CN100353163C - 一种采用液—液—液三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶的方法 - Google Patents
一种采用液—液—液三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种采用液—液—液三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶的方法。即采用三种不同极性和不同比重的溶剂，以非极性溶剂为轻相、极性溶剂为中间相(将阿胶预先溶于该相)、弱极性溶剂为重相组成三相萃取体系，在静态下对阿胶进行萃取，相分离后制成三种极性萃取物供试液并对三种供试液分别以不同的流动相梯度，按照高效液相色谱法测定，记录色谱图和三维谱图。对黄明胶、杂皮胶采用与阿胶相同的方法进行实验。通过对三种胶在相同条件下测定的同相萃取物HPLC图谱进行对比分析。该法鉴别阿胶，检测灵敏度高，分离度、对称性、重现性好，鉴别特征明显，能够准确鉴别阿胶真伪并有效控制其内在质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药分析领域。具体涉及一种液——液——液三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶的方法。
背景技术
阿胶为著名的中药，是由动物驴的皮，经煎熬后与辅料制成的胶剂。阿胶主要由胶原蛋白及其降解产物组成，如多肽和各种氨基酸(脂肪族、碱性、酸性、芳香族、杂环类氨基酸)，其分子量分布范围广，分子极性范围大；另外还含有甾醇类等众多其它成分，很难进行定性分析和质量控制。骡马皮，牛皮以及其它动物的皮，亦可用于熬制胶类制剂，其外观性状和化学成分与阿胶非常相似，用常规方法难以将它们加以鉴别。尤其是阿胶与骡马皮胶，来源于同科属(马科Equidae马属Eqnns)动物的皮，它们之间的成分更加类似，鉴别更加困难。因此，多年来阿胶的真伪鉴别一直未能得到有效解决。
目前，阿胶的真伪鉴别主要采用传统方法和经验鉴别，如2005年版药典采用薄层法鉴别阿胶，只检测其中的甘氨酸，专属性不强，无法监控其内在质量。阿胶鉴别方法的现代研究，主要包括光谱鉴别(红外、紫外、圆二色谱等)，色谱鉴别(PC，TLC，HPLC，电泳等)等。光谱法因不具备分离功能，测定的混合物光谱为叠加光谱，成分越多、越复杂，得到的光谱信息越简单，用于阿胶等胶类的鉴别，鉴别特征不明显。色谱法虽具有分离功能，但针对阿胶复杂的成分体系，采用现有的样品预处理方法和色谱条件，不能达到理想的分离效果。分离效果不好，数量较少的特征性成分就会被众多的非特征性成分所掩盖，所测各种胶的色谱将非常类似，阿胶的真伪将难以判断。
鉴于此，为了对阿胶进行有效的鉴别和内在质量控制，非常有必要建立一种对阿胶进行明确鉴别和综合质量分析的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种采用液——液——液三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶的方法，并将阿胶高效液相色谱作为阿胶真伪鉴别和质量控制的指标之一。
本发明涉及的采用三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶的方法，主要步骤如下：
1、阿胶样品溶液的制备：
方法a、精密称取过4号筛的阿胶样品粉末，置玻璃容器中，加入中间相溶剂，振摇1～3分钟，置超声清洗器中超声15～20分钟使之溶解，制成20mg/ml的溶液；然后将所述中间相溶液沿壁缓缓加入盛有重相溶剂的容器中，再沿壁缓缓加入轻相溶剂，使轻相∶中间相∶重相的体积比为：1∶1∶1或1∶1∶2或2∶1∶1或1∶2∶1或2∶1∶2；密封、静置萃取6小时～60小时；萃取后进行三相分离，将轻、重相萃取液分别置水浴上蒸干，残渣分别加无水乙醇溶解并定容，作为样品轻、重相供试液；将经轻、重两相溶剂萃取过的中间相溶液，以3000～4000转/分离心5～10分钟，取分离后的上清液作为样品中间相供试液；
或方法b、精密称取过4号筛的阿胶样品粉末，置玻璃容器中，加入中间相溶剂，振摇1～3分钟，置超声清洗器中超声15～20分钟使之溶解，制成20mg/ml的溶液；将轻相溶剂沿壁缓缓加入盛有中间相溶液的容器中，使轻相∶中间相的体积比为：1∶1或2∶1或1∶2；密封、静置萃取6小时～60小时；萃取后进行两相分离，轻相萃取液置水浴上蒸干，残渣加无水乙醇溶解并定容，作为样品的轻相供试液；将被轻相溶剂萃取过的中间相溶液，沿壁缓缓加入盛有重相溶剂的容器中，使中间相溶液∶重相的体积比为：1∶1或1∶2或2∶1；密封、静置萃取6小时～60小时；萃取后进行两相分离，重相萃取溶液置水浴上蒸干，残渣加无水乙醇溶解并定容，作为样品的重相供试液；将先后分别被轻、重相溶剂萃取过的中间相溶液，以3000～4000转/分离心5～10分钟，取分离后的上清液作为样品的中间相供试液；
2、对照品溶液的制备：
取DL-β-苯丙氨酸和DL-酪氨酸，分别加无水乙醇或水配制成5μg/ml的溶液，作为中间相供试液色谱的对照品溶液；
取胆红素加无水乙醇制成1μg/ml的溶液，作为轻相供试液色谱的对照品溶液；
取槲皮素加无水乙醇制成5μg/ml的溶液，作为重相供试液色谱的对照品溶液；
3、黄明胶和杂皮胶样品溶液的制备：
同阿胶样品溶液的制备。
4、阿胶样品三相供试液的高效液相色谱测定
(1)、色谱条件：
色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为乙腈-水，梯度洗脱(中间相、轻相、重相供试液采用的洗脱梯度分别为：0min→20min→100min，乙腈(V/V)：1％→1％→10％；0min→5min→10min→20min→40min→60min→110min，乙腈(V/V)：50％→50％→60％→70％→85％→95％→95％；0min→10min→20min→30min→40min→100min→120min，乙腈(V/V)：30％→30％→35％→35％→40％→90％→90％)；柱温：30℃；检测波长为205nm；
(2)、色谱测定：
分别精密吸取轻相、中间相、重相供试液及其对照品溶液，以不同的流动相梯度，按照高效液相色谱法测定，记录100或120分钟的色谱图和三维谱图。
5、黄明胶和杂皮胶样品三相供试液高效液相色谱测定：
同阿胶样品三相供试液高效液相色谱测定。
6、HPLC色谱解析：
