围为0.10～2.16％；5号峰的平均RT为0.296，RSD为0.71％，相对峰面积范围为0.19～2.05％；6号峰的平均RT为0.479，RSD为0.12％，相对峰面积范围为0.47～3.56％；7号峰的平均RT为0.608，RSD为0.11％，相对峰面积范围为1.70～4.06％；8号峰的平均RT为0.648，RSD为0.11％，相对峰面积范围为0.34～1.80％；9号峰的平均RT为0.778，RSD为0.12％，相对峰面积范围为9.54～15.36％；10号峰的平均RT为0.832，RSD为0.10％，相对峰面积范围为5.76～9.43％；11号峰甘油三油酸酯即参照峰的RT为1.000，相对峰面积范围为22.29～27.80％；12号峰的平均RT为1.075，RSD为0.10％，相对峰面积范围为26.82～37.76％；13号峰的平均RT为1.158，RSD为0.21％，相对峰面积范围为1.31～2.03％；14号峰的平均RT为1.370，RSD为0.13％，相对峰面积范围为1.22～1.72％；15号峰的平均RT为1.479，RSD为0.15％，相对峰面积范围为0.54～1.03％。
本发明的原理是根据灵芝孢子脂溶性溶性成分为其主要抗癌活性成分，建立起灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油HPLC指纹图谱，从色谱的整体面貌特征上把握灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油的品种和质量情况。
本发明的优点如下：
(1)以灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油建立起来的HPLC指纹图谱，代表着灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油大部分药理活性，能有效地表征灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油的质量。对灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油的全部化学成分进行检测，既不可能也没有必要。大量的药理和临床研究结果表明灵芝孢子脂溶性成分为灵芝孢子的主要有效成分，故用灵芝孢子脂溶性成分作为监控指标具有代表性。
(2)以灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油整个指纹图形作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油的质量提供了新的对照标准，将为提高灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油制剂的质量及疗效做出贡献。
(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。能从色谱的整体特征面貌上把握灵芝孢子及其脂溶性提取物灵芝孢子油的品种和质量情况，为灵芝孢子、灵芝孢子油质量控制和真伪鉴别提供了一种全新的方法。
附图说明
图1.甘油三油酸酯对照品制成的参照物溶液图谱。
图2.10批灵芝孢子0-60分钟的指纹图谱。
图3.10批灵芝孢子油0-60分钟的指纹图谱。
图4.灵芝孢子0-60分钟的指纹图谱。
图5.灵芝孢子油0-60分钟的指纹图谱。
图6.灵芝孢子、灵芝孢子油0-60分钟的标准指纹图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
实施例1、灵芝孢子HPLC标准指纹图谱的建立方法
1.仪器与试药
惠普1100高效液相色谱仪；蒸发光散射检测器；美国奥泰色谱之星工作站。甘油三油酸酯对照品，纯度大于99％；乙腈，色谱纯；异丙醇，色谱纯；灵芝孢子，批号：01、02、03、04，广东产；灵芝孢子，批号：05、06、07，山东产；灵芝孢子，批号：08、09、10，安徽产；灵芝孢子油，广州汉方现代中药研究开发有限公司提供。
2.色谱条件
色谱柱：kromasil C18柱(4.6×250mm，5μm)，美国Alltech公司；流动相：乙腈-异丙醇(53∶47)；蒸发光散射检测器检测；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；理论塔板数以甘油三油酸酯峰计算，应不低于3000。
3.指纹图谱测定
3.1灵芝孢子指纹图谱制备
参照物溶液的制备：选用甘油三油酸酯为参照物，取甘油三油酸酯对照品适量，用流动相稀释，制成每1ml中含甘油三油酸酯0.15mg的溶液，作为参照物溶液。
灵芝孢子供试品溶液制备：取灵芝孢子0.4g，加流动相：乙腈-异丙醇(53∶47)50ml，精密称重，浸泡2小时，超声处理(功率300W，频率50kHz)50分钟，取出，放冷，称定重量，加流动相补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
