CN102466658B

CN102466658B - 一种注射剂中5-羟甲基糠醛含量的测定方法

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Publication number: CN102466658B
Application number: CN201010541638.8A
Authority: CN
Inventors: 杨悦武; 叶正良; 兰淑玲; 周学谦; 周大铮
Original assignee: Tianjin Tasly Zhijiao Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Tianjin Tasly Zhijiao Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2030-11-12
Also published as: CN102466658A

Abstract

本发明涉及一种注射剂中5-羟甲基糠醛含量的测定方法，该方法经过以下步骤：1)注射剂预处理配成样品溶液；2)5-羟甲基糠醛对照品溶液的配制；3)采用高效液相色谱法对样品和对照品进行测定；4)计算样品中5-羟甲基糠醛的含量；其中所述预处理包括过大孔吸附树脂。

Description

一种注射剂中5-羟甲基糠醛含量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种中药注射剂的检测方法，具体涉及一种注射剂中5-羟甲基糠醛含量的测定方法。

背景技术

5-羟甲基糠醛(又名5-羟甲基-2-糠醛、羟甲基糠醛、5-羟甲基呋喃甲醛或5-羟甲基-2-呋喃甲醛)，英文名5-hydroxymethyl-2-furfural、5-hydroxymethyl-furfural或5-HMF，是一种化学物质。

注射剂中特别是含糖的注射剂往往含有杂质5-羟甲基糠醛。一些中药注射剂中因含有糖类物质也可能存在杂质5-羟甲基糠醛，其原因在于中药提取物中含量大量的糖类物质，高温下果糖、葡萄糖及其它糖类物质均易脱水，进一步生成5-羟甲基糠醛及聚合物，可能给机体带来过敏、刺激性。其形成过程中受多种因素的影响，在酸性条件下，加热的时间和温度是首要因素。不论是中药的炮制过程还是注射液的高温灭菌过程均能使5-HMF的含量呈规律性变化，有时其含量的增加与灭菌温度、时间成正比。另外，高温状态下，存在溶液的电解质价数越高，分解产生的5-HMF量越多^[3]。目前5-HMF研究主要集中在检测牛乳、果汁、蜂蜜、酒类和药物中5-HMF的含量，其含量的多少是反映这些物品内在质量的重要指标。

有研究利用结肠致癌剂造模的45F344雄性大鼠进行实验，结果发现，对糖进行加热后如能产生含量为1％的5-HMF，就有可能引发并促进结肠小囊异常生长(ACF)^[4]。另有研究显示5-HMF还可产生一定程度的基因毒性，推测其机制可能为5-HMF在体内经过硫化和氯化的过程而产生的致突变作用^[5]。此外，5-HMF对人体横纹肌和内脏有毒副作用。5-HMF由静脉入血后会产生副作用^[6]。故在中国药典^[7]、中国医院制剂规范^[8]中分别限定了葡萄糖、果糖注射液中5-HMF的含量。有关5-HMF的药理作用一直以来存有争议，有报道5-HMF有一定程度的毒副作用，但近年来研究表明其还具有抗氧化、改善血液流变学等对人体有利的作用。

5-HMF的检测方法和含量测定方法的研究也较多，其在284nm处有最大吸收。UV-可见分光光度法^[9]是较为普遍的测定方法。近年来HPLC的应用克服了5-HMF和其他成分在同一波长处(284nm)有吸收的问题，从而能够更准确的测定其含量和控制注射液的质量。

由于中药注射液和含糖的注射剂是临床常用的制剂，其质量的优劣直接关系到人民的身体健康，因此药典中对其相关杂质含量作出了明确规定。如5-羟甲基糠醛(5HMF)的含量，一直以来，生产中对5-HMF的控制或工艺上掌握不好，严重超标。因此控制注射剂中杂质5-羟甲基糠醛的含量是一项重要课题。

发明内容

本发明提供了一种注射剂中5-羟甲基糠醛含量的测定方法，该方法简捷、快速、准确，可以适用于任何可能含有5-羟甲基糠醛的注射剂，包括注射液，注射乳剂和粉末注射剂等，例如生脉注射液、葡萄糖大输液、注射用益气复脉冻干制剂等，特别适合于注射用益气复脉冻干制剂。