对三种胶的HPLC图谱进行对比分析，取同相供试液的色谱图，观察色谱图、三维图整体特征；找出每种胶在一定保留时间范围内的色谱峰数、列出每种胶在一定保留时间范围内的三维图谱数据(仅具紫外末端吸收光谱的色谱峰不计)。
阿胶、黄明胶、杂皮胶中间相供试液的HPLC图谱中，在10～100分钟保留时间内，色谱峰数分别为：42、50、54个。在25～95分钟保留时间内的三维图谱色谱峰数(仅具紫外末端吸收光谱的峰不计)分别为：13、7、18个，其中阿胶三维图谱峰的保留时间(min)及其紫外最大吸收波长(λmax)和最小吸收波长(λmin)数据为：26.71min，λmax274nm，λmin238nm；37.97min，λmax270nm，λmin250nm；38.74min，λmax274nm、222 nm，λmin258nm、214nm；44.20min，λmax250nm，λmin222nm；54.27min，λmax262nm，λmin234nm；57.06min，λmax274nm，λmin242nm；69.51min，λmax246nm，λmin234nm；71.33min，λmax254nm，λmin226nm；75.85min，λmax254nm，λmin226nm；76.86min，λmax274nm，λmin242nm；81.86min，λmax270nm，λmin242nm；89.05min，λmax262nm，λmin234nm；92.28min，λmax262nm，λmin242nm；
阿胶、黄明胶、杂皮胶轻相供试液的HPLC图谱中，在10～110分钟保留时间内，色谱峰数分别为：51、51、56个；在50～65分钟保留时间内的三维图谱色谱峰数(仅具紫外末端吸收光谱的峰不计)分别为：19、11、18个，其中阿胶三维图谱色谱峰的保留时间(min)及其紫外最大吸收波长(λmax)和最小吸收波长(λmin)数据为：50.39min，λmax236nm，λmin212nm；51.19min，λmax232nm，λmin208nm；51.94min，λmax232nm，λmin204nm；52.73min，λmax232nm，λmin204nm；54.13min，λmax276nm、232nm，λmin272nm、212nm；54.37min，λmax268nm、232nm，λmin264nm、212nm；54.69min，λmax232nm，λmin204nm；55.06min，λmax280nm、228nm，最λmin256nm、216nm；56.53min，λmax232nm；57.77min，λmax308nm，272nm、230nm，λmin284nm、216nm；58.63min，λmax232nm，λmin204nm；59.15min，λmax276nm，λmin232nm；59.77min，λmax276nm，λmin224nm；60.43 min，λmax276nm，λmin232nm；61.56min，λmax为276nm，λmin228nm；62,09min，λmax222nm，λmin216nm；62.57min，λmax276nm、224nm，λmin264nm、216nm；63.87min，λmax276nm、220nm，λmin256nm、216nm；64.67min，λmax224nm，λmin212nm；
阿胶、黄明胶、杂皮胶重相供试液的HPLC图谱中，在25～110分钟保留时间内，色谱峰数分别为：48、44、48个。在25～100分钟保留时间内的三维图谱色谱峰数(仅具紫外末端吸收光谱的峰不计)分别为：12、15、24个，其中阿胶三维图谱色谱峰的保留时间(min)及其紫外最大吸收波长(λmax)和最小吸收波长(λmin)数据为：25.98min，λmax252nm，λmin240nm；61.72min，λmax324nm、228nm，λmin 268nm、216nm；79.12min，λmax224nm，λmin220nm；86.12min，λmax284nm、240nm，λmin272nm、212nm；90.04min，λmax276nm、224nm，λmin260nm、216nm；90.44min，λmax276nm、224nm，λmin260nm、216nm；91.58min，λmax216nm，λmin212nm；92.24min，λmax212nm，最λmin208nm；93.66min，λmax212nm，λmin208nm；94.51min，λmax256nm、212nm，λmin248nm、208nm；95.91min，λmax212nm，λmin208nm；97.11min，λmax272nm、220nm，λmin 248nm、212nm；
如上所述，利用三相供试液的图谱和数据或任意两相供试液的图谱和数据或任意一相供试液的图谱和数据，均可对阿胶的真伪做出明确的判断。
在上述的采用三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶的方法中，所述的阿胶是任何一种药剂学上所说的阿胶剂型。
在上述的采用三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶的方法中，所述的阿胶供试品溶液的制备也包括用中间相与轻相组成的两相静态萃取体系制备的中间相、轻相供试液和中间相与重相组成的两相静态萃取体系制备的中间相、重相供试液。
在上述的采用三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶的方法中，所述的轻相溶剂是正己烷或环己烷或戊烷或庚烷或石油醚或乙醚；中间相溶剂是水或体积百分比为1％～50％乙醇或1％～50％甲醇或1％～50％乙腈；重相溶剂是氯仿或二氯甲烷或异戊醇。
其中，所述的轻相溶剂优选是正己烷或环己烷；中间相溶剂优选是水；重相溶剂优选是氯仿。
在上述的采用三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶的方法中，所述的轻相∶中间相∶重相的体积比优选为：1∶1∶1或1∶1∶2。所述的静置萃取时间优选是20小时～30小时。所述萃取过的中间相溶液，优选以3000转/分离心6分钟的条件进行分离。
