CN1141575C - 一种丹参药材的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药丹参水溶性提取物HPLC指纹图谱建立的方法及其标准指纹图谱。首先制备供试品溶液，取丹参药材粉末(过30目筛)4.00g，加水50ml，精密称重，回流提取2小时，放冷至室温，补足失水，取2ml置25ml量瓶，甲醇定容至刻度，离心，取上清液作为供试品溶液。再配制对照品溶液，取丹参素钠、原儿茶醛对照品适量，用流动相稀释，制成每1ml中含丹参素钠20μg，原儿茶醛5.0μg，作为对照品溶液。测定法是分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μl、10μl，分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，计算，即得。建立丹参标准指纹图谱。将待测丹参样品指纹图谱与标准指纹图谱对比，比较其异同。本发明的优点是方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握丹参的品种和质量情况，可将其作为丹参质量控制及真伪鉴别的指标之一。
Description
技术领域
本发明涉及丹参药材的鉴别方法，具体地说是用高效液相色谱(HPLC)指纹图谱来鉴别丹参药材的方法。
背景技术
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。全国大部分地区均产。由于丹参因品种、产地、采收期不同而造成质量参差不齐，因而其制成品质量的稳定性也难以保证。目前，对丹参及其复方制剂的鉴定，往往是选取丹参的一、二个活性成分或指标成分进行含量测定，并以其含量多少来判定质量。例如，以丹参酮IIA含量(中国药典2000年版—部58页)或丹参素含量(张友芹等，中医药学报，2000，28(3)：68)等来鉴别丹参药材的质量；以丹参酮来判定丹参品种和产地情况(裘飞君，中国现代应用药学，1998，15(5)：16；胡世林等，中国中药杂志，1999，24(12)：721)；用丹参素含量(严常开等，中国医院药学杂志，2000，20(10)：600)、原儿茶醛含量(郑末晶等，中国药事，2000，14(4)：254)或丹参酮IIA含量(林伟忠等，中成药，2000，22(11)：766)等判别复方丹参制剂的质量，用丹参酮IIA含量鉴别不同厂家生产的复方丹参片的质量(邵水娟，中国药业，2000，9(7)：27)等。已知的丹参的化学成分有几十种，其脂溶性成分大多为醌型红黄色物质，如丹参酮I、IIA、IIB，丹参醌A、B、C，丹参酸钾脂，异丹参酮I、II，隐丹参酮等。其水溶性成分大多为酚性醛、酚性酸、二萜酸，如丁二酸、丹酚酸A、B、C，3，4-二羟基苯甲酸等。此外，还分离出β-谷甾醇、维生素E等(王伯祥主编，中医肝胆病学，第一版，中国医药科技出版社，1993年，96页)。如果用一、二种丹参的活性成分来说明丹参及其成方制剂的内在质量，具有一定的片面性，更不用说无药效的指标成分了。要控制丹参及其成方制剂的功效，就不能只针对其一、二个化学成分，必须对它的物质群整体予以控制。所以，除了“微观分析”外，还应用某种“宏观分析”方法，从整体上有效地表征中药质量。中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，对于有效控制中药材或中成药的质量，具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA.Guidance of Industry：Botanical Drug(Draft).2000August)。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已经成为国际共识。现在，对丹参中活性成分如丹参酮、丹参素等的测定方法较多，但对丹参指纹图谱的建立方法却未见报道。为解决丹参质量不稳的问题，本申请人对不同产地丹参进行了考察比较，于1997年在商洛建成天士力商洛丹参基地，并对基地实施GAP管理。为建立丹参药材质量的综合控制方法，特以国家药品监督局2000颁发的关于中药材指纹图谱技术要求，对天士力商洛丹参基地的丹参10批药材进行了测定，建立起丹参指纹图谱测定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用HPLC指纹图谱鉴别丹参药材的方法，并可将丹参指纹图谱作为丹参质量控制及真伪鉴别的指标之一。