本发明的注射剂中5-羟甲基糠醛含量测定方法，经过以下步骤：

(1)注射剂预处理配成样品溶液；

(2)5-羟甲基糠醛对照品溶液的配制；

(3)采用高效液相色谱法对样品和对照品进行测定；

(4)计算样品中5-羟甲基糠醛的含量。

其中所述预处理包括注射剂配成溶液过大孔吸附树脂，用醇洗脱，得到洗脱溶液，所述的大孔吸附树脂优选聚苯乙烯类树脂，更优选ProElut^TMSPE、Cleanert^TMSPE、Strata^TM-X或AB-8树脂。所述醇选自乙醇和甲醇，优选40％甲醇。

优选的预处理方法如下；取注射剂(若为粉末剂则用水溶解，若为液体制剂则直接上样)，上预先处理好的大孔吸附树脂，用少量水冲洗，弃取流出液；再以甲醇洗脱，洗脱液收集于10ml量瓶中至刻度后，混匀后用0.45um滤膜过滤，取滤液供分析用。

本发明所述的方法，用高效液相色谱检测时，对照品上样时优选用甲醇作溶剂。

本发明所述的方法，优选用两瓶注射用益气复脉冻干制剂作为样品。

本发明所述的方法，大孔吸附树脂柱的参数优选为内径6～8mm，柱高5cm，速度为1ml/ml。

本发明所述的方法，其中步骤(3)对样品和对照品进行测定时采用symmetryR，色谱柱，规格为250mm*4.5mm；5μ；检测波长为284nm；柱温为30℃；以甲醇-水为流动相：

进行梯度洗脱，

时间，分钟	流量	水	甲醇
				0	1	95	5
3	1	95	5
				4	1	90	10
13	1	90	10
				15	1	50	50
20	1	0	100
				23	1	0	100
27	1	50	50
				30	1	95	5
33	1	95	5

根据色谱峰，采用归一法计算5-羟甲基糠醛的含量。

本发明通过对样品预处理，将注射剂中5-羟甲基糠醛纯化，以便能够使用HPLC进行检测，该方法简捷、快速、准确，可以在生产过程中的每一步进行时时监测，可以适用于任何含有5-羟甲基糠醛的注射剂，特别适合于中药注射剂，如注射用益气复脉冻干制剂。

本发明采用的方法和实验条件是经过筛选获得的，能够达到精确测定的目的，以下为本发明的筛选过程：

◆高效液相色谱仪(Waters2695-waters2996PAD)

◆样品与对照：5-羟甲基糠醛对照品(购自中国药品生物制品检定所批号111626-200503)；益气复脉制剂(由天津天士力之骄药业有限公司提供，0.65g规格)。生脉注射液(市购)；5％葡萄糖大输液(市购)。

◆样品预处理小柱及填料：AB-8大孔吸附树脂(80～100目，购于天津南开合成科技有限公司)、聚苯乙烯型商品小柱：ProElut^TMSPE(6ml，0.5g，迪马科技有限公司)、Cleanert^TMSPE(6ml，0.5g，天津博纳艾杰尔科技有限公司)和Strata^TM-X(6ml，0.5g，广州菲罗门科学仪器有限公司)。

◆试剂甲醇(德国MERCK色谱纯)超纯水(公司自制)乙酸乙酯(分析纯购自天津化学试剂厂)

◆对照品溶液的配制

■精密称取5-羟甲基糠醛对照品1.03mg，置于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成0.103mg/ml的储备液，置于4℃冰箱中冷藏保存：临用时稀释使用。

色谱分离系统的优化研究

1.样品初步预处理

根据文献记载，5-羟甲基糠醛能被乙酸乙酯萃取。取注射用益气复脉冻干制剂2瓶，加水10ml溶解后，以乙酸乙酯5ml萃取、离心，取乙酸乙酯层，用0.45μm滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液，供HPLC分析用。

2.色谱分离系统1

(1)色谱法(《中国药典》2005版一部附录Ⅵ D)要求进行测定。

(2)色谱条件与系统适用性试验采用water’s公司的symmetryR(250mm*4.5mm；5μ)色谱柱；以5％甲醇为流动相，流速1ml/min，检测波长为284nm；柱温为30℃；

(3)测定法分别精密吸取对照品溶液10μl及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

3.色谱分离系统2

(1)色谱法(《中国药典》2005版一部附录Ⅵ D)要求进行测定。

(2)色谱条件与系统适用性试验采用water’s 公司的symmetryR((250mm*4.5mm；5μ)色谱柱；以甲醇-水为流动相(见表1)，检测波长为284nm；柱温为30℃；

表1.注射用益气复脉冻干制剂中的5-羟甲基糠醛分离系统2的条件

4.色谱分离系统3

(1)色谱法(《中国药典》2005版一部附录VI D)要求进行测定。

(2)色谱条件与系统适用性试验采用water’s 公司的symmetryR(250mm*4.5mm；5μ)色谱柱；以甲醇-水为流动相(见表2)，检测波长为284nm；柱温为30℃；