在上述的应用三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶的方法中，结果判定标准，以阿胶、黄明胶、杂皮胶为例，其中间相供试液的HPLC图谱中，在10～100分钟保留时间内，色谱峰数分别为：42、50、54个；在25～95分钟保留时间内的三维图谱色谱峰数(仅具紫外末端吸收光谱的峰不计)分别为：13、7、18个；其轻相供试液的HPLC图谱中，在10～110分钟保留时间内，色谱峰数分别为：51、51、56个；在50～65分钟保留时间内的三维图谱色谱峰数(仅具紫外末端吸收光谱的峰不计)分别为；19、11、18个；其重相供试液的HPLC图谱中，在25～110分钟保留时间内，色谱峰数分别为：48、44、48个；在25～100分钟保留时间内的三维图谱色谱峰数(仅具紫外末端吸收光谱的峰不计)分别为：12、15、24个。
本发明的原理是鉴于阿胶成分的多样性和复杂性，采用通常的液——液萃取方法会产生严重的乳化现象，难以分层和相分离，容易造成色谱分离度及重现性差，致使鉴别工作无法完成的情况而采用的一种样品预处理方法——液——液——液三相静态萃取法。根据相似相溶原理和分子扩散作用，将样品溶于中间相溶剂，由中间相溶液与重相和轻相溶剂组成三相萃取体系，在静止状态下，不同极性的分子被相应极性的溶剂所萃取。假设视三种溶剂萃取物互为杂质，那么通过萃取，即可得到三种极性不同的“纯净”组分，这样不仅巧妙解决了样品的精制和纯化问题、也有效消除了通常萃取方法产生的严重乳化现象。对三相萃取物的HPLC色谱测定，相当于延长了有效保留时间、提高了检测灵敏度、改善了色谱峰的分离度和对称性，可使特征峰充分分离出来，以达到图谱美观、鉴别特征明显之目的。
本发明的优点如下：
1、阿胶样品轻相、中间相、重相萃取物的高效液相色谱，代表了阿胶主要活性成分。对三相溶剂萃取物进行色谱测定，就能实现在更宽的极性范围和更长的保留时间内寻找发现阿胶的特征性成分，以三相溶剂萃取物的三种色谱图，能够准确地对阿胶进行真伪鉴别并综合性地表达其内在质量。因此，采用液——液——液三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶。
2、采用三相静态萃取法制备样品溶液，是基于阿胶复杂的化学组成，在分析测试前对不同极性成分采取的分离、富集方法。将阿胶样品溶解于中间相，通过中间相与重相和轻相的界面，阿胶中的非极性分子向轻相扩散，弱极性分子向重相扩散，极性分子则留在中间相。假设阿胶的三相溶剂萃取物互为杂质，亦即把其中任何两相萃取物均可看作是另一相萃取物色谱测定的干扰物质，那么通过三相萃取，即相当于三相溶剂萃取物中的每一相都得到精制，因此可极大幅度减少色谱测定的干扰物质。通过对样品的三相萃取物的色谱测定，可使各相萃取物中的组分在色谱中得到充分分离。这样，有利于建立理想的色谱条件，提高检测灵敏度、改善色谱峰的分离度和对称性、降低基线漂移和减少不规则峰的数量，获得鉴别特征显著的、整体面貌美观的色谱图。
附图说明
图1.1阿胶样品中间相萃取物HPLC谱图(15～100分钟)
图1.2黄明胶样品中间相萃取物HPLC谱图(15～100分钟)
图1.3杂皮胶样品中间相萃取物HPLC谱图(15～100分钟)
图1.4对照品HPLC谱图。左：DL-酪氨酸；右：DL-β-苯丙氨酸(参照物)
图1.5阿胶样品中间相萃取物HPLC三维谱图(15～95分钟)
图1.6黄明胶样品中间相萃取物HPLC三维谱图(15～95分钟)
图1.7杂皮胶样品中间相萃取物HPLC三维谱图(15～95分钟)
图2.1阿胶样品轻相萃取物HPLC三维谱图(50～65分钟)
图2.2黄明胶样品轻相萃取物HPLC三维谱图(50～65分钟)
图2.3杂皮胶样品轻相萃取物HPLC三维谱图(50～65分钟)
图3.1阿胶样品重相萃取物HPLC三维谱图(25～100分钟)
图3.2黄明胶样品重相萃取物HPLC三维谱图(25～100分钟)
图3.3杂皮胶样品重相萃取物HPLC三维谱图(25～100分钟)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
实施例1阿胶HPLC图谱的测定
1仪器与试药
1.1仪器
安捷伦1100高效液相色谱仪；安捷伦DAD二极管阵列紫外检测器；安捷伦化学工作站。
1.2试药
DL-β-苯丙氨酸、DL-酪氨酸、胆红素对照品，层析纯，购自山东省医药公司；槲皮素标准品，购自中国药品生物制品检定所；乙腈(进口)，色谱纯；高纯水；氯仿、正己烷、无水乙醇，均为分析纯；阿胶、黄明胶和杂皮胶系山东省聊城市药检所提供。
2色谱条件
色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为乙腈-水，梯度洗脱(中间相、轻相、重相供试液采用的洗脱梯度分别为：0min→20min→100min，乙腈(V/V)：1％→1％→10％；0min→5min→10min→20min→40min→60min→110min，乙腈(V/V)：50％→50％→60％→70％→85％→95％→95％；0min→10min→20min→30min→40min→100min→120min，乙腈(V/V)：30％→30％→35％→35％→40％→90％→90％)；柱温：30℃；检测波长为205nm；理论塔板数以DL-β-苯丙氨酸峰计算，应不低于2500。
3阿胶色谱测定：
3.1阿胶样品溶液的制备：
3.1.1样品溶解
取过4号筛的阿胶粉末200mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水(中间相溶剂)至刻度，置超声清洗仪中超声15分钟使溶解。
3.1.2萃取
精密量取氯仿(重相溶剂)20ml，置50ml锥形分液漏斗中，先沿壁缓缓加入上述溶解好的阿胶水溶液，再沿壁缓缓加入20ml正己烷(轻相溶剂)，静置萃取30小时。
3.1.3样品溶液制备
静置萃取后，进行相分离，将重相萃取溶液和轻相萃取溶液分别置水浴上蒸干，残渣分别加入无水乙醇溶解并定容至1ml，即得样品的重相和轻相供试液；将中间相溶液置离心管中，3000转离心6分钟，取上清液作为中间相供试液。
3.2黄明胶和杂皮胶样品溶液的制备
同上述阿胶样品溶液的制备。
3.3对照品溶液的制备
3.3.1中间相供试液测定用对照品溶液
取DL-β-苯丙氨酸和DL-酪氨酸各适量，分别加水制成每1ml中含5.0mg的溶液。
3.3.2轻相供试液测定用对照品溶液
取胆红素适量，加无水乙醇制成每1ml中含1.0mg的溶液。
3.3.3重相供试液测定用对照品溶液
取槲皮素适量，加无水乙醇制成每1ml中含5.0mg的溶液。
3.4阿胶色谱测定
3.4.1中间相供试液的测定，精密吸取阿胶样品中间相供试液及对照品溶液，照高效液相色谱法测定(流动相梯度起始和终止体积比为1∶99和90∶10)，记录100分钟的色谱图和三维谱图。选用DL-β-苯丙氨酸为参照物(S)。以DL-β-苯丙氨酸的色谱峰(S峰)的相对保留时间为1计算其它色谱峰的相对保留时间。