本发明通过下列步骤实施：
第一步，先建立丹参的标准指纹图谱，方法如下，
(a)丹参药材标准品溶液的制备：30目筛的丹参药材粉末加水，精密称重；回流提取1～3小时，放冷至室温，补足失水；取提取液少量置量瓶中，甲醇定容至刻度，离心，取上清液作为丹参药材标准品溶液；
(b)参照物溶液的制备：取丹参素钠、原儿茶醛对照品适量，用流动相稀释，制成参照物溶液，理论塔板数以丹参素钠峰计算，以原儿茶醛为参照物；
(c)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为甲醇-水-冰醋酸，体积配比为8∶92∶1；检测波长254±1nm；
(d)测定：精密吸取丹参药材标准品溶液及参照物溶液，分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定丹参标准指纹图谱；
所述丹参标准指纹图谱中，共有峰有12个，其中超过总峰面积10％的指纹峰有4个，以原儿茶醛的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1计算其它指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，上述4个指纹峰分别是1号峰平均相对保留时间RT为0.186，相对峰面积为38.10％～52.17％；8号峰的平均RT为0.524，相对峰面积为38.07～47.96％，11号峰RT1.000，相对峰面积为1；12号峰的平均RT为2.576，相对峰面积为28.84％～44.10％；
第二步，以上述相同的方法测定待测丹参样品指纹图谱；
第三步，将待测丹参样品指纹图谱与丹参标准指纹图谱对比，筛选符合丹参标准指纹图谱的丹参药材。
上述步骤的第一步中，(a)丹参药材标准品溶液的具体制备过程优选为：取过30目筛丹参药材粉末4.00g，加水50ml，精密称重，回流提取2小时，放冷至室温，补足失水，提取液2ml置25ml量瓶，甲醇定容至刻度，离心取上清液作为丹参药材标准品溶液。
本发明的原理是根据丹参水溶性成分为其主要活性成分，建立起丹参水溶性提取物HPLC指纹图谱，从色谱的整体面貌特征上把握丹参的品种和质量情况。
本发明的优点如下：
(1)以丹参水溶性提取物建立起来的HPLC指纹图谱，代表着丹参大部分药理活性，能有效地表征丹参药材的质量。对丹参的全部化学成分进行检测，既不可能也没有必要。大量的药理和临床研究结果表明丹参的水溶性成分的活性强于脂溶性成分，故用丹参的水溶性成分作为监控指标就更具有代表性。
(2)以丹参整个指纹图形作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定丹参整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价丹参的质量提供了新的对照标准，将为提高丹参及其成方制剂的质量及疗效做出贡献。
(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。文献中用于测定丹参素或原儿茶醛的检测波长一般为281±1nm(张友芹等，中医药学报，2000，28(3)：68；郑末晶等，中国药事，2000，14(4)：254)，但指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息。与检测波长281±1nm相比，用254nm进行测定，出峰较多，反应的信息较完全，故采用254nm为检测波长，这也是与现有方法的不同之处。另外，为测定丹参中某种化学成分的含量，文献方法往往要对样品进行较复杂的处理，如水提醇沉、过吸附树脂等(李文春等，黑龙江医药，1999，12(24)：193)，而本发明只需用水热提，样品处理大为简便，节约了检验的成本和时间。
附图说明
图1对照品图谱。左---丹参素钠对照品 右---原儿茶醛对照品(参照物)
图2商洛丹参指纹图谱(0～90分钟)
图3市售丹参指纹图谱(0～90分钟)
图4商洛丹参指纹图谱(0～30分钟)
图5市售丹参商洛丹参指纹图谱(0～30分钟)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。实施例一 丹参HPLC标准指纹图谱的建立方法1仪器与试药1.1仪器
惠普1100高效液相色谱仪；惠普VWD紫外可变波长检测器；美国奥泰色谱之星工作站。1.2试药