表2注射用益气复脉冻干制剂中的5-羟甲基糠醛分离系统3

时间	流量	水	甲醇
				0	1	95	5
3	1	95	5
				4	1	90	10
13	1	90	10
				15	1	50	50
20	1	0	100
				23	1	0	100
27	1	50	50
				30	1	95	5
33	1	95	5

5.结果及分析

(1)文献数据均认为，5-羟甲基糠醛在284nm处有最大吸收，采用反相填料色谱柱，用5％甲醇等度洗脱；因此，试验中沿用此色谱条件进行分离，由于5-羟甲基糠醛开始采用甲醇溶解，而样品采用乙酸乙酯萃取直接进样，结果发现5-羟甲基糠醛的保留时间相差很大，十分明显(见图1.a)。当5-羟甲基糠醛采用乙酸乙酯溶解进样时，保留时间一致，但可以明显可看出，5-羟甲基糠醛峰形较宽且分叉，表明乙酸乙酯作为溶剂不合适(见图1.b和图1.C)；

(2)通过比较色谱分离系统1、2和3，认为色谱系统3进行注射用益气复脉冻干制剂中的5-羟甲基糠醛分离时，不仅保留时间适中，峰形对称且尖锐，前后组分色谱峰均达到基线分离(见图2)，满足含量测定的需要。因此，色谱分离系统3选为注射用益气复脉冻干制剂中的5-羟甲基糠醛分离的色谱洗脱系统。

(3)此外，5-羟甲基糠醛色谱峰的保留时间仅约10分钟，即在5～10％甲醇时就已经出峰；由于甲醇比例低，色谱柱中有大量的组分未被洗脱，为了保证滞后组分不对下次色谱进样的色谱行为带来影响，在5-羟甲基糠醛组分出峰后，适当增加甲醇比例，将之后成分冲洗出来(见图1)，并恢复至下次色谱分离的起始洗脱的流动相浓度，既保证了5-羟甲基糠醛等组分的分离，减少了干扰，又保证了色谱分离的稳定性，为5-羟甲基糠醛的含量测定方法的建立提供了很好的保证。

(4)在色谱系统的优化研究时，对5-羟甲基糠醛及样品溶解用的溶剂进行了选择。考虑到萃取溶剂为乙酸乙酯及大孔吸附树脂柱处理样品的洗脱溶剂为甲醇-水等及色谱洗脱系统为甲醇-水系统，为减少挥发-转移等处理过程，考察了乙酸乙酯和甲醇溶解5-羟甲基糠醛和样品。试验发现，甲醇溶解的样品与乙酸乙酯溶解的样品，进样后色谱行为不完全一致(见图2)，前者中的5-羟甲基糠醛色谱峰的保留时间略长，色谱峰尖锐且对称，而后者中的5-羟甲基糠醛色谱峰的保留时间短，色谱峰形宽且分叉，可能是乙酸乙酯为非极性溶剂，进入色谱柱后由于其疏水性，改变了色谱柱的分配行为而导致色谱峰形的展宽。因此，选择甲醇作为5-羟甲基糠醛及样品制备的溶剂。

样品预处理方法的优化选择研究

1.色谱分离系统

(1)色谱法(《中国药典》2005版一部附录ⅥD)要求进行测定。

(2)色谱条件与系统适用性试验采用water’s 公司的symmetry^R(250mm*4.5mm；5μ)色谱柱；以甲醇-水为流动相(见表2)，检测波长为284nm；柱温为30℃；

注射用益气复脉冻干制剂中的5-羟甲基糠醛分离系统3(同表2)

时间	流量	水	甲醇
				1	1	95	5
3	1	95	5
				4	1	90	10
13	1	90	10
				15	1	50	50
20	1	0	100
				23	1	0	100
27	1	50	50
				30	1	95	5
33	1	95	5

2.不同酸碱性条件下样品中5-羟甲基糠醛乙酸乙酯萃取优化的选择

(1)样品预处理1：取益气复脉制剂1瓶，用0.5mol/L的氢氧化钠2ml溶解转移至10ml离心管中，再用5ml乙酸乙酯分次荡洗制剂西林瓶并转移至10ml离心管中，强烈振摇1min后，与3000rpm/min离心5min，吸取上层乙酸乙酯溶液转移并定容至5ml容量瓶中.进液相检测前0.45μm滤膜过滤，取续滤液供HPLC分析用。