3.4.2轻相供试液的测定，精密吸取阿胶样品轻相供试液及对照品溶液，照高效液相色谱法测定，记录120分钟的色谱图和三维谱图。选用胆红素为参照物(S)。以胆红素的色谱峰(S峰)的相对保留时间为1计算其它色谱峰的相对保留时间。
3.4.3重相供试液的测定，精密吸取阿胶样品重相供试液及对照品溶液，照高效液相色谱法测定，记录120分钟的色谱图和三维谱图。选用槲皮素为参照物(S)。以槲皮素的色谱峰(S峰)的相对保留时间为1计算其它色谱峰的相对保留时间。
4黄明胶和杂皮胶色谱测定
同阿胶色谱测定。
5阿胶色谱解析：
通过阿胶、黄明胶、杂皮胶色谱的测定，比较其色谱图，列出色谱和三维图谱数据，见表1～表3。
表1阿胶、黄明胶、杂皮胶中间相萃取物三维图谱数据(25～95分钟)
| 样品 | 峰号 | 保留时间(min) | 光谱数据 | ||
| λmax(强度) λmin(强度) | λmax(强度) | λmin(强度) | |||
| 阿 | 1 | 26.71 | 274(10.31) 238(0.70) | ||
| 2 | 37.97 | 270(3.21) 250(2.53) | |||
| 3 | 38.74 | 274(1.50) 258(0.67) | 222(7.99) | 214(7.39) | |
| 4 | 44.20 | 250(9.50) 222(4.00) | |||
| 5 | 54.27 | 262(4.99) 234(1.96) | |||
| 6 | 57.06 | 274(7.50) 242(0.55) | |||
| 7 | 69.51 | 246(1.75) 234(1.13) | |||
| 胶 | 8 | 71.33 | 254(9.88) | 226(3.48) | ||
| 9 | 75.85 | 254(1.52) | 226(0.90) | |||
| 10 | 76.86 | 274(4.64) | 242(0.72) | |||
| 11 | 81.86 | 270(3.07) | 242(1.07) | |||
| 12 | 89.05 | 262(4.42) | 234(1.94) | |||
| 13 | 92.28 | 262(2.32) | 24Z(1.717) | |||
| 黄明胶 | 1 | 38.13 | 276(2.05) | 248(0.57) | 224(11.80) | 216(11.04) |
| 2 | 43.36 | 252(5.04) | 224(2.01) | |||
| 3 | 53.46 | 268(2.53) | 240(0.97) | |||
| 4 | 70.89 | 256(1.26) | 236(0.12) | |||
| 5 | 75.35 | 256(2.27) | 236(0.52) | |||
| 6 | 81.61 | 268(2.85) | 236(0.00) | |||
| 7 | 92.17 | 260(1.98) | 236(0.00) | |||
| 杂皮胶 | 1 | 26.5 | 272(1.97) | 240(0.64) | ||
| 2 | 28.69 | 252(2.27) | 232(1.41) | |||
| 3 | 37.12 | 272(4.75) | 256(3.74) | |||
| 4 | 38.06 | 276(1.27) | 260(0.96) | 220(6.98) | 216(6.84) | |
| 5 | 43.13 | 248(12.30) | 224(6.06) | |||
| 6 | 52.28 | 272(1.92) | 244(1.26) | |||
| 7 | 52.76 | 264(6.17) | 232(3.06) | |||
| 8 | 56.23 | 272(2.51) | 244(0.64) | |||
| 9 | 59.07 | 268(1.57) | 244(1.03) | |||
| 10 | 65.13 | 264(1.59) | 240(0.97) | |||
| 11 | 68.33 | 248(3.59) | 228(2.32) | |||
| 12 | 70.15 | 262(14.37) | 224(4.99) | |||
| 13 | 72.42 | 248(1.92) | 240(1.46) | 236(1.66) | 232(1.35) | |
| 14 | 74.71 | 252(3.12) | 232(1.66) | |||
| 15 | 76.24 | 272(1.73) | 232(0.64) | |||
| 16 | 81.31 | 268(3.35) | 240(1.06) | |||
| 17 | 88.42 | 260(3.95) | 232(1.16) | |||
| 18 | 91.67 | 260(2.95) | 232(0.91) |
表2阿胶、黄明胶、杂皮胶轻相萃取物三维图谱数据(50～65分钟)
| 样品 | 峰号 | 相对保留时间(min) | 光谱数据 | |||
| λmax(强度) | λmin(强度) | λmax(强度) | λmin(强度) | |||
| 阿胶 | 1 | 50.39 | 236(19.64) | 212(12.76) | ||
| 2 | 51.19 | 232(21.92) | 208(13.27) | |||
| 3 | 51.94 | 232(79.26) | 204(26.86) | |||
| 4 | 52.73 | 232(83.06) | 204(25.45) | |||
| 5 | 54.13 | 276(8.72) | 272(8.66) | 232(31.38) | 212(21.58) | |
| 6 | 54.37 | 268(9.64) | 264(9.32) | 232(19.38) | 212(15.41) | |
| 7 | 54.69 | 232(28.80) | 204(19.45) | |||
| 8 | 55.06 | 280(8.74) | 256(6.75) | 228(15.14) | 216(28.22) | |
| 9 | 56.53 | 232(153.31) | ||||
| 10 | 57.77 | 308(84.11)220(114.88) | 284(15.32) | 272(30.32) | 212(12.55) | |
