CN1538170A - 抗病毒口服液指纹图谱检测技术 - Google Patents

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宋力飞
刘乡乡
黄晓玲
王世勇
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Abstract

本发明涉及中药复方制剂抗病毒口服液的指纹图谱检测技术。包括将样品用溶剂提取，分别测试提取物的气相和液相色谱指纹图谱，与相应对照品的指纹图谱比较，从而鉴别药品的药性。本发明用乙醚作提取溶剂，以正己烷溶解残留物，取正己烷溶液为气相色谱供试液；在挥干正己烷残留物中加入甲醇溶解，作为液相色谱供试液。实验证明，本发明指纹图谱检测技术对工艺研究起到很好的指导作用，是一种评价中药复方制剂生产过程的关键技术。

Description

抗病毒口服液指纹图谱检测技术
(一)技术领域
本发明涉及以天然植物和矿物中药材原料制成的中成药鉴别技术，特别是中药复方制剂抗病毒口服液指纹图谱检测技术。
(二)背景技术
中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的，具有特征性的某类成分的色谱或光谱的图谱。当前，中药指纹图谱质量控制技术作为控制中药质量均一性和稳定性的检测手段，是中药现代化的关键技术之一，这对有效地控制中药材和中成药的质量有重要意义。国家药品监督管理局已要求中药制剂实施指纹图谱质量控制。据报道，日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用液相指纹图谱控制质量，美国、德国、法国等国家亦对植物草药采用指纹图谱质量控制技术。随着中医中药的推广应用，指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已为国际所共识。但目前中药植物的指纹图谱往往采用单一植物，例如中国专利申请(丹参药材指纹图谱建立的方法及其标准指纹图谱，公开号CN1233951A)。对多种中药材合成的中成药复方制剂的质量图谱研究尚处起步阶段。中药抗病毒口服液是获国家卫生部批准的四类新药，产品为复方制剂，由九味中药组成，其中一味为矿物药石膏，其它八味为植物药，即板蓝根、地黄、知母、芦根、连翘、广藿香、石菖蒲、郁金。人们对单味药材的分析研究颇多，但至今未见中药复方制剂抗病毒口服液指纹图谱检测技术的报导。
(三)发明内容
本发明的目的是通过采用高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)对抗病毒口服液进行指纹图谱研究，建立一种抗病毒口服液指纹图谱检测技术，将抗病毒口服液指纹图谱检测技术作为质量控制及真伪鉴别的重要依据和指标之一。
本发明通过下列步骤实施。
抗病毒口服液指纹图谱检测技术，包括样品供试液制备，对照品供试液制备，HPLC和GC指纹图谱检测，相似度评价。它采用以下步骤：
一、样品供试液制备
GC供试品溶液制备
取抗病毒口服液100ml，置250m1分液漏斗中，加乙醚100ml，振摇萃取，静置分层，取乙醚层，用无水硫酸钠脱水后，置250ml烧杯中，在水浴挥至乙醚约5ml，转置10ml的敞口小瓶中继续蒸干，在残留物中加入1ml正己烷，超声溶解，放置于常温，取正己烷溶液，定容至1ml，即为GC供试液。
在GC供试品溶液制备中，采用100ml乙醚振摇萃取一次，乙醚的蒸发温度为34℃～75℃，最好为65℃；用正己烷溶解蒸发残留物时，正己烷超声溶解时间为5～15min，最好为10min。
HPLC供试品溶液制备
取抗病毒口服液25ml，用醋酸乙酯振摇提取6次，每次25ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣用甲醇溶解，并定容至5ml，即为HPLC供试液。
在HPLC供试品溶液制备中，醋酸乙酯振摇萃取4-6次，最好为6次；醋酸乙酯的蒸发温度为80℃～100℃，最好为90℃。
二、参照品溶液的制备
精密称取连翘对照品适量，置50ml的容量瓶中，加甲醇制成1ml含300μg的溶液，作为参照品溶液。
三、色谱条件
HPLC色谱条件 色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈-0.01％磷酸二元梯度洗脱，乙腈含量为7％-40％；流速1ml/min；检测器：DAD(200-400nm)，检测波长为236nm；柱温：25-35℃。