(2)取益气复脉制剂1瓶，用0.1mol/L的盐酸2ml溶解转移至10ml离心管中，再用5ml乙酸乙酯分次荡洗制剂西林瓶并转移至10ml离心管中，强烈振摇1min后，与3000rpm/min离心5min，吸取上层乙酸乙酯溶液转移并定容至5ml容量瓶中.进液相检测前0.45μm滤膜过滤，取续滤液供HPLC分析用。

(3)结果及分析

1)试验表明，酸性条件下采用乙酸乙酯萃取5-羟甲基糠醛类物质的效果较碱性条件下萃取完全(见图3)，可能是5-羟甲基糠醛类物质，由于5-羟甲基受呋喃环的吸电子效应的影响，在强碱性条件下易成盐而难于被萃取。

2)其处理的样品色谱图见图3。从色谱图中可以看出，酸性条件下萃取的样品5-羟甲基糠醛的色谱峰强度远高于碱性条件下萃取的样品。因此，酸性条件下更适合5-羟甲基糠醛类物质的萃取。

3.样品预处理方式的选择

(1)方法1：样品中5-羟甲基糠醛乙酸乙酯萃取：取注射用益气复脉冻干制剂一瓶，用0.1mol/L盐酸5ml溶解转移至10ml离心管中，再加入乙酸乙酯萃取3次每次5ml，于3000rpm/min离心5min，吸取上清液合并，0.45um滤膜过滤，取续滤液供HPLC分析用。

(2)方法2：样品中5-羟甲基糠醛大孔吸附树脂吸附-乙酸乙酯洗脱：取注射用益气复脉冻干制剂1瓶，用水溶解后，上预先处理好的商品树脂柱(目数80目)柱顶端(柱内径6～8mm，树脂柱高约5cm)过柱，速度为约1ml/ml，然后继续用少量水冲洗，弃取流出液；再以乙酸乙酯约5ml洗脱，收集洗脱液于10ml离心管中，于3000rpm/min离心5min，吸取上清液0.45um滤膜过滤，取续滤液供HPLC分析用。

(3)结果及分析

1)从试验中看出，采用大孔吸附树脂柱吸附样品中的5-羟甲基糠醛类物质，然后采用乙酸乙酯洗脱，然后直接用乙酸乙酯洗脱液离心后进样，与酸性条件下乙酸乙酯直接萃取得到的萃取液离心后直接进样，可以看出，大孔吸附树脂处理的样品溶液中的5--羟甲基糠醛的色谱峰强度明显高(见图

4)。原因可能是5-羟甲基糠醛类物质的水溶性很强，乙酸乙酯需要萃取多次，否则难于保证萃取完全。而大孔吸附树脂吸附保留较完全，能够被乙酸乙酯洗脱，由于洗脱时带入少量的水溶液，溶入水溶液的量较少，故色谱强度较高。

2)此外，为了证实是否因5-羟甲基糠醛的水溶性较大，用乙酸乙酯进行多次萃取并分别进样，发现第四次萃取液中仍有约2％的5-羟甲基糠醛物质，表明5-羟甲基糠醛水溶性较大，分配系数小，需要乙酸乙酯多次萃取才能完全。同时，如对有机溶媒萃取液蒸干，也发现5-羟甲基糠醛色谱峰强度下降，表明5-羟甲基糠醛有类似挥发油的性质，进一步说明萃取方法处理样品不是一种好的方法。

3)样品用乙酸乙酯溶解进样时，5-羟甲基糠醛色谱峰形较差，可能与乙酸乙酯的蔬水性有关，因此不适合作为对照品及处理后的样品溶解的溶剂使用。

4.样品中5-羟甲基糠醛大孔吸附树脂吸附-洗脱溶剂的选择

(1)30％甲醇洗脱取注射用益气复脉冻干制剂1瓶，用水溶解后，上预先处理好的商品树脂柱(目数80目)柱顶端(柱内径6～8mm，树脂柱高约5cm)过柱，速度为约1ml/ml，然后继续用少量水冲洗，弃取流出液；再以30％甲醇洗脱，分别收集2份洗脱液于各5ml量瓶中至刻度后，继续用甲醇洗脱，洗脱液于5ml量瓶中至刻度；混匀后各用0.45um滤膜过滤，取续滤液供HPLC分析用。结果见图5。