| 11 | 58.63 | 232(70.69) | 204(30.06) | |||
| 12 | 59.15 | 276(49.71) | 232(11.50) | |||
| 13 | 59.77 | 276(69.77) | 224(11.06) | |||
| 14 | 60.43 | 276(42.68) | 232(9.19) | |||
| 15 | 61.56 | 276(64.99) | 228(10.02) | |||
| 16 | 62.09 | 220(18.60) | 216(18.52) | |||
| 17 | 62.57 | 276(14.89) | 264(12.78) | 224(88.86) | 216(82.48) | |
| 18 | 63.87 | 276(4.71) | 256(3.68) | 220(8.50) | 216(8.34) | |
| 19 | 64.67 | 224(13.81) | 212(11.82) | |||
| 黄 | 1 | 51.82 | 222(7.23) | 218(7.04) | ||
| 2 | 53.02 | 298(5.45) | 262(2.53) | |||
| 3 | 54.44 | 274(3.52) | 262(3.02) | |||
| 明胶 | 4 | 54.98 | 274(3.93) | 262(3.33) | 214(8.60) | 210(8.49) |
| 5 | 55.67 | 290(2.50) | 266(2.37) | 214(9.43) | 210(9.32) | |
| 6 | 56.34 | 230(17.26) | 206(10.64) | |||
| 7 | 57.60 | 306(22.64)242(22.85) | 282(14.61)234(22.26) | 270(28.72)218(52.52) | 246(22.59) | |
| 8 | 59.60 | 274(6.43) | 242(3.97) | |||
| 9 | 61.32 | 270(6.98) | 234(4.33) | |||
| 10 | 62.38 | 274(11.88) | 262(10.34) | 226(72.55) | 218(69.02) | |
| 11 | 64.49 | 214(8.61) | 210(8.40) | |||
| 杂皮胶 | 1 | 50.29 | 234(16.98) | 210(11.91) | ||
| 2 | 51.87 | 234(62.06) | ||||
| 3 | 52.67 | 234(63.12) | ||||
| 4 | 53.17 | 298(5.65) | 262(2.81) | 218(8.06) | 214(7.81) | |
| 5 | 54.03 | 290(2.75) | 274(2.64) | 230(14.33) | 214(12.40) | |
| 6 | 54.59 | 282(4.06) | 274(3.56) | 226(12.68) | 214(11.42) | |
| 7 | 55.05 | 282(5.20) | 258(4.08) | 218(10.68) | 214(10.23) | |
| 8 | 55.68 | 218(10.82) | 210(10.22) | |||
| 9 | 56.45 | 230(31.35) | 206(14.06) | |||
| 1O | 57.63 | 350(4.80)270(32.06)218(61.01) | 334(4.76)250(26.07) | 306(25.27)242(27.00) | 286(16.30)238(26.67) | |
| 11 | 58.53 | 222(9.75) | 214(8.95) | |||
| 12 | 59.12 | 278(9.04) | 242(5.04) | 218(9.00) | 214(8.62) | |
| 13 | 59.68 | 270(18.07) | 238(6.39) | |||
| 14 | 60.39 | 282(7.27) | 242(3.99) | |||
| 15 | 61.43 | 270(17.42) | 238(6.09) | |||
| 16 | 62.43 | 274(14.42) | 262(12.38) | 226(92.97) | 218(88.44) | |
| 17 | 63.06 | 222(9.58) | 214(9.07) | |||
| 18 | 64.50 | 222(21.02) | 206(13.00) |
表3阿胶、黄明胶、杂皮胶重相萃取物三维图谱数据
| 样品 | 峰号 | 相对保留时间 | 光谱数据 | |||
| (min) | λmax(强度) | λmin(强度) | λmax(强度) | λmin(强度) | ||
| 阿胶 | 1 | 25.98 | 252(3.18) | 240(2.56) | ||
| 2 | 61.72 | 324(213.37) | 268(19.65) | 228(143.74) | 216(117.61) | |
| 3 | 79.12 | 224(8.86) | 220(8.65) | |||
| 4 | 86.12 | 284(3.60) | 272(3.20) | 240(38.58) | 212(12.48) | |
| 5 | 90.04 | 276(5.22) | 260(4.26) | 224(28.638) | 216(27.86) | |
| 6 | 90.44 | 276(8.88) | 264(7.46) | 224(59.28) | 216(55.75) | |
| 7 | 91.58 | 216(7.54) | 212(7.41) | |||
| 8 | 92.24 | 212(10.40) | 208(10.13) | |||
| 9 | 93.66 | 212(11.15) | 208(11.08) | |||
| 10 | 94.51 | 256(2.80) | 248(2.38) | 212(7.65) | 208(7.62) | |
| 11 | 95.91 | 212(10.83) | 208(10.62) | |||
| 12 | 97.11 | 272(38.44) | 248(26.58) | 220(79.59) | 212(75.32) | |
