CN110361457A - 医药产品中5-羟甲基糠醛含量的hplc检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种医药产品中5‑羟甲基糠醛含量的HPLC检测方法，包括分别精密取对照品溶液和待测试医药产品的样品溶液注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算得到样品溶液中5‑羟甲基糠醛含量。本发明检测方法只需取适量样品，配制成合适的浓度使用HPLC直接进行测试，该检测方法样品处理简单、快捷、准确；检测方法简单，周期短，试剂为常规试剂，易获得，可针对不同产品中葡萄糖用量进行浓度调整，通用性强，不仅适合液体制剂同时也适合固体制剂。
Description
技术领域
本发明涉及检测样品中5-羟甲基糠醛含量的方法，尤其涉及采用高效液相色谱检测葡萄糖药品中5-羟甲基糠醛含量的方法，属于5-羟甲基糠醛含量的测定领域。
背景技术
葡萄糖临床应用广泛，用于各种高热、脱水、昏迷或不能进食的患者所需的水分和热量。体内丢失大量体液时，如吐泻、大失血等可先静脉滴注5％～10％葡萄糖和生理盐水以补充水、盐和糖分，并用于低血糖、药物毒物中毒者。静脉滴注25％～50％的高渗溶液，因其高渗压作用，可使组织脱水和短暂利尿，与甘露醇联合交替应用治疗脑水肿、肺水肿及降低眼压。静脉滴注高渗葡萄糖治疗血糖过低。葡萄糖加强记忆，刺激钙质吸收和增加细胞间的沟通。但是太多会提高胰岛素的浓度，导致肥胖和糖尿病；太少会造成低血糖症或者更糟，导致胰岛素休克(糖尿病昏迷)。葡萄糖对脑部功能很重要，葡萄糖的新陈代谢会受下列因素干扰：忧郁、躁郁、厌食和贪食。
5-羟甲基糠醛由葡萄糖或果糖脱水生成的化学物质，分子中含有一个呋喃环，一个醛基和一个羟甲基，熔点28-34℃，储存条件2-8℃，其葡萄糖的主要降解途径如图1所示
目前据相关文献报道，5-HMF的检测方法主要有紫外分光光度法、液相色谱法、气质联用法和液质联用法，在本技术领域中，中国药典中收载的5-HMF测试方法采用紫外法对葡萄糖注射液中的5-HMF进行测试，经实施后发现该方法测试精度不能满足目前需求，而且只是针对注射液，而某些口服固体制剂中也含有葡萄糖，采用该方法无法对口服固体制剂中的5-HMF进行测试，因此需要一种快速准确的测试注射液或口服固体制剂中5-HMF的方法。
CN102466658A中公开了一种采用HPLC法对5-HMF进行检测的方法，其测试样品仅限于中药注射液中的5-羟甲基糠醛，在样品处理时采用大孔吸附树脂对样品进行预处理，该方法费时且操作复杂，对操作人员水平要求较高。
CN106546667A公开了一种5-羟甲基糠醛的检测方法，但是该检测方法仅针对腹膜透析液单一品种，对样品要求过于单一，通用性不强。
因此，亟待需要提供一种更准确、通用性更好的检测含有葡萄糖药物的降解产物5-羟甲基糠醛的检测方法，该检测方法不仅适用于检测液体制剂，也能用于检测固体制剂中5-羟甲基糠醛的含量。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求一种更准确、通用性更好的检测含有葡萄糖药物的降解产物5-羟甲基糠醛含量的方法，该检测方法不仅能够检测液体制剂，也能够用于检测固体制剂。为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：
一种医药产品中5-羟甲基糠醛含量的HPLC检测方法，包括，分别精密取对照品溶液和测试样品溶液注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算得到检测样品溶液中的5-羟甲基糠醛含量；所采用的色谱条件包括：色谱柱为C18色谱柱，用流动相进行梯度洗脱，所述的检测波长为284nm，流速为0.5ml/min，柱温为25℃，进样体积5-20μl；稀释剂为纯化水。
本发明通过实验发现，流动相的组成以及梯度洗脱的条件对于检测的效果影响非常大，通过大量的筛选实验最终发现，采用以下流动相以及梯度洗脱条件，5羟甲基糠醛的保留时间在5分钟左右，与其它临近峰的分离度较高，理论板数也能满足色谱条件的要求，拖尾因子宜符合相关的技术要求，能够实现精确测定的效果：
流动相由流动相A和流动相B组成，所述的流动相A由0.7％冰醋酸水溶液和甲醇按照75:25的体积比例组成；所述的流动相B为甲醇；