(2)40％甲醇洗脱取注射用益气复脉冻干制剂1瓶，用水溶解后，上预先处理好的商品树脂柱(目数80目)柱顶端(柱内径6～8mm，树脂柱高约5cm)过柱，速度为约1ml/ml，然后继续用少量水冲洗，弃取流出液；再以40％甲醇洗脱，分别收集洗脱液于各5ml量瓶中至刻度后，继续用甲醇洗脱，洗脱液于10ml量瓶中至刻度；混匀后各用0.45um滤膜过滤，取续滤液供HPLC分析用。结果见图6。

(3)从图4、图5和6中的样品色谱图可以看出，5-羟甲基糠醛类物质能够被大孔吸附树脂很好的吸附，但洗脱时，30％的甲醇以10ml洗脱时，不能将5-羟甲基糠醛类物质完全洗脱；而40％甲醇10ml洗脱，则能完全将5-羟甲基糠醛类物质完全洗脱。因此，综合考察乙酸乙酯、30％甲醇与40％甲醇洗脱的效果及能力，最优选以40％为洗脱溶剂。

(4)另外，考虑5-羟甲基糠醛类物质的色谱峰有一定的强度，减少检测的测定误差，试验中采用注射用益气复脉冻干制剂2瓶量，进行处理和测定，具有同样的效果，色谱峰强度增加一倍，基线也更稳定，测定误差减少了。因此，优选采用2瓶制剂进行预处理。

5.不同大孔吸附树脂柱对5-羟甲基糠醛类物质吸附的影响

(1)取注射用益气复脉冻干制剂2瓶，加水10ml溶解后，分别上预先处理好的商品树脂柱或自填AB-8树脂小柱顶端(柱内径6～8mm，)过柱，速度为约1ml/ml，然后继续用少量水冲洗，弃取流出液；再以40％甲醇洗脱，洗脱液收集于10ml量瓶中至刻度后，混匀后用0.45um滤膜过滤，取续滤液按给定的色谱条件进行分析、测定。

(2)实验测定结果是一致的，均值为65.8ug/瓶，RSD％＝1.8％，表明不同品牌的大孔吸附树脂商品柱及自填大孔吸附树脂小柱处理样品，对其5-羟甲基糠醛含量测定没有影响。其色谱图见图7

附图说明

图1.显示注射用益气复脉冻干制剂中的5-羟甲基糠醛色谱分离条件的优化选择

图1a显示以甲醇作为溶剂的5-羟甲基糠醛对照品(见上图)比以乙酸乙酯(见下图)作为溶剂的样品的保留时间长

图1b显示以乙酸乙酯作为溶剂时，5-羟甲基糠醛对照品(上图)和样品(下图)的保留时间一致，但5-羟甲基糠醛峰形较宽且分叉

图1c显示5-羟甲基糠醛乙酸乙酯溶液峰形较宽且分叉

图2.显示溶剂对注射用益气复脉冻干制剂的5-羟甲基糠醛色谱行为的影响

图2a显示用乙酸乙酯溶解的注射用益气复脉冻干制剂的色谱图，5-羟甲基糠醛色谱峰的保留时间较短，色谱峰形宽且分叉

图2b显示用乙酸乙酯溶解的5-羟甲基糠醛的色谱图，5-羟甲基糠醛色谱峰的保留时间短，色谱峰形宽且分叉

图2c显示用甲醇溶解的5-羟甲基糠醛的色谱图，5-羟甲基糠醛色谱峰的保留时间略长，色谱峰尖锐且对称

图2d显示用乙酸乙酯溶剂的色谱图

图3.不同酸碱性条件对5-羟甲基糠醛类萃取的影响

图4.大孔吸附树脂吸附-乙酸乙酯洗脱与乙酸乙酯萃取处理样品溶液的比较上图是酸性条件下乙酸乙酯萃取的样品，峰面积是271080下图是大孔吸附树脂吸附-乙酸乙酯洗脱样品，峰面积是312162

图5.大孔吸附树脂吸附时30％为甲醇洗脱剂对5-羟甲基糠醛吸附洗脱的影响上图是30％甲醇第一次洗脱的结果，峰面积是365231，占总量的比例为75.50％中图是30％甲醇第二次洗脱的结果，峰面积是108143，占总量的比例为22.40％下图是100％甲醇洗脱的结果，峰面积是10358，占总量的比例为2.14％

图6.显示大孔吸附树脂吸附时40％为甲醇洗脱剂对5-羟甲基糠醛吸附洗脱的影响

上图是100％甲醇洗脱的结果，峰面积小于积分阈值

下图是40％甲醇第一次洗脱的结果，峰面积是489937

图7.不同品牌大孔吸附树脂柱对5-羟甲基糠醛类物质的吸附影响(批号：20080701)