| 黄明胶 | 1 | 50.22 | 214(3.52) | 206(2.01) | ||
| 2 | 81.46 | 214(4.24) | ||||
| 3 | 82.07 | 210(5.76) | ||||
| 4 | 82.66 | 214(7.82) | 206(4.72) | |||
| 5 | 80.06 | 290(2.45) | 282(2.25) | 238(23.71) | 210(3.12) | |
| 6 | 89.14 | 290(1.36) | 278(1.27) | 250(3.39) | 230(2.25) | |
| 7 | 90.01 | 274(4.23) | 266(3.64) | 226(24.96) | 214(22.67) | |
| 8 | 90.41 | 274(8.84) | 262(7.41) | 226(57.39) | 218(53.38) | |
| 9 | 92.46 | 222(4.91) | 206(0.40) | |||
| 10 | 93.58 | 222(8.02) | 206(3.74) | |||
| 11 | 95.67 | 218(4.47) | 206(2.44) | |||
| 12 | 95.88 | 218(4.87) | 206(1.65) | |||
| 13 | 97.03 | 222(4.64) | 210(3.75 | |||
| 14 | 98.64) | 226(4.60) | ||||
| 15 | 99.55 | 218(3.82) | 206(1.58) | |||
| 杂皮胶 | 1 | 53.38 | 286(1.56) | 266(0.99) | 210(17.25) | |
| 2 | 61.62 | 322(75.04)206(61.50) | 270(7.62) | 230(45.25) | 218(39.48) | |
| 3 | 68.60 | 270(3.41) | 258(3.29) | 222(8.99) | 218(8.68) | |
| 4 | 68.71 | 274(3.80) | 250(3.44) | |||
| 5 | 70.95 | 258(4.78) | 242(4.63) | |||
| 6 | 72.10 | 282(4.22) | 258(4.06) | |||
| 7 | 72.82 | 274(5.00) | 270(4.92) | |||
| 8 | 81.40 | 218(12.79) | 206(9.01) | |||
| 9 | 82.23 | 286(3.36) | 270(2.89) | 214(9.95) | 206(9.07) | |
| 10 | 82.67 | 210(12.49) | 206(11.86) | |||
| 11 | 83.23 | 222(8.06) | 214(6.84) | |||
| 12 | 83.92 | 286(4.59)226(8.39) | 270(3.60)214(7.34) | 242(7.43) | 238(7.07) | |
| 13 | 84.99 | 282(4.09) | 270(3.49) | 222(11.88) | 214(9.89) | |
| 14 | 85.12 | 286(3.55) | 270(2.92) | 226(11.65) | ||
| 15 | 86.00 | 282(5.18) | 278(4.29) | 238(43.90) | 214(10.73) | |
| 16 | 87.94 | 266(4.43) | 250(3.68) | 222(6.21) | 206(4.82) | |
| 17 | 88.92 | 282(3.83) | 254(3.76) | 222(8.50) | 214(7.45) | |
| 18 | 89.27 | 266(5.04) | 238(3.97) | 218(5.87) | 214(5.20) | |
| 19 | 90.00 | 274(5.90) | 262(5.32) | 225(30.88) | 214(28.66) | |
| 20 | 90.40 | 274(14.18) | 262(11.72) | 226(77.20) | 214(71.71) | |
| 21 | 91.52 | 222(8.75) | 206(6.20) | |||
| 22 | 92.19 | 274(17.03) | 254(13.44) | 222(41.78) | 214(39.35) | |
| 23 | 93.66 | 224(12.31) | 212(10.52) | |||
| 24 | 97.07 | 274(177.51) | 250(117.37) | 222(346.42) | 210(315.04) |
结果判定：阿胶中间相供试液的HPLC图谱中，在10～100分钟保留时间内，色谱峰数为42个。在25～95分钟保留时间内的三维图谱色谱峰数(仅具紫外末端吸收光谱的峰不计)为13个，其色谱峰的保留时间(min)及其紫外最大吸收波长(λmax)和最小吸收波长(λmin)数据为：26.71min，λmax274nm，λmin238nm；37.97min，λmax270nm，λmin250nm；38.74min，λmax，274nm、222nm，λmin258nm、214nm；44.20min，λmax250nm，λmin222nm；54.27min，λmax262nm，λmin234nm：57.06min，λmax274nm，λmin242nm；69.51min，λmax246nm，λmin234nm；71.33min，λmax254nm，λmin226nm；75.85min，λmax254nm，λmin226nm；76.86min，λmax274nm，λmin242nm；81.86min，λmax270nm，λmin242mn；89.05min，λmax262nm，λmin234nm；92.28min，λmax262nm，λmin242nm；