GC色谱条件 色谱柱为弹性石英毛细管柱，进样口温度为230℃，检测器温度为250℃，分流进样，程序升温70℃～230℃，于230℃保温10～15分钟，流速1ml/min。
四、供试液指纹图谱检测
取HPLC供试液10μl，注入高效液相色谱仪，记录65min色谱图，得成品HPLC指纹图谱；
取GC供试液1μl，注入气相色谱仪，记录40min色谱图，得成品GC指纹图谱；
五、指纹图谱共有峰的确定
HPLC指纹图谱 HPLC指纹图谱共标定了22个共有峰，图谱总长度为65min，见图1。其中6号色谱峰归属板蓝根，板蓝根是抗病毒口服液的君药，占处方量的30％，为HPLC指纹图谱中最强峰。12号和13号色谱峰是一组未完全分离峰，两者光谱相近。17号色谱峰经连翘苷对照品加样试验后证实为连翘苷，属中等强度峰。因连翘苷为抗病毒口服液中一主要活性成分，且峰值较高，因此选择连翘苷为参照峰，标号为S，其他特征峰依次标号为1，2，...，N。HPLC指纹图谱共有峰及其参考保留时间和药材归属见表1。
                                 表1  HPLC指纹图谱共有峰及参考保留时间
峰号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
保留时间 2.27 2.39 3.17 4.06 6.89 12.20 19.04 20.14 21.25 25.97 27.87
药材归属 地黄 板蓝根 板蓝根 板蓝根 连翘 板蓝根 连翘 知母 知母 芦根 连翘
峰号 12 13 14 15 16 S 18 19 20 21 22
保留时间 30.13 30.58 34.92 36.54 43.47 47.22 47.84 51.51 52.57 54.06 60.43
药材归属 连翘 连翘 连翘 连翘 板蓝根石菖蒲 连翘 板蓝根石菖蒲 连翘 板蓝根 连翘 连翘
GC指纹图谱 GC指纹图谱共标定了16个共有峰，图谱总长度为40min。图谱中前3.5min为溶剂峰，7号和8号色谱峰分别为第一和第二大强峰，归属连翘。13号和15号色谱峰均归属石菖蒲，属中等强度峰，其中13号色谱峰在GC图谱中分离度较好，并且在成品的稳定性考察中发现其峰值较稳定，受放置时间的影响较小，因此选择为参照峰，标号为S，其他特征峰依次标号为1，2，...，N。GC指纹图谱共有峰及其参考保留时间和药材归属见表2。
                          表2  GC指纹图谱共有峰及保留时间
峰号     1     2     3     4     5     6     7     8
保留时间   6.564   7.653   9.173   12.88   13.13   13.9   14.39   14.88
药材归属 连翘   连翘郁金 连翘   石菖蒲郁金 石菖蒲 石菖蒲 连翘 连翘
峰号   9   10   11   12   S   14   15   16
保留时间   22.55   23.30   29.27   30.00   31.97   33.64   34.48   36.04
药材归属   广藿香   石菖蒲   郁金   石菖蒲   石菖蒲   广藿香   石菖蒲   广藿香
采用HPLC、GC色谱技术对抗病毒口服液进行检测，HPLC、GC指纹图谱各指纹特征峰共同组成了抗病毒口服液的指纹图谱特征，可以完整的对抗病毒口服液所含的8味植物药材作出色谱鉴定。
六.指纹图谱相似性评价
取抗病毒口服液十批，按上述检测方法进行检测，得出十批样品的HPLC(见图5)和GC(见图6)图谱，采用中国药典委员会推荐的计算机辅助相似性评价系统软件(中南大学中药现代化研究中心编制)分别对GC图谱和HPLC图谱进行综合评价(在对GC图谱相似度评价时已去除溶剂峰)，得出HPLC(见图3)和GC(见图4)的指纹图谱共有模式及其相似度，相似度评价结果见表3和表4。
                                    表3  HPLC指纹图谱相似度评价
相关系数 0.9623  0.9276  0.9932  0.9919  0.9763  0.9872  0.9892  0.9796  0.9795  0.9818