图8.注射用益气复脉冻干制剂及5-羟甲基糠醛对照品色谱图

图9.红参、麦冬和五味子提取物的色谱图

上图是红参提取物

上图是麦冬提取物

下图是五味子提取物

图10本发明方法的线性关系考察

具体实施方式

注射用益气复脉冻干制剂中由于含人参、五味子及麦冬，其提取物中含量大量的糖类物质，各药味提取及制剂过程中也易生成5-HMF及聚合物，可能给机体带来过敏、刺激性。因此控制制剂中5-HMF类物质的量是提升该药品质量的必要环节。但由于样品制剂中所含各药味较多，组分复杂，为提升样品生产过程的质量控制水平，保证药品的质量、安全和有效，需要建立简捷快速的5-HMF含量测定的HPLC检测方法，为此，以注射用益气复脉冻干制剂为对象，进行了深入细致的样品预处理及测定方法的研究，建立了中药注射剂中的5-HMF的HPLC含量测定方法，不仅操作简捷快速，而且结果准确可靠，应用于葡萄糖大输液、生脉注射液及注射用益气复脉冻干制剂与提取物中的5-HMF测定，取得了很好的效果。

实施例1

注射用益气复脉冻干制剂中5-羟甲基糠醛含量的测定

(1)试剂：甲醇(德国MERCK色谱纯)；超纯水(公司自制)；色谱小柱自制AB-8树脂柱

(2)试药与对照品：注射用益气复脉冻干制剂三批，由天津天士力之骄药业有限公司提供；5-羟甲基糠醛对照品(购自中国药品生物制品检定所批号111626-200503)；

(3)仪器：Waters Alliance高效液相色谱仪，包括2695Separations Module四元泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱，Waters 2996二极管阵列检测器，Empower 2色谱工作站。

(4)色谱条件

色谱柱为Water’s sysmmetry^R(4.5mm×250mm，5um)柱，柱温30℃；流动相为甲醇-水(见表1)流速1.0ml/min，检测波长284nm，进样量为10μl。

表2色谱分离系统

(5)取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1ml溶液含0.01mg的溶液，即得。

(6)供试品溶液制备：取注射用益气复脉冻干制剂每批次各2瓶，用10ml水溶解后，上预先处理好的AB-8树脂柱(目数80目)柱顶端(柱内径6～8mm，树脂柱高约2cm)过柱，速度约为1ml/ml，然后继续用水10ml冲洗，弃去流出液；再以40％甲醇洗脱，洗脱液收集于10ml量瓶中至刻度；混匀，即得

(7)测定法分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，结果见下表：

实施例2

5％葡萄糖大输液中5-羟甲基糠醛含量的测定

(1)试剂：甲醇(德国MERCK色谱纯)；超纯水(公司自制)；ProElut^TMSPE(6ml，0.5g，迪马科技有限公司)

(2)试药与对照品：市售三种不同品牌注射的5％葡萄糖大输液；5-羟甲基糠醛对照品(购自中国药品生物制品检定所批号111626-200503)；

(4)色谱条件

色谱分离系统

(6)供试品溶液制备：5％葡萄糖大输液分别精密取50ml，ProElut^TMSPE(6ml，0.5g，迪马科技有限公司)上预先处理好的AB-8树脂柱(目数80目)柱顶端(柱内径6～8mm，树脂柱高约2cm)过柱，速度约为1ml/ml，然后继续用水10ml冲洗，弃去流出液；再以40％甲醇洗脱，洗脱液收集于10ml量瓶中至刻度；混匀，即得

实施例3

生脉注射液中5-羟甲基糠醛含量的测定

(1)试剂：甲醇(德国MERCK色谱纯)；超纯水(公司自制)；Cleanert^TMSpE(6ml，0.5g，天津博纳艾杰尔科技有限公司)

(2)试药与对照品：市售七种不同品牌注射的生脉注射液；5-羟甲基糠醛对照品(购自中国药品生物制品检定所批号111626-200503)；

(3)仪器：Waters Alliance高效液相色谱仪，包括2695 Separations Module四元泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱，Waters 2996二极管阵列检测器，Empower 2色谱工作站。

(4)色谱条件

色谱分离系统

(6)供试品溶液制备：生脉注射液分别精密取10ml，ProElut^TMSPE(6ml，0.5g，迪马科技有限公司)上Cleanert^TMSPE(6ml，0.5g，天津博纳艾杰尔科技有限公司)过柱，速度约为1ml/ml，然后继续用水10ml冲洗，弃去流出液；再以40％甲醇洗脱，洗脱液收集于10ml量瓶中至刻度；混匀，即得