丹参素钠对照品，自制，纯度大于99％；原儿茶醛对照品，市售分析纯精制，纯度大于99％；甲醇，色谱纯；冰醋酸，分析纯；蒸馏水；丹参药材标准品为天士力商洛丹参药材基地所产丹参。市售丹参，购自市药材公司。2色谱条件
色谱柱：十八烷基键合硅胶(4.6×250mm，5μ)美国Alltech公司；流动相：甲醇-水-冰醋酸，体积配比为8∶92∶1；检测波长：254nm；流速：1ml/min；柱温：40℃；理论塔板数以丹参素钠峰计算，应不低于2500。3指纹图谱测定3.1丹参指纹图谱制备
参照物溶液的制备：取丹参素钠，原儿茶醛对照品适量，用流动相稀释，制成每1ml中含丹参素钠20μg，原儿茶醛5.0μg，作为参照物溶液。
参照物：选用原儿茶醛为参照物(S)。
丹参药材标准品溶液制备：取商洛丹参药材粉末(过30目筛)4.00g，加水50ml，精密称重，回流提取2小时，放冷至室温，补足失水，取2ml置25ml量瓶，甲醇定容至刻度，离心取上清液作为丹参药材标准品溶液。
分别取参照物溶液及丹参药材标准品溶液20μl、10μl进样，照高效液相色谱法测定，记录90分钟的色谱图。以原儿茶醛的色谱峰(S峰)的相对保留时间和相对峰面积为1计算其它色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。3.2共有峰确定
通过10批商洛丹参药材指纹图谱测定，比较其色谱图，确定共有峰为12个，其中以原儿茶醛为参照物超过总峰面积10％的指纹峰为1号峰(平均RT为0.186)、8号峰(丹参素钠、平均RT为0.524)、11号峰(原儿茶醛、RT为1.000)及12号峰(平均RT为2576)，见图2-商洛丹参药材。10批药材共有峰相对峰面积及相对保留时间统计结果见表1、表2。3.3指纹图谱重现性试验
以商洛丹参药材0801批为供试品(N＝5)，按照指纹图谱重现性规定方法操作，分别对共有峰相对保留时间及有规定的共有峰(有规定的共有峰即超过总峰面积10％的指纹峰)的相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。结果见表3。3.4指纹图谱精密度试验
按照指纹图谱精密度规定方法操作，以商洛丹参药材0801批为供试品，取1份，连续进样5次，分别对共有峰相对保留时间及有规定的共有峰的相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。3.5指纹图谱稳定性试验
按照指纹图谱稳定性测定方法操作，以商洛丹参药材0801批为供试品，考察24小时溶液稳定，分别对共有峰相对保留时间及有规定的共有峰的相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。供试品24小时稳定。
表1 10批丹参药材峰面积统计共有指纹峰\药材批号 101 301 502 701 801 0902 1001 1101 1102 1103 均值±SD
峰面积 37014 42680 48958 41187 45823 42694 38324 7647 35331 33858 41351.6±5179.7峰1
相对峰面积％ 40.78 52.17 47.91 33.32 48.54 40.97 40.02 40.38 46.59 38.1 44.88±5.49
峰面积 37958 45282 47472 40352 40495 40646 41737 44922 36370 37405 41263.9±3649.5峰8
相对峰面积％ 41.82 55.35 46.46 52 23 42.9 39.01 43.58 38.07 47.96 42.09 44.95±5.57峰11-S 峰面积 90776 81812 1E+05 77251 94399 104201 95766 1E+05 75836 88862 92908.7±13056.1
峰面积 40032 28324 30000 29688 37166 30048 36298 45569 29454 38260 34483.9±5816.0峰12
相对峰面积％ 44.1 34.62 29.36 38.43 39.37 28.84 37.9 38.62 38.84 43.06 37.31±5.07丹参素含量(％) 0.73 0.84 0.96 0.81 0.9 0.84 0.75 0.94 0.7 0.67
表2 10批丹参药材相对保留时间统计批号\共有指纹峰 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11(S) 12
