CN103728331B - 一种生脉注射液的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生脉注射液成品质量的评价方法。是以生脉注射液为对象，以生脉注射液所含总成分的变化规律为评价指标，以氢核磁共振‑模式识别技术为检测分析手段，采用主成分分析或偏最小二乘法‑判别分析为数据处理方法，用正常生产且符合现有产品质量标准的生脉注射液基本样品的¹H‑NMR数据库为基准，观察其他产品样本数据点是否与生脉注射液基本样品一致而判断其质量是否合格的方法。该方法精密度和重复性良好，可用于鉴别生脉注射液真伪，还能预防性监控生脉注射液生产过程中的药材投料、辅料应用和制剂工艺规范性情况，保证生脉注射液的安全有效和质量可控。

Description

一种生脉注射液的检测方法

技术领域

本发明涉及中药注射剂的品质评价方法，具体地说，涉及采用氢核磁共振-模式识别技术对生脉注射液进行定性鉴别的检测方法，属于对药品进行质量控制分析方法建立的技术领域。

背景技术

中药注射剂是遵循中医药理论体系发展起来的新剂型，具有起效迅速、标本兼治等优点而得到临床的广泛应用，但其不良反应也日益突出。据国家不良反应病例报告数据库的资料，中药注射剂的不良反应报告占中药不良反应报告总数的77.2％。由于中药注射剂具有传统中药和现代注射剂的双重特点，其不良反应发生的影响因素十分复杂，单从药品的内在质量考虑，药材质量因素、制备工艺因素、药物成分与辅料因素等都与不良反应的发生存在一定的相关性。

生脉注射液是在古方生脉饮的基础上研制而成的中药注射剂，由人参、麦冬、五味子三味药材组成，广泛应用于心血管、内分泌等系统疾病，现收载于卫生部食品药品标准中药成方制剂第十五册，属于国家基本药物。目前在国内的生产厂家有8家，虽然有统一的生产工艺和质量控制标准，但由于各厂家药材来源和设备条件不尽相同，加上药材炮制和制剂工艺参数存在差异，会影响产品整体内在质量及稳定性，进而影响疗效。本品所含成分复杂，现行生脉注射液质量标准(标准号WS3-B-2865-98-2011)中的指纹图谱项下设立了对多达17个特征成分的信号峰进行高效液相色谱指纹测定的标准，但这些特征成分信号峰只代表在测定波长下有吸收的部分有效成分情况，不能完全反映生脉注射液的整体构成成分和辅料情况。

氢核磁共振(¹H-NMR)作为有机化合物结构测定中不可或缺的技术，能够提供足够丰富的有机化学成分的氢谱信息，并且可以对样品实现非破坏性、非选择性分析，而模式识别(Pattern Recognition)能在复杂的数据中根据其内在的相关性，最大限度的提取出综合性的、有价值的化学成分信息，并转化成直观的样品信息以供分析。

本发明基于生脉注射液现行标准分析方法对药品质量控制存在的局限性，研究了采用氢核磁共振结合模式识别方法中的主成分分析和偏最小二乘法-判别分析技术，建立针对生脉注射液全成分的质量检测新方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的生脉注射液的品质评价方法。

本发明所指的品质评价指标是生脉注射液的总内含物的变化规律。

本发明所用的测定技术是氢核磁共振技术。

本发明所指的数据处理方法是模式识别中的主成分分析和/或偏最小二乘-判别分析法(PLS-DA)。

本发明涉及样品采集和前处理，氢核磁共振测定、图谱处理、数据分析以及结果判断方式，由下述步骤及方法完成。

A基本样品和测试样品的图谱及数据采集与处理

(1)样品处理：量取样品，取样范围为0.5mL-25mL，优选5mL；将样品溶液加入到D101型大孔吸附树脂柱内，用5mL-200mL蒸馏水冲柱，优选55mL；再以有机溶剂冲柱，有机溶剂为C1-C5的低级醇，优选为甲醇，洗脱体积为3mL-150mL，优选35mL；洗脱液减压蒸干，温度为15℃-75℃，优选50℃；残留物用0.4mL-0.6mL DMSO-d₆溶解，优选0.5mL；溶液转入直径5mm核磁管中；上述方法中的样品加量：树脂柱体积：水洗体积：甲醇洗体积的毫升比例大约在1∶2∶11∶7左右。