分别取参照物溶液及灵芝孢子药材供试品溶液各10μl进样，照高效液相色谱法测定，记录60分钟的色谱图，见附图2。以甘油三油酸酯的色谱峰(S峰)的相对保留时间和相对峰面积为1计算其它色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。
3.2共有峰确定
通过10批灵芝孢子指纹图谱测定，比较其色谱图，确定共有峰为15个，其中超过总峰面积5％的指纹峰为9号峰(平均相对保留时间RT为0.778)，10号峰(平均RT为0.832)，11号峰(甘油三油酸酯即参照峰的RT为1.000)，12号峰(平均RT为1.075)。10批灵芝孢子共有峰相对峰面积及相对保留时间统计结果见表1、表2、表3。
表1 10批灵芝孢子药材相对保留时间统计
| 峰号 | 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 样5 | 样6 | 样7 | 样8 | 样9 | 样10 | 均值 | RSD％ |
| 123456789101112131415 | 0.1340.1520.2430.2850.2940.4790.6070.6470.7780.8341.0001.0761.1581.3711.479 | 0.1330.1520.2420.2850.2940.4790.6080.6480.7780.8311.0001.0731.1581.3681.479 | 0.1330.1520.2420.2850.2940.4790.6070.6470.7770.8311.0001.0751.1551.3691.479 | 0.1330.1520.2360.2850.2940.4780.6090.6470.7780.8331.0001.0751.1591.3721.481 | 0.1330.1520.2420.2850.2950.4800.6080.6490.7790.8331.0001.0771.1621.3721.483 | 0.1330.1520.2360.2850.2990.4800.6080.6490.7780.8331.0001.0761.1571.3711.478 | 0.1330.1510.2360.2850.2980.4790.6070.6480.7770.8321.0001.0751.1591.3691.480 | 0.1330.1510.2410.2850.2940.4790.6070.6460.7780.8311.0001.0761.1581.3691.479 | 0.1320.1510.2360.2850.2980.4800.6070.6470.7770.8321.0001.0741.1561.3721.479 | 0.1330.1510.2400.2840.2950.4790.6080.6480.7770.8331.0001.0751.1601.3681.476 | 0.1330.1520.2390.2850.2960.4790.6080.6480.7780.8321.0001.0751.1581.3701.479 | 0.310.321.180.110.710.120.110.120.110.100.000.100.210.130.15 |
表2 10批灵芝孢子药材样品的相对峰面积值(％)
| 峰号 | 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 样5 | 样6 | 样7 | 样8 | 样9 | 样10 |
| 123456789101112131415 | 0.130.380.140.100.370.683.130.5915.369.4225.6637.042.011.310.78 | 0.120.390.160.150.380.593.050.5815.019.4325.9637.761.941.721.03 | 0.150.340.150.210.220.662.990.6415.179.3125.9237.672.031.630.94 | 0.100.310.160.180.190.693.100.7015.349.3525.5737.261.951.420.90 | 0.351.290.320.340.860.783.080.5815.418.2127.8035.321.591.610.86 | 0.797.650.620.680.522.964.061.5410.296.7725.2932.771.761.220.64 | 2.4017.511.202.162.050.472.310.4712.046.1022.2926.821.311.220.54 | 0.667.100.550.811.760.401.700.3410.655.7627.7736.681.941.420.72 | 0.756.820.731.511.943.564.031.809.546.4723.9331.931.871.390.58 | 0.573.190.350.721.050.713.140.6315.068.0626.6434.161.741.610.67 |
表3灵芝孢子药材样品的特征峰相对保留时间及相对峰面积范围
