CN101040907B

CN101040907B - 扶正化瘀植物药中丹参原料指纹图谱质量检测方法

Info

Publication number: CN101040907B
Application number: CN2007100401416A
Authority: CN
Inventors: 胡坪; 潘一峰
Original assignee: SHANGHAI MODERN CHINESE TRADITIONAL MEDICINE TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: Anhui Zhihetang Pharmacy Co., Ltd.
Priority date: 2007-04-27
Filing date: 2007-04-27
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2027-04-27
Also published as: CN101040907A

Abstract

本发明涉及扶正化瘀植物药中丹参原料指纹图谱质量检测方法，包括：(1)取1.0g丹参粉末，加入甲醇微波提取；(2)梯度洗脱流动相：Alltima C18柱(4.6mm 250mm，5μm)，检测波长为280nm，流速为1.0ml/min，柱温20-40℃；进样量10-20ul；(3)建立标准指纹图谱：1号峰丹参素、8号峰迷迭香酸、9号峰紫草酸、10号峰丹酚酸B、11号峰丹酚酸B/E异构体、14号峰隐丹参酮和16号峰丹参酮IIA；(4)指纹图谱的质量检测：各特征峰相对保留时间，丹参素0.21，迷迭香酸0.91，紫草酸0.93，丹酚酸B 1.00，丹酚酸B/E异构体1.04，隐丹参酮0.92，丹参酮IIA 1.00；(5)丹参种植采收方法；本发明能全面控制原料的质量，确保产品的质量稳定。

Description

扶正化瘀植物药中丹参原料指纹图谱质量检测方法

技术领域

本发明属丹参原料质量控制方法领域，特别是涉及一种扶正化瘀植物药中丹参原料指纹图谱质量检测方法。

背景技术

丹参(Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae)为唇形科(Labiatae)植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎。因其色红且形状似参而得名“丹参”。别名：紫丹参、红丹参、血参、赤参、红根、川丹参、野丹参等。其味苦，性微寒，归心、肝经。作为一传统中药在我国沿用已久，始载于《神农本草经》，被列为上品。《本草经疏》、《本草纲目》、《妇人明理论》、《滇南本草》、《本草求真》等亦有记载。中医理论认为丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的作用，主治冠心病、心绞痛、心烦不眠、月经不调、经闭痛经等症。

《中国植物志》中描述丹参为多年生直立草本；高30～80cm，全株密被柔毛。根肥厚，外朱红色，内面白色，长5～15cm，直径4～14mm，疏生支根。茎直立，四棱形，具槽，密被长柔毛，多分枝。奇数羽状复叶，叶柄长1～7cm，密被向下长柔毛，小叶3～5(7)，长1.5～8cm，宽1～4cm，小叶卵形或椭圆状卵形或宽披针形，先端锐尖或渐尖，基部圆形或偏斜，边缘具圆锯齿，两面被柔毛，下面较密，小叶柄长2～14毫米，与叶轴密被长柔毛。轮伞花序有花6至多朵，组成长4.5～17厘米具长梗的顶生或腋总状花序。苞片披针形，被腺毛；花萼钟形，带紫色，长1～1.3cm，花后稍增大，外面被疏长柔毛及具腺长柔毛，具缘毛，内面中部密被白色长硬毛，具11脉，二唇形，上唇全缘，三角形，下唇与上唇近等长，深裂成2齿，齿三角形；花冠紫蓝色，长2～2.7厘米，外被具腺短柔毛，尤以上唇为密，内面离冠筒基部约2～3mm有斜生不完全小疏柔毛毛环，冠筒外伸，比冠檐短，基部宽2毫米，向上渐宽，至喉部宽达8mm，冠檐二唇形，上唇长12～15mm，镰刀状，向上竖立，先端微缺，下唇短于上唇，3裂，中裂片长5毫米，宽达10mm，先端二裂，裂片顶端具不整齐的尖齿，侧裂片短，顶端圆形，宽约3mm。能育雄蕊2，伸至上唇片，花丝长3.5～4mm，药隔长17～20mm，中部关节处略被小疏柔毛，上臂十分伸长，长14～17mm，下臂短而增粗，药室不育，顶端联合花丝比药隔短，上臂药室发育，2下臂的药室不育，顶端联合。退化雄蕊线形，长约4毫米。花柱较雄蕊长，柱头2裂。子房上位，4深裂。花盘前方稍膨大。小坚果椭圆形，熟时暗棕色或黑色，包于宿萼中。花期4～8月，果期7～9月。