样品名称	5-HMF对照品峰曲积	样品取样量	样品中浓度(mg/ml)	每ml(或瓶)量(ug)
					5-HMF对照品	602660.5		0.00824
生脉注射液(品牌1)	5278792	10ml	007218	72.18ug/ml
					生脉注射液(品牌2)	79751	10ml	0.00109	1.09ug/ml
生脉注射液(品牌3)	126912	10ml	0.00174	1.74ug/ml
					生脉注射液(品牌4)	231876	10ml	0.00317	3.17ug/ml
生脉注射液(品牌5)	867311	10ml	0.01186	11.86ug/ml
					生脉注射液(品牌6)	1834652	10ml	0.02508	25.08ug/ml
生脉注射液(品牌7)	7324526	10ml	0.10015	100.15ug/ml

实施例4

注射用益气复脉冻干制剂中5-羟甲基糠醛含量测定方法学考察

(一)试剂、试药、对照品、仪器及色谱分离条件

1.试剂：甲醇(德国MERCK色谱纯)；超纯水(公司自制)；色谱小柱为商品柱(艾捷尔公司)

2.试药与对照品：注射用益气复脉冻干制剂，由天津天士力之骄药业有限公司提供；5-羟甲基糠醛对照品(购自中国药品生物制品检定所批号111626-200503)；

3.仪器：Waters Alliance高效液相色谱仪，包括2695 Separations Module四元泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱，Waters 2996二极管阵列检测器，Empower 2色谱工作站。

4.色谱条件

表2注射用益气复脉冻干制剂5-HMF色谱分离系统

5.取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1ml溶液含0.01mg的溶液，即得。

6.供试品溶液制备：取注射用益气复脉冻干制剂2瓶，用10ml水溶解后，上预先处理好的商品树脂柱(目数80目)柱顶端(柱内径6～8mm，树脂柱高约2cm)过柱，速度约为1ml/ml，然后继续用水10ml冲洗，弃去流出液；再以40％甲醇洗脱，洗脱液收集于10ml量瓶中至刻度；混匀，即得

7.测定法分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，结果见图8。

(二)方法学考察研究与结果

1.对照品储备液配制取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，置于50ml容量瓶中，用甲醇加至刻度，混匀，配制成约1mg/ml的储备液，置于4℃冰箱中冷藏保存。临用时用甲醇稀释后测得一系列浓度的对照品。

2.专属性试验

(1)取红参提取物、麦冬提取物及五味子提取物各1批，分别取相当10瓶量的提取物，精密称定，置25ml量瓶中，加水使尽量溶解后，加水至刻度，混匀；分别取各自的溶液置离心管中，离心，精密取5ml溶液(相当2瓶量)，按确定的样品预处理方法和色谱条件进行处理、分离和测定，记录色谱图。

(2)各提取物的色谱图见图9。

(3)从图谱中可以看出，三种提取物中均含有5-羟甲基糠醛，以五味子提取物中所含含量最多，麦冬次之。由于各药味均含有5-羟甲基糠醛，因此，实际测定的是各药味及制剂过程生成的5-羟甲基糠醛的总量。

3.线性关系考察

(1)精密取5-羟甲基糠醛对照品储备溶液1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，分别精密吸取1μl，2μl，4μl，6μl，8μl，10μl，20μl，按确定的色谱条件进行分离和测定峰面积，以体积(μl)对峰面积进行线性回归得回归方程Y＝9×107x+16457，r＝0.9999，结果表明5-HMF在0.0103～0.206μg内线性关系良好，结果见图10。

(2)从线性关系考察结果看，表明色谱分离系统及仪器系统均比较稳定

4.精密度试验

精密吸取对照品溶液5μl重复进样6次，记录色谱图，测得5-HMF峰面积的RSD＝0.5％(n＝5)，表明色谱分离系统良好，具体结果见表4

表4精密度试验

进样次数	1	2	3	4	5	6	RSD
								峰面积	429146	428222	428405	430822	428856	429360	0.22％

5.稳定性试验及中间精密度试验(天间精密度)

精密吸取同一供试品溶液10μl，按确定的色谱条件连续进样6次及连续6天进样，记录5-HMF的峰面积，具体结果见表5和6。

表5.供试品溶液的稳定性考察

表6.供试品溶液的中间精密度(天间精密度)考察

6.重复性试验

(1)取25瓶注射用益气腹脉(冻干)制剂粉末，置已称重的100ml容量瓶中，加纯水溶解并加至刻度，混匀；精密称定后，取2瓶量药液6份，分别精密称定，分别按确定的供试品溶液制备和确定的色谱条件进行处理和分离测定，记录色谱图，按外标法计算供试品中5-HMF含量。