相合系数 0.9707  0.9440  0.9947  0.9937  0.9814  0.9899  0.9916  0.9829  0.9824  0.9671
                                    表4  GC指纹图谱相似度评价
相关系数 0.9735  0.9318  0.9512  0.9707  0.9926  0.9720  0.9853  0.9875  0.9900  0.9514
相合系数 0.9837  0.9574  0.9698  0.9801  0.9942  0.9819  0.9907  0.9890  0.9917  0.9692
本发明的优点：
1.本发明采用的指纹图谱包括2部分，即气相指纹图谱和液相指纹图谱检测。它们基本代表了抗病毒口服液的药理活性，其指纹图谱质量标准涵盖了抗病毒口服液的基本信息，其指纹图谱对工艺研究起到很好的指导作用。
2.本发明提供的指纹图谱检测技术是一种评价复方制剂生产过程稳定性的关键技术，其良好的稳定性是判断生产过程包括原辅料质量，过程控制工艺成熟度的重要指标。利用本指纹图谱技术可以客观、量化地确定生产全过程的关键质量监控点及工艺参数，可以明确的指导中药生产技术的研究，成为促进企业技术进步的原动力。
3.本发明提供的指纹图谱检测技术，可作为评价中药质量的关键手段，促进中药产品国际市场进程，有利于我国加入WTO与国际标准接轨。
附图说明
图1为本发明制备样品供试液过程方框图；
图2为抗病毒口服液对照指纹图谱(HPLC)；
图3为抗病毒口服液对照指纹图谱(GC)；
图4为抗病毒口服液成品指纹图谱共有模式(HPLC)；
图5为抗病毒口服液成品指纹图谱共有模式(GC)；
图6为抗病毒口服液十批成品指纹图谱(HPLC)；
图7为抗病毒口服液十批成品指纹图谱(GC)。
本发明的实施例如下：
1.仪器与试剂
仪器  Aglent1100 Series系列高效液相色谱仪，Aglient6890气相色谱仪.HP色谱工作软件，HP三维光谱软件，计算机辅助相似性评价系统(中南大学中药现代化研究中心)。
试药  甲醇，乙腈，乙酸乙酯，乙醚，正己烷，二次蒸馏水，磷酸。其中乙腈为色谱纯，甲醇为色谱纯和分析纯，其余均为分析纯。连翘苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，样品由申请人提供。
2.高效液相色谱
色谱条件与系统适应性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Hydrosphere C18，S-5μm，12nm，250×4.6mm)；用乙腈-0.01％磷酸二元梯度洗脱梯度；流速为每分钟1ml；检测器：DAD(200-350nm)；检测波长为236nm；柱温为30℃。
参照物溶液的制备  精密称取连翘苷对照品15.0mg置于50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品的制备  精密吸取抗病毒口服液25ml，置125ml分液漏斗中，用醋酸乙酯振摇提取6次，每次25ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣用甲醇溶解，并定容至5ml，即为供试品溶液。
测定法  取HPLC供试品溶液10μl，注入高相液相色谱仪，记录65min的色谱图。
供试品指纹图谱与共有模式图谱经计算机辅助相似度评价软件计算，相似度应大于0.90。
3.气相色谱
色谱条件与系统适应性实验  用弹性石英毛细管柱(Agilent HP-5，30.0m×320μm×0.25μm)，氢火焰检测器。进样口温度：230℃，检测器温度：250℃。分流进样(50∶1)。程序升温：初始70℃，3℃/分钟升至150℃，2℃/分钟升至170℃，5℃/分钟升至230℃，保持11分钟，流速1ml/min。
供试品的制备  取抗病毒口服液100ml，置250ml分液漏斗中，加乙醚100ml，振摇萃取，静置分层，取乙醚层，用无水硫酸钠脱水后，置250ml烧杯中，在65℃的水浴蒸汽上挥至乙醚液约5ml，转置10ml的敞口小瓶中，烧杯用3ml乙醚分两次洗涤烧杯，洗液并入小瓶中，继续蒸干，残留物立即加1ml正己烷，超声10min，放置至常温，取正己烷溶液，定容至1ml，即为GC供试液。
测定法  取GC供试品溶液1μl，注入气相色谱仪，记录40min的色谱图。