丹参分布广，适应性强。生于海拔120～1300m的山坡、林下、草地或沟边。喜温和气候，较耐寒，可耐受-15℃以上的低温。生长最适温度为20～26℃，最适空气相对湿度为80％。产区一般年平均气温11～17℃，海拔500m以上，年降水量500mm以上。丹参根部发达，怕旱又忌涝。对土壤要求不严，一般土壤均能生长。对土壤酸碱度要求不严，从微酸性到微碱性皆都。宜选择肥沃、疏松、地势略高、排水良好的土地种植。但过于干燥的气候与土壤条件，不利于丹参的生长发育。

自然分布于中国的河北、山西、陕西、山东、江苏、安徽、浙江、江西、河南、湖北、湖南等地。

目前丹参商品规格分为野生与家种两种。野生资源广泛分布，在野生资源逐渐减少的同时，自20世纪70年代以来，中国许多地区开展丹参的引种栽培，其中四川、山东、安徽、河北、河南、陕西、江苏等地区已成为栽培丹参的主要产区。

《中华人民共和国药典》2005版描述：丹参根茎粗短，顶端有时残留茎基。根数条，长圆柱形，略弯曲，有的分枝并具有须状细根，长10～20cm。直径0.3～1cm。表面棕红色或暗红色，粗糙，具纵皱纹。老根外皮疏松，多显紫棕色，常呈鳞片状剥落。质硬而脆，断面疏松，有裂隙或略平整而致密，皮部棕红色；木部灰黄色或紫褐色，导管束黄白色，呈放射状排列。气撒，味微苦涩。栽培品较粗壮，直径0.5～1.5cm。表面红棕色，具纵皱，外皮紧贴不易剥落。质坚实，断面较平整，略呈角质样。

丹参主要含有二萜类成分、酚酸类成分、氨基酸及微量无机元素等。二萜类和酚酸类成分被认为是丹参药材中的主要药理活性成分，迄今为止，已从丹参中分离并鉴定出30多种二萜醌类成分，其中最具代表性的有丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I、二氢丹参酮I等。现代药理研究表明，丹参酮IIA等二萜类化合物具有抗炎、抗氧化、抗血小板凝集、抗肿瘤等药理活性。从丹参中分离得到的水溶性酚酸类成分主要有咖啡酸衍生物如丹参素单聚体、咖啡酸单聚体，咖啡酸二聚体(如迷迭香酸、丹酚酸F、丹酚酸D等)，咖啡酸三聚体(如紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸J等)和咖啡酸四聚体(如丹酚酸B，丹酚酸E)等。近30年来的药理试验证明，丹参水提取液及丹酚酸类化合物具有抗氧化、抗血栓、防止肝纤维化、抗HIV病毒等药理活性。

蒋轶伦等利用薄层色谱技术以不同等级和采收期的丹参为分析对象，初步建立了丹参的TLC指纹图谱。金樟照等分别用乙醚和水回流提取丹参中的脂溶性成分和水溶性成分，并分别建立了HPLC指纹图谱。刘艳华等也进行了丹参的HPLC指纹图谱的研究，他们先将丹参粗粉用水回流，再加入等量的无水乙醇静置过夜，过滤，定容后进行HPLC分析，获得了不同产地丹参的水溶性成分指纹图谱。李磊等超声提取了丹参的水溶性成分，建立了不同产地的丹参HPLC指纹图谱，并以指纹图谱中各共有指纹峰峰号为横坐标，以相应峰号的峰面积为纵坐标，进行归一化处理，建立了丹参的指纹条形码谱图。陈惠清建立了丹参的红外指纹图谱。顾铭等将丹参药材粉末用正丁醇-乙醇溶剂多次充分浸提后，采用高效逆流色谱建立了丹参脂溶性成分的指纹图谱。

关于丹参药材的指纹图谱有一些研究报道，但很少应用于生产中药材的质量控制。同时根据丹参现有的化学成分和药理临床研究资料，以及扶正化瘀药理研究以有效成分的研究成果，确定需要表征的活性部位和主要活性成分，因此要求能全面地体现丹参药材中木脂素类成分的整体特征。采用液质联用技术对指纹图谱中的主要色谱峰进行了归属，保证了丹参中有效成分在指纹图谱中被充分体现。同时，药材的指纹图谱质量控制与药材基地的药材GAP生产相结合，保证了指纹图谱质控方法的实施，也保证了药材的质量稳定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种扶正化瘀植物药中丹参原料指纹图谱质量检测方法，该方法能全面检测原料药材的质量，确保产品的质量稳定。

本发明的技术方案如下：

一种扶正化瘀植物药中丹参原料指纹图谱质量检测方法，包括下列步骤：

(1)提取丹参供试品

精密称取约1.0g丹参药材粉末(过3号筛)，加入100ml 50％的甲醇，精密称定重量，微波提取40-70分钟，冷却，称量补重。摇匀，用0.23-0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液进行HPLC指纹图谱分析。