阿胶轻相供试液的HPLC图谱中，在10～110分钟保留时间内，色谱峰数为51个；在50～65分钟保留时间内的三维图谱色谱峰数(仅具紫外末端吸收光谱的峰不计)为19个，其三维图谱色谱峰的保留时间(min)及其紫外最大吸收波长(λmax)和最小吸收波长(λmin)数据为：50.39min，λmax236nm，λmin212nm；51.19min，λmax232nm，λmin208nm；51.94min，λmax232nm，λmin204nm；52.73min，λmax232nm，λmin204nm；54.13min，λmax276nm、232nm，λmin272nm、212nm；54.37min，λmax268nm、232nm，λmin264nm、212nm；54.69min，λmax232nm，λmin204nm；55.06min，λmax280nm、228nm，最λmin256nm、216nm：56.53min，λmax232nm；57.77min，λmax308nm，272nm、230nm，λmin284nm、216nm；58.63min，λmax232nm，λmin204nm；59.15min，λmax276nm，λmin232nm；59.77min，λmax276nm，λmin224nm；60.43min，λmax276nm，λmin232nm；61.56 min，λmax为276nm，λmin228nm；62,09min，λmax222nm，λmin216nm；62.57min，λmax276nm、224nm，λmin264nm、216nm；63.87min，λmax276nm、220nm，λmin256nm、216nm；64.67min，λmax224nm，λmin212nm；
阿胶重相供试液的HPLC图谱中，在25～110分钟保留时间内，色谱峰数为48个。在25～100分钟保留时间内的三维图谱色谱峰数(仅具紫外末端吸收光谱的峰不计)为：12个，其三维图谱色谱峰的保留时间(min)及其紫外最大吸收波长(λmax)和最小吸收波长(λmin)数据为：25.98min，λmax252nm，λmin240nm；61.72min，λmax324nm、228nm，λmin268nm、216nm；79.12min，λmax224nm，λmin220nm；86.12min，λmax284nm、240nm，λmin272nm、212nm；90.04min，λmax276nm、224nm，λmin260nm、216nm；90.44min，λmax276nm、224nm，λmin260nm、216nm；91.58 min，λmax216nm，λmin212nm；92.24min，λmax212nm，最λmin208nm；93.66min，λmax212nm，λmin208nm；94.51 min，λmax256nm、212nm，λmin248nm、208nm；95.91min，λmax212nm，λmin208nm；97.11min，λmax272nm、220nm，λmin248nm、212nm；
6色谱重现性实验
以阿胶为供试品(N＝5)，参照指纹图谱重现性规定方法操作，分别对共有峰相对保留时间及有规定的共有峰(有规定的共有峰即超过总峰面积10％的指纹峰)的相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。结果见表2
7色谱精密度实验
参照指纹图谱重现性规定方法操作，以阿胶为供试品，取1份，连续进样5次，分别对共有峰相对保留时间及有规定的共有峰(有规定的共有峰即超过总峰面积10％的指纹峰)的相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。
8色谱稳定性实验
参照指纹图谱重现性规定方法操作，以阿胶为供试品，考察24小时溶液稳定，分别对共有峰相对保留时间及有规定的共有峰(有规定的共有峰即超过总峰面积10％的指纹峰)的相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。供试品24小时稳定。
实施例2阿胶HPLC图谱的测定
除与实施例1中3.1.2萃取不同外，其余均相同。
实施例2的萃取方法为：将溶解好的中间相溶液，置50ml锥形分液漏斗中，沿壁缓缓加入20ml环己烷，密封、静置萃取50小时。萃取完成后，进行相分离，将轻相萃取液置水浴上蒸干，残渣加无水乙醇溶解并定容至浓度为1g/ml，作为样品的轻相供试液；将被轻相溶剂萃取过的中间相溶液沿壁缓缓加入另一盛有20ml二氯甲烷的50ml锥形分液漏斗中，密封、静置萃取55小时。萃取后进行相分离，重相萃取溶液置水浴上蒸干，残渣加无水乙醇溶解并定容至浓度为1g/ml，作为样品的重相供试液；将被轻、重相溶剂萃取过的中间相溶液，置离心管中，3500转离心8分钟，取上清液作为中间相供试液。
Claims (5)
1.一种采用液——液——液三相静态萃取高效液相色谱鉴别阿胶的方法，其特征是，主要步骤如下：
第一步，阿胶HPLC图谱测定：
(1)阿胶供试品溶液的制备：
方法a、精密称取过4号筛的阿胶样品粉末，置玻璃容器中，加入中间相溶剂，振摇1～3分钟，置超声清洗器中超声15～20分钟使之溶解，制成20mg/ml的溶液；然后将所述中间相溶液沿壁缓缓加入盛有重相溶剂的容器中，再沿壁缓缓加入轻相溶剂，使轻相∶中间相∶重相的体积比为：1∶1∶1或1∶1∶2或2∶1∶1或1∶2∶1或2∶1∶2；密封、静置萃取6小时～60小时；萃取后进行三相分离，将轻、重相萃取液分别置水浴上蒸干，残渣分别加无水乙醇溶解并定容，作为样品轻、重相供试液；将经轻、重两相溶剂萃取过的中间相溶液，以3000～4000转/分离心5～10分钟，取分离后的上清液作为样品中间相供试液；
或方法b、精密称取过4号筛的阿胶样品粉末，置玻璃容器中，加入中间相溶剂，振摇1～3分钟，置超声清洗器中超声15～20分钟使之溶解，制成20mg/ml的溶液；将轻相溶剂沿壁缓缓加入盛有中间相溶液的容器中，使轻相∶中间相的体积比为：1∶1或2∶1或1∶2；密封、静置萃取6小时～60小时；萃取后进行两相分离，轻相萃取液置水浴上蒸干，残渣加无水乙醇溶解并定容，作为样品的轻相供试液；将被轻相溶剂萃取过的中间相溶液，沿壁缓缓加入盛有重相溶剂的容器中，使中间相溶液∶重相的体积比为：1∶1或1∶2或2∶1；密封、静置萃取6小时～60小时；萃取后进行两相分离，重相萃取溶液置水浴上蒸干，残渣加无水乙醇溶解并定容，作为样品的重相供试液；将先后分别被轻、重相溶剂萃取过的中间相溶液，以3000～4000转/分离心5～10分钟，取分离后的上清液作为样品的中间相供试液；
其中：所述的轻相溶剂是正己烷或环己烷或戊烷；中间相溶剂是水或1％～50％乙醇或1％～50％甲醇；重相溶剂是氯仿或二氯甲烷；
(2)对照品溶液的制备：
取DL-β-苯丙氨酸和DL-酪氨酸，分别加无水乙醇或水配制成5μg/ml的溶液，作为中间相供试液色谱的对照品溶液；