(2)测定方法：是氢核磁共振法；核磁共振仪是指300MHz，400MHz，500MHz，600MHz或以上的仪器；将步骤(1)中获得的各样品在核磁共振仪上按如下条件测定：恒温302K，以DMSO-d₆作为内锁，采样时间域64k，谱宽-1000Hz-13000Hz，优选为7500Hz；脉冲间隔D1为0.00-4.50s，优选3.00s，采样时间3.50s，扫描16-128次，优选32次；采用标准的预饱和脉冲序列(zgpr)压制水峰信号，即获得各样品的¹H-NMR谱；

(3)数据处理和分析：主要是指模式识别方法中的主成分分析和/或偏最小二乘法-判别分析；将(2)中得到的各样品自由衰减(FID)信号导入MestReNova软件进行傅里叶转换获得¹H-NMR图谱，再进行象限和基线调整，并以溶剂(DMSO-d₆)化学位移值(δ2.50)为内标进行化学位移值校准。对得到的每张图谱的化学位移值区间(δ0.00-δ9.00)，以每0.05×10^-6的化学位移值段进行分段积分，获得与化学位移值段(175段)相应的面积积分值(考虑到溶剂峰可能对分析结果产生影响，特将δ2.40-δ2.65段去除)。将获得的积分数据导入Excel软件，采用面积归一化法进行标准化处理得到数据矩阵。

将数据矩阵导入SIMCA-P11.5软件，启动PLS-DA分析程序，依次提取主成分(主成分1，主成分2等等)，使各主成分的累积贡献率达到85％(即表示提取的主成分能够代表原变量85％的信息)，符合分析要求。然后分别以主成分1(PC1)对主成分2(PC2)的得分值为横纵坐标绘制得分散点图并进行相关分析。

B基本样品数据库建立与检测分析

以一定数量的合格生脉注射液作为基本样品，经上述的样品处理、测定、图谱和数据处理后获得的数据为基础，构成基本样品数据库并验证，以此数据库数据的95％可信区间为基准，对生脉注射液成品进行定性检测；将待测样品按相同方法获得的数据与数据库数据比较，如待测样品的数据落在数据库数据的95％可信区间内，则鉴别该样品为合格，如数据落在数据库数据的95％可信区间外，则鉴别为不合格；

C.基本样品的氢核磁共振数据库的扩充

待测样品经上述的判别后，如为合格品，则将其数据纳入基本样品的氢核磁共振数据库，以扩充数据库和增加基本样品的代表性和判别能力。

本发明的优点和特点是：首次采用氢核磁共振-偏最小二乘法-判别分析方法，以川大华西药业生产的生脉注射液为主，吉林省集安益盛药业股份有限公司、江苏苏中药业集团股份有限公司和四川雅安三九药业有限公司为辅，建立了生脉注射液基本样品数据库；以随机选取的生脉注射液基本样品做为验证样本对本方法进行验证，以缺辅料样品、缺味样品和仿制品作为测试样本，对本方法进行测试；验证和测试结果表明，该法能准确的判断生脉注射液合格品以及多种类型的不合格品，可以预防性的监控注射液的各种异常，克服现行标准方法的缺陷，同时具有分析周期短，操作简单易行，对环境污染显著降低的特点，故该方法可作为控制生脉注射液内在质量的一种有效方法，并且随着更多合格品数据的不断纳入，训练集样本数量不断加大，数据库的代表性随之增加，判别的准确性也就随之提高，这将能够更加有效地对生脉注射液实施更全面的质量控制。