所述的梯度洗脱条件是：
时间0分钟，采用流动相A进行洗脱；
时间10分钟，采用流动相A进行洗脱；
时间12分钟，由流动相A和流动相B按照40:60的体积比例组成的流动相进行洗脱；
时间20分钟，由流动相A和流动相B按照40:60的体积比例组成的流动相进行洗脱；
时间22分钟，采用流动相A进行洗脱；
时间35分钟，采用流动相A进行洗脱。
其中，所述5-羟甲基糠醛对照品溶液浓度可以为1.4-14ug/ml，优选为7-14ug/ml
本发明检测方法5-羟甲基糠醛与临近峰的分离度不小于2.0，理论塔板数以5-羟甲基糠醛计不低于3000。
本发明通过高效液相色谱法，精确检测待测产品中5-羟甲基糠醛的含量，有利于优化产品的工艺，提高产品质量和安全性。本发明检测方法只需取适量样品，配制成合适的浓度使用HPLC直接进行测试，该方法样品处理简单、快捷、准确。本发明检测方法简单，周期短，试剂为常规试剂，易获得，可针对不同产品中葡萄糖用量进行浓度调整，通用性强，不仅适合液体制剂同时也适合固体制剂，如某些固体制剂可能会含有不溶性物质，可用上述流动相进行溶解，去除固体不溶物后再进行测试。
附图说明
图1 5-羟甲基糠醛对照的紫外吸收光谱图。
图2 5-羟甲基糠醛的线性回归方程图。
图3耐用性-改变波长284nm±5nm比较图。
图4耐用性-改变柱温25℃±5℃比较图。
图5耐用性-改变流速0.5ml/min±0.1ml/min比较图。
图6耐用性-改变流动相比例25％甲醇(±5％甲醇)比较图。
图7耐用性-更换色谱柱(Therm)比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1检测口服补液盐散剂中5-羟甲基糠醛含量
高效液相色谱仪：Lab solution工作站，岛津LC-2030；
色谱条件：
色谱柱：C18色谱柱(C18，4.6×250mm，5μm)；
流动相A：0.7％冰醋酸水溶液(量取7ml冰醋酸至1000ml水中，即可)：甲醇(75:25)；
流动相B：甲醇。
检测波长：284nm
流速：0.5ml/min；
柱温：25℃
梯度洗脱：详见表1。
表1梯度洗脱表
| 时间，分钟 | 流动相A，％ | 流动相B，％ |
| 0 | 100 | 0 |
| 10 | 100 | 0 |
| 12 | 40 | 60 |
| 20 | 40 | 60 |
| 22 | 100 | 0 |
| 35 | 100 | 0 |
进样体积：5μl；
稀释剂：纯化水；
对照品溶液：称取5-羟甲基糠醛对照品约10mg，精密称定至10ml量瓶中，加水溶解稀释制成每1ml中约含135ug的溶液，作为5-羟基糠醛对照品溶液的贮备液；再精密量取1ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度制成含13.5ug的溶液，作为5-羟甲基糠醛对照品溶液。
供试品溶液：取本品约5.125g(约相当于无水葡萄糖3.375g)至25ml量瓶中，加入溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液储备液；再精密量取1ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测试方法：对照溶液及供试品溶液分别精密量取5ul至液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中5-羟甲基糠醛的含量。测试方法：采用上述色谱条件对样品用HPLC法进行测试。
表2样品检测结果
| 样品来源 | 批号 | 5-羟甲基糠醛，％ | 结论 |
| 自制品 | 20120201 | 未检出 | 合格 |
| 自制品 | 20120202 | 未检出 | 合格 |
| 自制品 | 20120203 | 未检出 | 合格 |
| 市售品 | 20170605 | 未检出 | 合格 |
实施例2检测小儿复方电解质注射液中5-羟甲基糠醛含量
高效液相色谱仪：Lab solution工作站，岛津LC-2030
色谱条件：
色谱柱：C18色谱柱(C18，4.6×250mm，5μm)
流动相A：0.7％冰醋酸水溶液(量取7ml冰醋酸至1000ml水中，即可)：甲醇(75:25)；
流动相B：甲醇。
检测波长：284nm；