| 特征峰 | 相对保留时间 | 相对峰面积范围(％) |
| 峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10峰11峰12峰13峰14峰15 | 0.1330.1520.2390.2850.2960.4790.6080.6480.7780.8321.0001.0751.1581.3701.479 | 0.10～2.400.31～17.510.14～1.200.10～2.160.19～2.050.40～3.561.70～4.060.34～1.809.54～15.365.76～9.4322.29～27.8026.82～37.761.31～2.031.22～1.720.54～1.03 |
3.3指纹图谱重现性试验
以灵芝孢子药材01批为供试品(N＝5)，按照指纹图谱重现性规定方法操作，分别对共有峰相对保留时间及共有峰的相对峰面积(所有峰占总峰面积百分比％)进行统计，RSD％不超过3％。结果见表4
表4重现性实验结果 (n＝5)
| 特征峰 | 相对保留时间(x) | RSD(％) | 相对峰面积 | RSD(％) |
| 峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10峰11峰12峰13峰14峰15 | 0.1330.1520.2390.2850.2960.4790.6080.6480.7780.8321.0001.0751.1581.3701.479 | 0.110.140.230.310.170.080.110.150.100.230.070.090.320.740.45 | 0.140.380.140.120.370.683.130.5915.369.4325.6637.042.011.310.78 | 1.782.170.951.241.752.120.670.350.180.390.250.781.261.791.57 |
3.4指纹图谱精密度试验
按照指纹图谱精密度规定方法操作，以灵芝孢子药材01批为供试品，取1份，连续进样5次，分别对共有峰相对保留时间及共有峰的相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。
3.5指纹图谱稳定性试验
按照指纹图谱稳定性测定方法操作，以灵芝孢子01批为供试品，考察24小时溶液稳定，分别对共有峰相对保留时间及共有峰的相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。供试品24小时稳定。
以上试验显示，该测定方法稳定可靠，指纹图谱相对稳定。
实施例2、灵芝孢子油HPLC标准指纹图谱的建立方法
方法与灵芝孢子HPLC标准指纹图谱的建立方法相同，所不同的是：
灵芝孢子油供试品溶液制备：取灵芝孢子油120mg，精密称重，加流动相：乙腈-异丙醇(53∶47)溶解并定容至50ml，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液
分别取参照物溶液及灵芝孢子油供试品溶液各10μl进样，照高效液相色谱法测定，记录60分钟的色谱图，见附图3。以甘油三油酸酯的色谱峰(S峰)的相对保留时间为1计算其它色谱峰的相对保留时间并计算相对峰面积。
通过10批灵芝孢子油指纹图谱测定，比较其色谱图，确定共有峰。10批油共有峰相对峰面积及相对保留时间统计结果见表5、表6、表7。
表5 10批灵芝孢子油相对保留时间统计
| 峰号 | 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 样5 | 样6 | 样7 | 样8 | 样9 | 样10 | 均值 | RSD％ |
| 123456789101112131415 | 0.1350.1520.2430.2840.2980.4790.6040.6450.7740.8311.0001.0761.1641.3711.486 | 0.1340.1520.2350.2850.2940.4790.6080.6480.7780.8321.0001.0731.1581.3681.479 | 0.1330.1520.2410.2850.2940.4790.6070.6470.7770.8311.0001.0751.1551.3691.482 | 0.1330.1520.2360.2860.2940.4780.6090.6470.7760.8341.0001.0751.1591.3721.481 | 0.1330.1520.2420.2850.2950.4800.6080.6490.7790.8331.0001.0771.1621.3721.483 | 0.1330.1520.2360.2850.2990.4800.6080.6490.7780.8331.0001.0781.1601.3741.478 | 0.1320.1510.2360.2840.2950.4790.6060.6480.7730.8321.0001.0751.1591.3691.480 | 0.1330.1510.2410.2850.2940.4790.6070.6480.7780.8311.0001.0761.1581.3761.479 | 0.1320.1510.2360.2850.2980.4800.6070.6470.7770.8321.0001.0741.1561.3721.479 | 0.1320.1510.2400.2840.2950.4790.6080.6480.7770.8331.0001.0751.1601.3681.476 | 0.1330.1520.2380.2850.2960.4790.6070.6480.7770.8321.0001.0751.1591.3711.480 | 0.350.161.280.130.720.120.210.120.410.130.000.110.240.230.35 |
表6 10批灵芝孢子油样品的相对峰面积值(％)
| 峰号 | 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 样5 | 样6 | 样7 | 样8 | 样9 | 样10 |
| 123456789101112131415 | 0.130.320.520.120.220.633.150.6515.389.4125.6237.231.651.330.75 | 0.130.390.170.510.340.583.070.8215.019.4328.0337.561.971.521.13 | 0.160.430.150.270.220.632.940.6413.407.1525.9237.682.011.610.53 | 0.110.310.160.190.210.652.100.7015.349.3730.0637.261.961.420.91 | 0.351.290.320.380.870.782.080.5815.418.2127.8239.091.411.100.44 | 0.797.650.660.740.532.964.061.5311.076.7725.3332.771.761.220.64 | 1.229.231.202.142.040.472.310.4412.066.1022.5526.821.801.220.54 | 0.667.100.530.811.770.493.580.3710.686.9627.9739.821.931.430.76 | 0.746.520.771.551.933.544.011.829.886.4724.9331.931.861.450.55 | 0.571.190.530.731.060.792.180.6115.328.0526.6734.161.711.610.69 |
表7灵芝孢子油样品的特征峰相对保留时间及相对峰面积范围
| 特征峰 | 相对保留时间 | 相对峰面积范围(％) |
| 峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10峰11峰12峰13峰14峰15 | 0.1330.1520.2380.2850.2960.4790.6070.6480.7770.8321.0001.0751.1591.3711.480 | 0.11～1.220.32～9..230.15～1.200.12～2.140.22～2.040.47～3.542.10～4.010.37～1.829.88～15.386.10～9.4322.55～30.0626.82～39.821.41～1.971.10～1.610.44～1.13 |
灵芝孢子油的指纹图与灵芝孢子指纹图共有峰相对保留时间及规定的共有峰的相对峰面积基本相同。
实施例3、
取安徽某产地的灵芝孢子，按实施例1灵芝孢子HPLC标准指纹图谱的建立方法中的条件和方法，取灵芝孢子0.4g，加流动相：乙腈-异丙醇(53∶47)50ml，精密称重，浸泡2小时，超声处理(功率300W，频率50kHz)50分钟，取出，放冷，称定重量，加流动相补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液；分别取参照物溶液及上述供试品溶液各10μl进样，照高效液相色谱法测定，记录60分钟的色谱图，得指纹色谱图，见图4。以甘油三油酸酯的色谱峰(S峰)的相对保留时间为1计算其它色谱峰的相对保留时间并计算相对峰面积，其4个主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积分别为：9号峰RT为0.778，相对峰面积15.79％，10号峰RT为0.834，相对峰面积9.47％；11号峰(甘油三油酸酯)RT为1.000，相对峰面积25.87％；12号峰RT为1.076，相对峰面积37.14％。
实施例4、