附图说明

图1是具体实施方式中生脉注射液原液¹H-NMR图；

图2是具体实施方式中经大孔吸附树脂处理后的生脉注射液样品¹H-NMR图；

图3是具体实施方式中四厂家生脉注射液样品¹H-NMR重叠图谱；

图4是具体实施方式中四厂家生脉注射液基本样品数据库的PLS-DA主成分1对主成分2的得分散点图(○川大华西药业；*益盛药业；▲三九药业；●苏中药业)；

图5是具体实施方式中生脉注射液基本样品、验证品与缺辅料样品间的PLS-DA主成分1对主成分2的得分散点图(○四厂家样品；▲验证样品；◆缺辅料样品)；

图6是具体实施方式中生脉注射液基本样品与仿制品、缺味样品间的PLS-DA主成分1对主成分2的得分散点图(○四厂家合格生脉样品；*仿制品；◆缺红参样品；●缺麦冬样品缺五味子样品)。

具体实施方式

1.仪器、试剂与样品

仪器：SENCOR-201旋转蒸发仪(上海申顺生物科技有限公司)；INOVA400核磁共振仪(Varian公司)。试剂：甲醇(AR)，D101大孔吸附树脂(成都市科龙化工试剂厂)；氘代二甲亚砜(DMSO-d₆，Cambridge Isotope Laboratories，Inc)；水为去离子水。样品：生脉注射液基本样品购于山东、广州、四川等地各大医院，生产企业为四川川大华西药业股份有限公司(15批，编号：HX1～30)、吉林省集安益盛药业股份有限公司(4批，编号：YS1～8)、江苏苏中药业集团股份有限公司(4批，编号：SZ1～8)、四川雅安三九药业有限公司(4批，编号：SJ1～8)。红参、麦冬和五味子药材均购于成都北京同仁堂药店。仿制品(FP1～4)、缺辅料样品(QF1～QF2)及缺味样品(分别缺红参QW1～2、缺麦冬QW3～4、缺五味子QW5～6)均按照生脉注射液质量标准(WS3-B-2865-98-2011)制法项中工艺自制。

2.样品前处理

预试：精密量取生脉注射液5mL置于旋转蒸发仪上，减压蒸干，固体残留物以DMSO-d₆溶解供¹H-NMR检测，得到图1，由图可知，生脉注射液原液¹H-NMR图谱在化学位移值δ3.00-δ4.00之间的糖类物质信号峰很强，掩盖了人参皂苷等其它物质的信号，应予去除。本实验采用大孔吸附树脂柱吸附的方法除去糖类物质：将预处理好的D101大空吸附树脂，采用湿法装柱(2cm×15cm)，树脂柱体积10ml。取5ml生脉注射液上样，吸附速率保持1mL/min，先以水冲洗树脂柱，流出液每半个柱体积收集一试管，取样进行Molish反应并观察，以Molish反应成阴性作为判定标准(此时说明糖类物质被冲洗干净)。再以甲醇洗脱树脂柱，洗脱速度1mL/min，收集流出液于旋转蒸发仪蒸干，以残留物质量不再增加作为甲醇用量的标准。将该前处理样品进行¹H-NMR测试，结果见图2，由图可知，样品经大孔吸附树脂处理后，¹H-NMR谱中信号多且分辨率良好，结果满意。图谱显示生脉注射液样品中化合物的信号主要集中在化学位移值δ0.70-δ5.40段，而在化学位移值δ5.40-δ9.00段也有少量信号峰，为了最大限度的从整体上获得生脉注射液基本样品的化学信息，本实验采集化学位移值δ0.00-δ9.00段的图谱数据信息进行分析。

上述样品前处理方法的优化结果为：样品加量：树脂柱体积：水洗体积：甲醇洗体积的毫升比例大约在1∶2∶11∶7左右，由此确定本实验样品最终前处理方法为：精密吸取生脉注射液5mL，加入到D101大孔吸附树脂柱内，用55mL蒸馏水洗脱后，以35mL甲醇冲洗树脂柱。收集甲醇洗脱液，50℃减压蒸干，残留物用0.5mLDMSO-d₆溶解后，转入核磁管(φ5mm)中，供¹H-NMR检测。每批次生脉注射液平行制备两个样品。