流速：0.5ml/min；
柱温：25℃；
梯度洗脱：详见表3；
表3梯度洗脱表
| 时间，分钟 | 流动相A，％ | 流动相B，％ |
| 0 | 100 | 0 |
| 10 | 100 | 0 |
| 12 | 40 | 60 |
| 20 | 40 | 60 |
| 22 | 100 | 0 |
| 35 | 100 | 0 |
进样体积：5μl；
稀释剂：纯化水；
对照品溶液：精密量取5-羟甲基糠醛适量，加水制成每1ml中含5-羟甲基糠醛7.5μg的溶液，作为对照溶液；
供试品溶液：取本品适量即作为供试品溶液；
测试方法：采用上述色谱条件对样品用HPLC法进行测试。
表4 5-羟甲基糠醛测定结果
通过实施例1与实施例2的测试结果证明，只要选择合适的对照品浓度(与所测试样品浓度接近)，采用本发明检测方法即可准确快速的测试出样品中5-羟甲基糠醛的含量。
实验例1本发明检测方法的方法学验证
(1)检测波长选择
取5-羟甲基糠醛对照品溶液分别稀释至适宜浓度，使得最大吸收波长下的吸光度范围在0.3-0.8之间。采用紫外-可见分光光度法，在200-600nm波长范围内进行扫描。
表5紫外扫描结果
根据表5和图1的紫外扫描结果表明本品在284nm处有最大吸收。
(2)系统适应性
取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含14ug的溶液，作为5-羟基糠醛对照品溶液。量取对照品溶液5μl注入高效液相色谱仪，连续测定6次，计算5-羟甲基糠醛峰面积的RSD值不得大于2.0％，理论板数以5-羟甲基糠醛峰计不得低于3000，5-羟甲基糠醛与邻近位置峰的分离度符合检测的要求。
表6对照连续进样实验结果表
(3)专属性
高温破坏：称取葡萄糖适量，至10ml量瓶中，放置高温100℃、80℃条件下，分别于1天、2天、3天取样，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤即可，分别作为高温破坏样品。
酸降解：称取葡萄糖适量，至10ml量瓶中，加水适量使溶解，分别加入3mol/L盐酸适量，摇匀，分别置于室温条件下放置5天、18.5小时和5.5小时取样，用饱和氢氧化钠溶液调节溶液pH值显中性，加水定容至刻度，摇匀，滤过即可，分别作为酸破坏样品。
碱降解：称取葡萄糖至10ml量瓶中，加水适量使溶解，分别加入1mol/L的氢氧化钠适量，摇匀，分别置于室温条件下放置5天、1.5天、1天和5.5小时取样，用3mol/L盐酸溶液调节溶液pH值显中性，加水定容至刻度，摇匀，滤过即可，分别作为碱破坏样品。
氧化降解：称取无水葡萄糖适量至10ml量瓶中，加水适量使溶解，按照上述“附表7-氧化破坏”的实验设计，分别加入30％过氧化氢1ml，摇匀，分别置于室温条件下放置5天，加水定容至刻度，摇匀，滤过即可，分别作为氧化破坏样品。
紫外光照降解：称取无水葡萄糖适量，至10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，分别置于紫外光照箱内下放置5天、3天，滤过即可，分别作为紫外光照破坏样品。
表7高温强降解实验结果
表8酸性条件强降解实验结果
表9碱性条件强降解实验结果
表10氧化强降解实验结果
表11紫外光照强降解实验结果
(4)最小检测限和定量限
按仪器噪音的三倍响应值测定5-羟甲基糠醛的最小检测线,按仪器噪音的十倍响应值测定5-羟甲基糠醛定量限。
表12最小检测限和定量限实验结果数据表
结论：5-羟甲基糠醛的最小检测限为6.7433ng/ml，连续6份样品峰面积的RSD％<10；定量限为22.4777ng/ml，连续6份样品峰高RSD％<5
(5)线性范围
取5-羟甲基糠醛对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液1，再精密量取1.4ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液2；分别精密量取对照贮备液(2)以1.2ml、1ml、0.8ml、0.5ml、0.3ml、0.1ml置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为线性对照溶液(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)；再精密量取线性对照溶液(5)1.5ml和线性对照溶液(6)1ml分别至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为线性对照溶液(7)、(8)。