材101 0.183 0.206 0.214 0.264 0.283 0.401 0.422 0.524 0.609 0.686 1 2.583
材301 0.181 0.202 0.211 0.262 0.280 0.397 0.420 0.521 0.604 0.681 1 2.639
材502 0.185 0.206 0.216 0.264 0.282 0.403 0.422 0.523 0.614 0.684 1 2.569
材701 0.184 0.201 0.213 0.266 0.282 0.405 0.422 0.523 0.616 0.681 1 2.558
材0801 0.183 0.204 0.213 0.263 0.282 0.400 0.421 0.522 0.609 0.683 1 2.60
材0902 0.181 0.201 0.212 0.265 0.283 0.396 0.420 0.522 0.606 0.687 1 2.644
材1001 0.187 0.208 0.226 0.269 0.285 0.409 0.439 0.526 0.622 0.684 1 2.545
材1101 0.187 0.207 9.219 0.268 0.284 0.410 0.423 0.525 0.623 0.670 1 2.556
材1102 0.199 0.216 0.230 0.272 0.288 0.413 0.427 0.528 0.626 0 688 1 2.528
材1103 0.188 0.208 0.22 0.267 0.285 0.406 0.423 0.525 0.624 0.689 1 2.536
均值 0.186 0.206 0.217 0.266 0.283 0.404 0.424 0.524 0.615 0.682 1 2.576
SD 0.00525 0.00446 0.00636 0.00306 0.00222 0.00564 0.00667 0.00213 0.00810 0.00542 0 0.04070
RSD％ 2.82 2.17 2.93 1.15 0.78 1.40 1.34 0.41 1.32 0.79 0 1.58
表3 重现性实验结果实验号\共有指纹峰 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11(S) 12
SD 0.000 0.001 0.000 0.001 0.002 0.001 0.001 0.002 0.001 0.002 0.000 0.019相对保留时间 均值 0.182 0.204 0.213 0.265 0.284 0.399 0.422 0.524 0.608 0.688 1.000 2.625
RSD％ 0.17 0.44 0.16 0.23 0.54 0.27 0.35 0.30 0.18 0.25 0.00 0.71
SD 392 423 141 968 6762 465 565 932 142 193 2363 111
峰面积 均值 47463 18613 6213 5051 16305 2493 12469 42484 9552 2016 103668 35183
RSD％ 0.83 2.27 2.27 19.16 41.47 18.66 4.53 2.19 1.49 9.55 2.28 0.32
SD 0.95 0.47 0.40 0.90 6.46 0.44 0.53 1.02 0.23 0.21 0.00 0.85相对峰面积％ 均值 45.8 18.0 17.7 4.9 15.7 2.4 12.0 41.0 9.2 1.9 100.0 34.0
RSD％ 2.07 2.60 2.25 18.53 41.19 18.43 4.44 2.49 2.52 10.92 0.00 2.50
以上试验显示，该测定方法稳定可靠。通过对基地实施GAP管理，严控化肥、农药、采收加工等环节，使丹参质量可控，指纹图谱相对稳定。实施例二 以丹参标准指纹图谱鉴别丹参药材
市售丹参药材的测定方法同商洛丹参标准指纹图谱测定方法，采样时间为90分钟，测定3批。与商洛丹参区别见表4，色谱图见图1～5。
以实施例 中的丹参标准指纹图谱作为鉴别基础，比较丹参标准指纹图谱与待测丹参指纹图谱的差异，鉴别两者是否一致。