(2)梯度洗脱流动相

Alltima C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，检测波长为280nm，流速为1.0ml/min，柱温20-40℃；进样量为10-20μl。采用梯度洗脱方式洗脱样品，流动相及梯度设置如表1所示。

表1 HPLC分析中流动相的组成与梯度程序

Figure DEST_PATH_RE-GA20174319200710040141601D00021

(3)标准指纹图谱的建立

对合适样品的HPLC指纹图谱中所有峰进行比较，确定了16个共有峰，如图1所示：1.丹参素；2.原儿茶醛；3.咖啡酸；4.丹酚酸F；5.丹酚酸D；6.丹酚酸J/异构体；7.丹酚酸E；8.迷迭香酸；9.紫草酸；10.丹酚酸B；11.丹酚酸B/E/异构体；12.丹酚酸A；13.二氢丹参酮I；14.隐丹参酮；15.丹参酮I；16.丹参酮IIA。在共有峰里选取了7个特征峰，分别为1号峰丹参素、8号峰迷迭香酸、9号峰紫草酸、10号峰丹酚酸B、11号峰丹酚酸B异构体、14号峰隐丹参酮和16号峰丹参酮IIA。这些峰中，丹参素、丹酚酸B 和丹参酮IIA为丹参药材中的主要活性成分，所有特征峰均经对照品对照定性或HPLC/MS鉴定。

根据LC-MS-MS的鉴定结果，丹参高效液相色谱指纹图谱表达了两类化学成分的分布特性。将丹参指纹图谱分成两个特征区，5-40分钟范围内为水溶性酚酸类组分的特征区，以丹酚酸B为指标成分峰，45-65分钟范围内为脂溶性丹参酮类组分的特征区，以丹参酮IIA为指标成分峰。

从十批样品的HPLC指纹图谱中按照以下原则选取一批丹参药材的指纹图谱作为对照指纹图谱(附图1)：结合产地情况，优先考虑道地药材的指纹图谱(或结合药效实验情况，优先考虑确定疗效的药材的指纹图谱)。将指纹图谱和定量测定结果进行对照比较，剔除特别不合理的样品，优先考虑含量在平均值附近的样品的指纹图谱。结合指纹图谱和定量结果，选取特征峰分离较好，峰的保留时间和峰高适宜、峰型(峰的形状和峰高比例)较典型的指纹图谱。优先选取基线平稳、信噪比好的指纹图谱。

(4)指纹图谱的质量检测

A.样品真伪的鉴别

根据公式计算十批药材指纹图谱中各特征峰的相对保留时间RRT(RRT＝特征峰的保留时间/指标峰的保留时间)，结合两个实验室的验证结果，确定了各特征峰的相对保留时间，其变化范围应小于RSD 3％。7个指纹图谱特征峰相对保留时间：丹参素0.21，迷迭香酸0.91，紫草酸0.93，丹酚酸B 1.00，丹酚酸B/E异构体1.04，隐丹参酮0.92，丹参酮IIA1.00。

根据实验条件对待测样品进行测定，得出样品的HPLC色谱图，计算各特征峰的相对保留时间，并与所列对照指纹图谱和相对保留时间表进行比较。如各特征峰均存在，而且相对保留时间(RRT)吻合，则可确定为该原料。

B.样品质量评价

采用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(国家药典委员会)，将样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(或对照品共有模式指纹图谱)进行比较。以18个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.9。

表2 特征峰的相对保留时间与相对峰面积

^*水溶性酚酸以丹酚酸B为指标峰，酯溶性二萜以丹参酮IIA为指标峰。

^*RRT(相对保留时间)＝特征峰的保留时间/指标峰的保留时间

^*RPA(相对峰面积)＝特征峰的峰面积/指标峰的峰面积

所述步骤2 Alltima C18柱(4.6mm 250mm，5μm)，检测波长为280nm，流速为1.0ml/min，柱温20-40℃；进样量10-20ul；采用梯度洗脱方式洗脱样品。

所述步骤4在指纹图谱测定条件确定后，通过对至少三批样品进行测定，计算相关参数，并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。通过对至少三批样品进行测定，丹酚酸B对照品溶液(100μg/ml)的色谱峰面积重现性(RSD)不高于3％，保留时间重现性(RSD)不高于2％；丹酚酸B和相邻峰的分离度不小于1.0；色谱柱柱效以丹酚酸B计不少于30,000块理论塔板数。