3.¹H-NMR测定条件

恒温302K，以DMSO-d₆作为内锁，采样时间域64k，谱宽7500Hz，脉冲间隔D1为3.00s，采样时间3.50s，扫描32次，采用标准的预饱和脉冲序列(zgpr)压制水峰信号。

各基本样品在上述条件下测定¹H-NMR谱后，随机选择四个厂家各一个样品¹H-NMR谱图进行重叠(见图3)。

4.图谱及数据处理

将3项下测得的各样品自由衰减(FID)信号导入MestReNova软件进行傅里叶转换获得¹H-NMR图谱。各图谱分别进行象限和基线调整，并以溶剂(DMSO-d₆)化学位移值(δ2.50)为内标进行化学位移值校准。

为得到最佳的分类效果，将图谱分别按照0.04、0.05、0.06及0.1化学位移值单位进行分段积分，进行PLS-DA测试，结果显示以0.05化学位移值段进行积分效果最好，故确定各样品的分段积分方式为：对得到的每张图谱的化学位移值区间(δ0.00-δ9.00)，以每0.05×10^-6的化学位移值段进行分段积分，获得与化学位移值段(175段)相应的面积积分值，由¹H-NMR图谱可以看出，在化学位移为2.50(δ2.50)处，是DMSO的溶剂峰，而不同的样品，该溶剂峰大小不一。考虑到溶剂峰可能对分析结果产生影响，在不影响其他峰的情况下，特将δ2.40-δ2.65段去除。

将获得的每张图谱的积分数据导入Excel软件，采用面积归一化法进行标准化处理，得到生脉注射液样品数据矩阵，供以下的数据分析。

5.数据分析

由图3可知，四厂家的重叠图谱既表现出一定相似性又存在细节差异，仅靠肉眼观察只能从¹H-NMR图谱中获取很有限的信息，为最大限度的获得信息，将生脉注射液样品谱图处理后，做偏最小二乘-判别分析：将4项下得到的各样品数据矩阵导入SIMCA-P11.5软件，进行PLS-DA分析，首先提取主成分，依次提取的主成分为：主成分1，主成分2，依此类推得到各主成分，使各主成分的累积贡献率达到85％，即表示提取的主成分能够代表原变量85％的信息，符合分析要求。

分别以主成分1(PC1)对主成分2(PC2)的得分值为横纵坐标绘制得分散点图并进行相关分析。

6.分析方法的考察

参照中国药典2010年版一部附录XVIIIA中药质量标准分析方法验证指导原则，结合本实验的具体情况，对供试品溶液制备方法的重复性、样品的稳定性以及图谱处理方法的重复性和仪器精密度进行了考察。结果以夹角余弦值作为判定指标。

6.1供试品溶液制备方法重复性考察

随机取生脉注射液(川大华西药业，批号：111005)，按照2项下方法平行制备6份样品，分别按3、4项下方法测定和处理图谱，得到6组积分值数据。随机以第一份样品数据为对照，计算6份样品之间的夹角余弦值，结果见表1。

6.2样品稳定性考察

随机取生脉注射液(川大华西药业，批号：111035)，按照2、3项下方法制备1份样品并每天测定1次，连续测定5天，按4项下图谱处理方法处理，得到5组积分值数据。计算5组数据之间的夹角余弦值，结果见表1。

6.3图谱处理方法重复性考察

随机取生脉注射液(川大华西药业，批号：111035)，按照2、3、4项下方法制备1份样品并进行测定，反复处理图谱5次，得到5组积分值数据。随机以其中一组数据为对照，计算这5组数据之间的夹角余弦值，结果见表1。