结果表明市售丹参其色谱图中缺乏共有峰4(RT0.264)，5(RT0.283)；原儿茶醛峰面积低于标准图谱50％；市售丹参指纹图谱中与商洛丹参标准指纹图谱共有峰1(RT0.181)、3(RT0.211)、8(RT0.521)相对峰面积有较大差异；其非共有峰占总面积超过10％。二者指纹图谱有较大区别，不能相互替代。
表4 市售丹参及商洛丹参区别
共有指纹峰 峰1 峰3 峰4 峰5 峰8 峰11(S)市 保留时间 4.63 5.663 13.487 14.08 25.93 85.63售 相对保留时间-RT 0.179 0.218 0.520 0.543 1.000 3.302
无 无丹 峰面积 7037 35304 30861 18890 30026 21686参 相对峰面积 23.44 117.58 102.78 62.91 100.00 72.22商 保留时间 4.600 5.37 6.667 7.143 13.26 25.473洛 相对保留时间-RT 0.181 0.211 0.262 0.280 0.521 1.000
无 无丹 峰面积 42680 18550 5526 18422 45282 81812参 相对峰面积 52.17 22.67 6.75 22.52 55.35 100.00
Claims (4)
1.一种丹参药材的鉴别方法，包括如下步骤：
第一步，先建立丹参的标准指纹图谱，方法如下
(a)丹参药材标准品溶液的制备：取过30目筛的丹参药材粉末加水，精密称重；回流提取1～3小时，放冷至室温，补足失水；取提取液少量置量瓶中，甲醇定容至刻度，离心，取上清液作为丹参药材标准品溶液；
(b)参照物溶液的制备：取丹参素钠、原儿茶醛对照品适量，用流动相稀释，制成参照物溶液，理论塔板数以丹参素钠峰计算，以原儿茶醛为参照物；
(c)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为甲醇-水-冰醋酸，体积配比为8∶92∶1；检测波长254±1nm；
(d)测定：精密吸取丹参药材标准品溶液及参照物溶液，分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定丹参标准指纹图谱；
所述丹参标准指纹图谱中，共有峰有12个，其中超过总峰面积10％的指纹峰有4个，以原儿茶醛的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1计算其它色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，上述4个指纹峰分别是1号峰平均相对保留时间RT为0.186，相对峰面积为38.10％～52.17％；8号峰的平均RT为0.524，相对峰面积为38.07～47.96％，11号峰的RT为1.000，相对峰面积为1；12号峰的平均RT为2.576，相对峰面积为28.84％～44.10％；
第二步，以上述相同的方法测定待测丹参样品指纹图谱；
第三步，将待测丹参样品指纹图谱与丹参标准指纹图谱对比，筛选符合丹参标准指纹图谱的丹参药材。
2.如权利要求1所述的丹参药材鉴别方法，其特征在于，所述丹参药材标准品溶液的具体制备过程为：取过30目筛丹参药材粉末4.00g，加水50ml，精密称重，回流提取2小时，放冷至室温，补足失水，提取液2ml置25ml量瓶，甲醇定容至刻度，离心取上清液作为丹参药材标准品溶液。
3.如权利要求1或2所述的丹参药材鉴别方法，其特征在于所述丹参标准指纹图谱为商洛丹参药材指纹图谱。
4.如权利要求1或2所述的丹参药材鉴别方法，其特征在于：所述12个共有峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于3％，其中1号峰的平均相对保留时间RT为0.186，相对标准偏差RSD为2.82％；2号峰的平均RT为0.206，RSD为2.17％；3号峰的平均RT为0.217，RSD为2.93％；4号峰的平均RT为0.266，RSD为1.15％；5号峰的平均RT为0.283，RSD为0.78％；6号峰的平均RT为0.404，RSD为1.40％；7号峰的平均RT为0.424，RSD为1.34％；8号峰的平均RT为0.524，RSD为0.41％；9号峰的平均RT为0.615，RSD为1.32％；10号峰的平均RT为0.682，RSD为0.79％；11号峰原儿茶醛即参照峰的RT为1.000；12号峰的平均RT为2.576，RSD为1.58％。
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