本发明的另一技术方案如下：

丹参种子采摘后播种，秋天定植于大田，经过第二年生长和田间管理，在10～11月采挖晒干。

本发明的有益效果：

1、丹参药材的指纹图谱能全面地体现丹参药材中药效成分的整体特征。采用液质联用技术对指纹图谱中的主要色谱峰进行了归属，保证了丹参中有效成分在指纹图谱中被充分体现。

2、考察了供试品溶液的稳定性，结果表明，在室温下，24小时之内，丹参供试品溶液保持稳定。同时考察公司贮藏的样品在1年内的稳定性，发现相似度大于0.9。精密度和重复性试验，都表明相似度在0.99以上。

3、将指纹图谱与药材GAP基地的建设结合起来，在药材生产中就开始控制药材的质量，这样保证了指纹图谱的实施，指导GAP基地的建设，并真正运用于药材质量控制。

4、经过对丹参药材基地十批丹参药材的指纹图谱相似度进行计算，发现药材相似度大于0.9-1.0之间。说明建立的丹参指纹图谱质控方法，灵敏度高，重复性好，专属性强，操作简便，方法可靠，可以丹参质量进行科学，有效的评价证实能够运用于实际生产中质量控制，满足药材鉴别和质量控制的需求。

5.药材质量的稳定，同时也保证的扶正化瘀制剂质量的稳定可控。

附图说明

图1典型的丹参高效液相色谱指纹图谱

图2丹参样品的指纹图谱

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

精密称取约1.0g丹参药材粉末(过3号筛)，加入100ml 50％的甲醇，精密称定重量，微波提取70分钟，冷却，称量补重。摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液进行HPLC指纹图谱分析。

色谱柱：Alltech公司Alltima C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温20℃，检测波长为280nm，流速为1.0ml/min，进样量为20μl。采用梯度洗脱样品，流动相及梯度设置如表1所示。

表1 HPLC分析中流动相的组成与梯度程序

通过对十批丹参药材的相似度进行计算，发现药材相似度大于0.9-1.0之间。说明建立的丹参指纹图谱质控方法，操作简便，方法可靠，证实能够运用于实际生产中质量控制，满足药材鉴别和质量控制的需求。

一批丹参药材样品指纹图谱图见图2，特征峰的相对保留时间与相对峰面积见表2。

Claims

1.一种扶正化瘀植物药中丹参原料指纹图谱质量检测方法，包括下列步骤：

(1)提取丹参

称取1.0g丹参粉末，加入100ml 50％的甲醇，精密称定重量，微波提取40-70分钟，冷却补重，摇匀，用0.23-0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液进行HPLC指纹图谱分析；

(2)梯度洗脱流动相

Alltima C18柱4.6mm×250mm，5μm，检测波长为280nm，流速为1.0ml/min，柱温20-40℃；进样量为10-20μl，采用梯度洗脱方式洗脱样品，流动相及梯度设置如表所示：

(3)标准指纹图谱的建立

确定16个共有峰，选取了7个特征峰，分别为1号峰丹参素、8号峰迷迭香酸、9号峰紫草酸、10号峰丹酚酸B、11号峰丹酚酸B/E异构体、14号峰隐丹参酮和16号峰丹参酮IIA，其中丹参素、丹酚酸B和丹参酮IIA为主要活性成分；

其中，16个共有峰为1.丹参素；2.原儿茶醛；3.咖啡酸；4.丹酚酸F；5.丹酚酸D；6.丹酚酸J/异构体；7.丹酚酸E；8.迷迭香酸；9.紫草酸；10.丹酚酸B；11.丹酚酸B/E/异构体；12.丹酚酸A；13.二氢丹参酮I；14.隐丹参酮；15.丹参酮I；16.丹参酮IIA；

(4)指纹图谱的质量检测

a.样品真伪的鉴别

水溶性酚酸以丹酚酸B为指标峰，脂溶性二萜以丹参酮IIA为指标峰，各特征峰的相对保留时间为丹参素0.21，迷迭香酸0.91，紫草酸0.93，丹酚酸B 1.00，丹酚酸B/E异构体1.04，隐丹参酮0.92，丹参酮IIA 1.00；

b.样品质量评价

将样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱比较，以16个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.9。

2.根据权利要求1所述的扶正化瘀植物药中丹参原料指纹图谱质量检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中的指纹图谱的质量检测是在指纹图谱测定条件下，通过对至少三批样品进行测定，丹酚酸B对照品溶液的色谱峰面积重现性不高于3％，保留时间重现性不高于2％；丹酚酸B和相邻峰的分离度不小于1.0；色谱柱柱效以丹酚酸B计不少于30,000块理论塔板数。

3.根据权利要求1所述的扶正化瘀植物药中丹参原料指纹图谱质量检测方法，其特征在于：所述的丹参种植采收方法，包括：丹参种子采摘后播种，秋天定植于大田，经过第二年生长和田间管理，在10～11月采挖晒干。