6.4仪器精密度考察

随机取生脉注射液(川大华西药业，批号：111035)，按照2、3项下方法制备1份样品并反复测定6次，得到该样品的6个¹H-NMR图谱，将图谱按4项下方法处理后得到6组积分值数据。计算6组数据之间的夹角余弦值，结果见表1。

表1分析方法的考察结果

由表1可知，各考察项夹角余弦值均在0.99以上，说明供试品溶液制备方法和图谱处理方法重复性良好、仪器精密度良好、且样品在五天内稳定。

7.结果与判断

7.1四厂家生脉注射液样品之间的PLS-DA分析

将4项下获得的四厂家生脉注射液基本样品(川大华西药业，编号HX1～HX28；吉安益盛药业，编号：YS1～8，苏中药业，编号：SZ1～8；雅安三九药业，编号：SJ1～8)构成的数据矩阵52×175(共52个样品，每个样品175个积分值即得到52×175的数据矩阵)作为训练集，按照5项下方法进行分析，导入SIMCAP软件，首先提取主成分，前5个主成分的累积贡献率已达到85％以上，说明前5个主成分即能代表85％以上的原变量信息。以主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的得分值为横纵坐标绘制得分散点图见图4。

由图4可知，四个厂家的生脉注射液样品的数据点均落在了95％置信区间内，由此可以说明生脉注射液的产品质量趋于稳定，化学成分相似，且实验操作过程中也没有引入较大误差。因此，这些数据可以作为合格生脉注射液基本样品的数据库数据，用于进一步分析。另一方面，四个厂家生产的生脉注射液各自有对应的样品数据点集中区域，川大华西药业生产的生脉注射液样品主要集中在t[1]＝(-5，15)，t[2]＝(-7,2)区域；益盛药业生产的生脉注射液样品主要集中在t[1]＝(-24,-7)，t[2]＝(3,7)区域；苏中药业生产的生脉注射液主要集中在t[1]＝(-3，15)，t[2]＝(6，10)区域，三九药业生产的生脉注射液主要集中在t[1]＝(-15,0)，t[2]＝(-8,-2)区域。说明各厂家生产的生脉注射液在整体质量上存在一定的差异，而同一厂家的制剂由于原料来源和制备工艺相对更稳定，所以差异更小。另外川大华西药业和三九药业生脉注射液样品点集中区域有部分重合，分析原因有可能系这两个厂家同在四川省，其原料来源和生产工艺等较接近的缘故。

7.2生脉注射液样品与验证品、缺辅料样品间的PLS-DA分析

将4项下获得的四厂家生脉注射液样品(编号：HX1～HX28，YS1～8，SZ1～8，SJ1～8)、验证样品(编号：HX29～HX30)以及缺辅料样品(编号：QF1～QF2)数据构成的数据矩阵(56×175)作为训练集，按照5项下方法进行PLS-DA分析，将此数据矩阵导入SIMCA-P11.5软件，首先提取主成分，前7个主成分的累积贡献率已达到85％以上，即说明前7个主成分即能解释85％以上的原变量信息，故选取前7个主成分进行分析。以PC1和PC2的得分值为横纵坐标绘制得分散点图，见图5。

由图5可知，验证品(川大华西药业，编号：HX29～HX30)与4项下获得的合格生脉注射液基本样品(HX1～HX28，YS1～8，SZ1～8，SJ1～8)数据聚集在了一起，说明验证样品(川大华西药业，编号：HX29～HX30)与合格生脉注射液样品化学成分基本一致，为质量合格的产品，故可以将其纳入合格生脉注射液训练集样品数据中，用于进一步分析。而缺辅料样品(QF1～QF2)数据点落在了合格生脉注射液数据点及95％置信区间之外，说明缺辅料样品与生脉注射液样品存在明显差异而与之分开。