供试品指纹图谱与共有模式图谱经计算机辅助相似度评价软件计算，相似度应大于0.90。

Claims (8)

1.一种抗病毒口服液指纹图谱检测技术，包括样品用溶剂提取制备样品的供试液，测试提取物的液相色谱和气相色谱，并与相应对照品的指纹图谱进行比较，其特征在于：用乙醚和醋酸乙酯作提取溶剂，以正己烷和甲醇溶解残留物，其制备样品供试液过程如下：
A、气相色谱(GC)供试液的制备：
将乙醚作为成品抗病毒口服液的提取溶剂，以溶剂萃取法萃取，待乙醚提取物挥干乙醚后，在残留物中加入正己烷溶解，取正己烷溶液，作为GC供试液，供气相色谱分析；
B、液相色谱(HPLC)供试液的制备：
将醋酸乙酯作为成品抗病毒口服液的提取溶剂，以溶剂萃取法萃取，待醋酸乙酯提取物挥干醋酸乙酯后，在残留物中加入甲醇溶解，取甲醇溶液，作为HPLC供试液，供液相色谱分析。
2.根据权利要求1所述的抗病毒口服液指纹图谱检测技术，其特征在于，
A、样品GC供试液制备步骤如下：
取抗病毒口服液100ml，置250ml分液漏斗中，加乙醚100ml，振摇萃取，静置分层，取乙醚层，用无水硫酸钠脱水后，置250ml烧杯中，在水浴挥至乙醚约5ml，转置10ml的敞口小瓶中继续蒸干，在残留物中加入1ml正己烷，超声溶解，放置于常温，取正己烷溶液，定容至1ml，即为GC供试液；
B、样品HPLC供试液制备步骤如下：
取抗病毒口服液25ml，用醋酸乙酯振摇提取6次，每次25ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣用甲醇溶解，并定容至5ml，即为HPLC供试液；
C、参照品溶液的制备如下：
精密称取连翘对照品适量，置50ml的容量瓶中，加甲醇制成每1ml含300μg的溶液，作为参照物溶液；
D、分别用GC和HPLC色谱法对样品供试液进行检测：
a、取HPLC供试液10μl，注入高效液相色谱仪，记录65min色谱图，得供试液高效液相色谱指纹图谱；
b、取GC供试液1μl，注入气相色谱仪，记录40min色谱图，得供试液气相色谱指纹图谱；
E、供试品指纹图谱与共有模式图谱经计算机辅助相似度评价软件计算，相似度应大于0.90。
3.根据权利要求1或2所述的抗病毒口服液指纹图谱检测技术，其特征是：
A、样品GC供试液制备中采用乙醚100ml萃取一次，振摇萃取的方式；
B、乙醚的蒸发温度为34℃～75℃，最好为65℃；
C、正己烷溶解残留物时，正己烷超声溶解时间为5～15min，最好为10min；
D、乙醚提取物在乙醚挥干后，立即加入正己烷溶液；
E、样品HPLC供试液制备中采用醋酸乙酯振摇萃取的方式，萃取4-6次，最好为6次，每次25ml；
F、醋酸乙酯的蒸发温度为80℃～100℃，最好为90℃。
4.根据权利要求1或3所述的抗病毒口服液指纹图谱检测技术，其特征是检测的色谱条件为：
A、HPLC：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充剂；流动相：用乙腈-0.01％磷酸二元梯度洗脱，乙腈含量为7％-40％；流速为1ml/min；检测器：DAD(200-400nm)，检测波长236nm；柱温为25-35℃；
B、GC：色谱柱为弹性石英毛细管柱，进样口温度为230℃，检测器温度为250℃，分流进样，程序升温70℃～230℃，于230℃保温10～15分钟，流速1ml/min。
5.根据权利要求1、4、5所述的抗病毒口服液指纹图谱的检测技术，其特征是所述的抗病毒口服液HPLC指纹图谱具有22个特征峰，图谱总长度为65min；抗病毒口服液GC指纹图谱具16个特征峰，图谱总长度为40min。
6.根据权利要求1、6所述的抗病毒口服液指纹图谱的检测技术，其特征是在HPLC指纹图谱中，其参照峰为连翘苷，即S色谱峰，最强峰为6号色谱峰，归属为板蓝根药材。12号和13号色谱峰是一组未完全分离峰，均归属于连翘药材。
7.根据权利要求1、7所述的抗病毒口服液指纹图谱的检测技术，其特征是在GC指纹图谱中，其参照峰归属为石菖蒲药材，即S色谱峰，最强峰和次强峰分别为7号和8号色谱峰，均归属连翘药材。
8.根据权利要求1、6、7所述的抗病毒口服液指纹图谱的检测技术，其特征是由HPLC、GC指纹图谱各指纹特征峰共同组成了抗病毒口服液的指纹图谱特征，可以完整的对抗病毒口服液所含的8味植物药材作出色谱鉴定。
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