(2)重复性测定结果见表7，本批次样品中的5-羟甲基糠醛测得含量为41.38μg/瓶，RSD％＝1.51％，表明重复性的测定结果的所得精密度好，从一个侧面再一次证明所建立的用品预处理方法及色谱分离系统是稳定可靠的。

(3)样品重复性试验过程，还必须注意取样的代表性及大孔吸附树脂处理时流速的基本一致性，否则难于得到好的试验结果，在于5-羟甲基糠醛的水溶性很

好，保留能力弱，如处理速度过快，会导致5-羟甲基糠醛的吸附程度上的差异，从而影响试验的结果。为解决好重复性的一致性，将样品溶解并定容混匀取样，并控制过柱速度约1ml/min，消除了试验中的系统误差，从而使测定结果的精密度得到了保证。

7.加样回收率测定

(1)从“重复性试验”中配制的注射用益气复脉(冻干)样品溶液中，分别取1瓶量内容物的溶液，精密称定，精密加入浓度为0.0143mg/ml的5-羟甲基糠醛对照品溶液3ml，混匀后按确定的分别按确定的供试品溶液制备和确定的色谱条件进行处理和分离测定，记录色谱图，按外标法计算供试品中5-HMF的量，以(样品中测定量-样品中已知含量)/对照品加入量，计算回收率，结果见表8。

表8回收率试验结果(样品批号为20090302，含量为41.38μg/瓶

(2)采用重复性试验中的配制的样品溶液来做加样回收率测定，是为了消除样品不匀及取样方面带来的系统性误差，保证加样回收率测定结果的准确性。

(3)在样品中含量如此微量的情况下，本次加样回收率均值为99.26％，RSD％＝2.18％，测定结果表明稳定可靠，再一次表明建立的样品预处理方法及色谱分离条件的稳定可靠，适合于注射用益气复脉(冻干)中5-羟甲基糠醛的含量测定。

Claims

1.一种注射剂中5-羟甲基糠醛含量的测定方法，经过以下步骤：

1)注射剂预处理配成样品溶液；

2)5-羟甲基糠醛对照品溶液的配制；

3)采用高效液相色谱法对样品和对照品进行测定；

4)计算样品中5-羟甲基糠醛的含量；

其中，步骤1)所述的注射剂选自生脉注射液、葡萄糖大输液或注射用益气复脉冻干制剂，其预处理方法如下：取粉末剂先用水溶解或者直接取液体制剂，过大孔吸附树脂，用少量水冲洗，弃去流出液；再以40％甲醇洗脱，洗脱液收集于10ml量瓶中至刻度后，混匀后用0.45μm滤膜过滤，取滤液供测定用；

其中，步骤2)取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1ml溶液含0.01mg的溶液；

其中，步骤3)所述色谱条件：大孔吸附树脂是AB-8树脂，树脂柱内径6～8mm，柱高5cm，速度为1ml/min，测定时采用sysmmetry^R色谱柱，其规格为4.5mm×250mm，5μm；检测波长为284nm；柱温为30℃；以甲醇-水为流动相：进行以下梯度洗脱，

时间，分钟流量水(％) 甲醇(％) 0 1 95 5 3 1 95 5 4 1 90 10 13 1 90 10 15 1 50 50 20 1 0 100 23 1 0 100 27 1 50 50 30 1 95 5 33 1 95 5

2.如权利要求1的方法，其特征在于，测定注射用益气复脉冻干制剂中5-羟甲基糠醛的含量采用以下步骤，

(1)仪器：Waters Alliance高效液相色谱仪，包括2695Separations Module四元泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱，Waters2996二极管阵列检测器，Empower2色谱工作站；

(2)色谱条件

色谱柱为Water’s sysmmetry^R，其规格为4.5mm×250mm,5μm，柱温30℃；流动相为甲醇-水，流速1.0ml/min,检测波长284nm，进样量为10μl；

(3)取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1ml溶液含0.01mg的溶液；

(4)供试品溶液制备：取注射用益气复脉冻干制剂每批次各2瓶，用10ml水溶解后，上目数80目的AB-8树脂柱，柱内径6～8mm,树脂柱高约2cm柱，过柱，速度约为1ml/min，然后继续用水10ml冲洗，弃去流出液；再以40％甲醇洗脱，洗脱液收集于10ml量瓶中至刻度；混匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，根据峰面积计算含量。