7.3生脉注射液样品与仿制品、缺味样品间的PLS-DA分析

将4项下获得的四厂家合格生脉注射液样品(编号：HX1～HX30，YS1～8，SZ1～8，SJ1～8)以及仿制品(FP1～2)、缺味样品(QW1～6)数据构成的数据矩阵(62×175)作为训练集，按照5项下方法进行PLS-DA分析，将此数据矩阵导入SIMCA-P11.5软件，首先提取主成分，前6个主成分的累积贡献率已达到85％以上，即说明前6个主成分即能解释85％以上的原变量信息，因此选取前6个主成分进行分析，以PC1和PC2的得分值为横纵坐标绘制得分散点图，见图6。

由图6可知，四个厂家合格生脉注射液数据点均落在了95％置信区间内，且数据点非常集中，进一步说明了生脉注射液产品质量的稳定性，而缺红参样品(编号：QW1～QW2)、缺麦冬样品(编号：QW3～QW4)和缺五味子样品(编号：QW5～QW6)数据点均落在了合格生脉注射液样品数据点之外，即处于95％置信区间之外，说明缺味样品与合格生脉注射液基本样品在化学成分上存在明显差异，可以很容易与之区分。生脉注射液仿制品(编号：FP1～FP2)数据点落在了95％置信区间内，但游离在合格生脉注射液基本样品训练集之外，说明采用小试设备自制的生脉注射液仿制品与各厂家统一工艺后的大生产样品存在一定差异，这种差异应该是药材产地、工艺设备及操作参数等因素差异的综合效应。

Claims (3)

1.一种基于氢核磁共振-模式识别技术的生脉注射液检测方法，该方法步骤如下：

A基本样品和测试样品的图谱及数据采集与处理

(1)样品处理：量取样品0.5mL-25mL，加入到D101型大孔吸附树脂柱内，用蒸馏水5mL-200mL冲柱，再以有机溶剂C1-C6的低级醇3mL-150mL冲洗树脂柱，收集有机溶剂洗脱液，在15℃-75℃温度下减压蒸干，残留物用DMSO-d₆0.4mL-0.6mL溶解后，转入直径5mm核磁管中；其中样品加量∶树脂柱体积∶水洗体积∶C1-C6的低级醇洗体积的比例大约是1∶2∶11∶7；

(2)测定方法：是氢核磁共振法；核磁共振仪是300MHz，400MHz，500MHz，600MHz或大于600MHz的仪器；将步骤(1)中获得的各样品在核磁共振仪上按如下条件测定：恒温302K，以DMSO-d₆作为内锁，采样时间域64k，谱宽-1000Hz-13000Hz，脉冲间隔D1为0.00-4.50s，采样时间3.50s，扫描16-128次，采用标准的预饱和脉冲序列(zgpr)压制水峰信号，即获得各样品的¹H-NMR谱，其中，以DMSO-d₆作为内锁扫描32次，谱宽7500Hz，脉冲间隔为3.00s；

(3)数据处理和分析：是指模式识别技术的主成分分析或偏最小二乘-判别分析法；

B基本样品数据库建立与检测分析

以一定数量的合格生脉注射液作为基本样品，经上述的样品处理、测定¹H-NMR谱和数据处理后获得的数据为基础，构成基本样品数据库并验证，以此数据库数据的95％可信区间为基准，对生脉注射液成品进行定性检测；将待测样品按相同方法获得的数据与数据库数据比较，如待测样品的数据落在数据库数据的95％可信区间内，则鉴别该样品为合格，如数据落在数据库数据的95％可信区间外，则鉴别为不合格；

所述生脉注射液成品是指以中药红参、麦冬和五味子为原料制备的注射液。

2.根据权利要求1所述的一种基于氢核磁共振-模式识别技术的生脉注射液检测方法，其中在步骤(1)中的样品取样量为5mL，冲洗大孔吸附树脂柱的蒸馏水为55mL，有机溶剂为甲醇，冲柱体积为35mL。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于氢核磁共振-模式识别技术的生脉注射液检测方法，步骤(1)中的洗脱液减压蒸干温度为50℃，残留物用DMSO-d₆0.5mL溶解。