精密称取广州汉方现代中药研究开发有限公司灵芝孢子油(批号050412)118.56mg，按实施例2灵芝孢子油HPLC标准指纹图谱的建立方法中的条件和方法，加流动相：乙腈-异丙醇(53∶47)溶解并定容至50ml，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液；分别取参照物溶液及上述供试品溶液各10μl进样，照高效液相色谱法测定，记录60分钟的色谱图，得指纹色谱图，见图5。以甘油三油酸酯的色谱峰(S峰)的相对保留时间为1计算其它色谱峰的相对保留时间并计算相对峰面积，其4个主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积分别为：9号峰RT为0.776，相对峰面积15.38％；10号峰RT为0.832，相对峰面积9.37％；11号峰(甘油三油酸酯)RT为1.000，相对峰面积27.38％；12号峰RT为1.077，相对峰面积39.82％。
Claims (4)
1.一种灵芝孢子与灵芝孢子油指纹图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤：
供试品溶液的制备：A、灵芝孢子供试品溶液的制备：取灵芝孢子适量，加流动相，精密称重，浸泡，超声处理，取出，放冷，称定重量，加流动相补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液；或B、灵芝孢子油供试品溶液的制备：取灵芝孢子油适量，精密称定，加流动相溶解并定容，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
参照物溶液的制备：取甘油三油酸酯对照品适量，用流动相稀释，制成参照物溶液，理论塔板数以甘油三油酸酯峰计算并作为参照物；
色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈-异丙醇，体积配比为53∶47；蒸发光散射检测器检测；
测定：精密吸取各供试品溶液及参照物溶液，分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，并以面积归一化法计算各峰的相对峰面积，得到灵芝孢子、灵芝孢子油指纹图谱；
所述灵芝孢子、灵芝孢子油指纹图谱中，共有峰有15个，其中超过总峰面积5％的指纹峰有4个，以甘油三油酸酯的色谱峰的相对保留时间为1计算其它色谱峰的相对保留时间并计算相对峰面积，上述4个指纹峰分别是9号峰平均相对保留时间RT为0.778，相对峰面积范围为9.54～15.36％；10号峰的平均RT为0.832，相对峰面积范围为5.76～9.43％；11号峰甘油三油酸酯即参照峰的RT为1.000，相对峰面积范围为22.29～27.80％；12号峰的平均RT为1.075，相对峰面积范围为26.82～37.76％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在制备供试品溶液A时：加流动相的量不少于5倍灵芝孢子重量，浸泡2小时，超声处理时间不少于10min；在制备供试品溶液B时，加流动相的加入量不少于10倍灵芝孢子油重量；流动相为乙腈-异丙醇组成的混合溶剂；参照物浓度为每1ml含0.01～0.5mg。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所得到的灵芝孢子、灵芝孢子油指纹图谱是通过比较10批灵芝孢子、灵芝孢子油色谱图，由其共有特征峰构成的灵芝孢子、灵芝孢子油标准指纹图谱。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所构成的灵芝孢子、灵芝孢子油标准指纹图谱，15个共有峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于2％，1号峰的平均RT为0.133，RSD为0.31％，相对峰面积范围为0.10～2.40％；2号峰的平均RT为0.152，RSD为0.32％，相对峰面积范围为0.31～17.51％；3号峰的平均RT为0.239，RSD为1.18％，相对峰面积范围为0.14～1.20％；4号峰的平均RT为0.285，RSD为0.11％，相对峰面积范围为0.10～2.16％；5号峰的平均RT为0.296，RSD为0.71％，相对峰面积范围为0.19～2.05％；6号峰的平均RT为0.479，RSD为0.12％，相对峰面积范围为0.47～3.56％；7号峰的平均RT为0.608，RSD为0.11％，相对峰面积范围为1.70～4.06％；8号峰的平均RT为0.648，RSD为0.11％，相对峰面积范围为0.34～1.80％；9号峰的平均RT为0.778，RSD为0.12％，相对峰面积范围为9.54～15.36％；10号峰的平均RT为0.832，RSD为0.10％，相对峰面积范围为5.76～9.43％；11号峰甘油三油酸酯即参照峰的RT为1.000，相对峰面积范围为22.29～27.80％；12号峰的平均RT为1.075，RSD为0.10％，相对峰面积范围为26.82～37.76％；13号峰的平均RT为1.158，RSD为0.21％，相对峰面积范围为1.31～2.03％；14号峰的平均RT为1.370，RSD为0.13％，相对峰面积范围为1.22～1.72％；15号峰的平均RT为1.479，RSD为0.15％，相对峰面积范围为0.54～1.03％。
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