取胆红素加无水乙醇制成1μg/ml的溶液，作为轻相供试液色谱的对照品溶液；
取槲皮素加无水乙醇制成5μg/ml的溶液，作为重相供试液色谱的对照品溶液；
(3)色谱条件：
色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为乙腈-水，梯度洗脱，中间相、轻相、重相供试液采用的洗脱梯度分别为：0分钟→20分钟→100分钟，乙腈(V/V)：1％→1％→10％；0分钟→5分钟→10分钟→20分钟→40分钟→60分钟→110分钟，乙腈(V/V)：50％→50％→60％→70％→85％→95％→95％；0分钟→10分钟→20分钟→30分钟→40分钟→100分钟→120分钟，乙腈(V/V)：30％→30％→35％→35％→40％→90％→90％；柱温：30℃；检测波长为205nm；
(4)测定：
分别精密吸取中间相、轻相、重相供试液及与之对应的对照品溶液，按照高效液相色谱法测定，记录100或120分钟的色谱图和三维谱图；
第二步，以与上述阿胶HPLC图谱测定相同的方法分别测定黄明胶和杂皮胶的HPLC图谱；
第三步，对阿胶、黄明胶、杂皮胶的同相供试液的HPLC图谱进行对比分析，观察色谱图、三维图整体形状的差异；列出每种胶在一定保留时间内的三维图谱数据，其中，色谱峰的紫外吸收光谱仅有末端吸收的不计。
2.如权利要求1所述的阿胶鉴别方法，其特征在于：所述的阿胶是任何一种药剂学上所说的阿胶的剂型。
3.如权利要求1所述的阿胶鉴别方法，其特征在于：所述的三相溶剂萃取相比即轻相∶中间相∶重相体积的比值是：1∶1∶1或1∶1∶2。
4.如权利要求1所述的阿胶鉴别方法，其特征在于：所述的静置萃取，萃取时间为20小时～30小时。
5.如权利要求1所述的阿胶鉴别方法，其特征在于：所述的阿胶、黄明胶、杂皮胶中间相供试液的HPLC图谱中，在10～100分钟保留时间内，色谱峰数分别为：42、50、54个；在25～95分钟保留时间内的三维图谱色谱峰数，其中仅具紫外末端吸收光谱的峰不计，分别为：13、7、18个，其中阿胶三维图谱峰的保留时间及其紫外最大吸收波长(λmax)和最小吸收波长(λmin)数据为：26.71分钟，λmax 274nm，λmin 238nm；37.97分钟，λmax 270nm，λmin 250nm；38.74分钟，λmax 274nm、222nm，λmin 258nm、214nm；44.20分钟，λmax 250nm，λmin 222nm；54.27分钟，λmax 262nm，λmin 234nm；57.06分钟，λmax 274nm，λmin 242nm；69.51分钟，λmax 246nm，λmin 234nm；71.33分钟，λmax 254nm，λmin 226nm；75.85分钟，λmax 254nm，λmin 226nm；76.86分钟，λmax 274nm，λmin 242nm；81.86分钟，λmax 270nm，λmin 242nm；89.05分钟，λmax 262nm，λmin 234nm；92.28分钟，λmax 262nm，λmin 242nm；
所述的阿胶、黄明胶、杂皮胶轻相供试液的HPLC图谱中，在10～110分钟保留时间内，色谱峰数分别为：51、51、56个；在50～65分钟保留时间内的三维图谱色谱峰数，其中仅具紫外末端吸收光谱的峰不计，分别为：19、11、18个，其中阿胶三维图谱色谱峰的保留时间及其紫外最大吸收波长(λmax)和最小吸收波长(λmin)数据为：50.39分钟，λmax 236nm，λmin 212nm；51.19分钟，λmax 232nm，λmin 208nm；51.94分钟，λmax 232nm，λmin 204nm；52.73分钟，λmax 232nm，λmin 204nm；54.13分钟，λmax 276nm、232nm，λmin 272nm、212nm；54.37分钟，λmax 268nm、232nm，λmin 264nm、212nm；54.69分钟，λmax 232nm，λmin 204nm；55.06分钟，λmax 280nm、228nm，λmin 256nm、216nm；56.53分钟，λmax 232nm；57.77分钟，λmax 308nm，272nm、230nm，λmin 284nm、216nm；58.63分钟，λmax 232nm，λmin 204nm；59.15分钟，λmax 276nm，λmin 232nm；59.77分钟，λmax 276nm，λmin 224nm；60.43分钟，λmax 276nm，λmin 232nm；61.56分钟，λmax 为276nm，λmin 228nm；62，09分钟，λmax 222nm，λmin 216nm；62.57分钟，λmax 276nm、224nm，λmin 264nm、216nm；63.87分钟，λmax 276nm、220nm，λmin 256nm、216nm；64.67分钟，λmax 224nm，λmin 212nm；
所述的阿胶、黄明胶、杂皮胶重相供试液的HPLC图谱中，在25～110分钟保留时间内，色谱峰数分别为：48、44、48个；在25～100分钟保留时间内的三维图谱色谱峰数，其中仅具紫外末端吸收光谱的峰不计，分别为：12、15、24个，其中阿胶三维图谱色谱峰的保留时间及其紫外最大吸收波长(λmax)和最小吸收波长(λmin)数据为：25.98分钟，λmax 252nm，λmin 240nm；61.72分钟，λmax 324nm、228nm，λmin 268nm、216nm；79.12分钟，λmax 224nm，λmin 220nm；86.12分钟，λmax 284nm、240nm，λmin 272nm、212nm；90.04分钟，λmax 276nm、224nm，λmin 260nm、216nm；90.44分钟，λmax 276nm、224nm，λmin 260nm、216nm；91.58分钟，λmax 216nm，λmin 212nm；92.24分钟，λmax 212nm，λmin 208nm；93.66分钟，λmax 212nm，λmin 208nm；94.51分钟，λmax 256nm、212nm，λmin 248nm、208nm；95.91分钟，λmax 212nm，λmin 208nm；97.11分钟，λmax 272nm、220nm，λmin 248nm、212nm。
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