表13 5-羟甲基糠醛线性实验结果
| 浓度，ug/ml | 峰面积，A |
| 0.0225 | 2357 |
| 0.1499 | 15566 |
| 1.4985 | 158091 |
| 4.4955 | 475744 |
| 7.4926 | 790899 |
| 11.9881 | 1277631 |
| 14.9852 | 1606720 |
| 17.9822 | 1900268 |
检测结果表明，5-羟甲基糠醛的线性回归方程为y＝106348x-778.79，r＝0.9999，且在0.0225μg/ml～17.9822μg/ml的浓度范围内，峰面积与浓度呈现良好的线性关系；Y轴截距占主峰100％响应值的0.05％，远远小于25％的要求(图2)。
(6)溶液的稳定性
精密量取对照品溶液各5ul至液相色谱仪，按上述液相色谱条件进行分析，并于0、2、4、6、8、12及24小时的时间间隔连续进样，考察5-羟甲基糠醛对照和供试品溶液峰面积的变化情况。
表14室温条件下溶液稳定性实验结果
结果表明，5-羟甲基糠醛对照品溶液在24小时稳定，峰面积的变化与0h比较，相对平均偏差均小于2％
(7)准确度
取5-羟甲基糠醛对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液，再精密量取1.4ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液2(1000％浓度)；另分别精密称取对照供试品约0.205g至10ml量瓶中，平行9份，将上述对照贮备液2以1.5ml、1ml、0.5ml上述同一量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度级别分别为50％、100％、150％，每个浓度平行3份，作为回收率样品。另精密称取本品0.205g至10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为回收率空白样品；精密量取上述对照贮备液2以1.0m至l0ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为5-羟甲基糠醛对照品溶液；以水溶液作为空白溶剂。
表15准确度实验结果
结果表明本法测定5-羟甲基糠醛的回收率范围为96.93％～99.65％，平均回收率为98.90％，RSD为0.84％。
(8)精密度
取5-羟甲基糠醛对照溶液按上述的液相色谱条件进行实验，精密量取对照溶液5μl注入液相色谱仪，进样分析，重复测定6次。
表16重复性实验结果
(9)耐用性
制备对照品溶液，按上述的液相色谱条件进行实验。通过更改检测方法参数(波长、柱温、流速、流动相比例)、更换色谱柱等条件，考察参数变化范围内检测方法的耐用性。
耐用性实验结果—系统适应性考察
9.1、原始条件
表17
9.2、在规定波长284nm的基础上改变±5nm的范围：
考察结果见表18和图3。
表18
9.3、在规定柱温25℃的基础上改变±5℃的范围：
考察结果见表19和图4。
表19
9.4、在规定流速0.5ml/min的基础上改变±0.1ml/min的范围：
考察结果见表20和图5。
表20
9.5、在规定流动相比例(25％甲醇)的基础上改变±5％甲醇的范围：考察结果见表21和图6。
表21
9.6、更换色谱柱：
考察结果见表22、23和图7。
表22
表23 5-羟甲基糠醛分析方法学验证结果总结
实验例2梯度洗脱的最佳条件的筛选实验
为了筛选出最适宜的梯度洗脱条件，本实验设计了8组梯度洗脱条件，各组的具体洗脱条件见表24，其它的色谱条件如下：
高效液相色谱仪：Lab solution工作站，岛津LC-2030
色谱条件：
色谱柱：C18色谱柱(C18，4.6×250mm，5μm)
流动相A：0.7％冰醋酸水溶液(量取7ml冰醋酸至1000ml水中，即可)：甲醇(75:25)；
流动相B：甲醇。
检测波长：284nm
流速：0.5ml/min；
柱温：25℃
进样体积：5μl
稀释剂：纯化水
对照品溶液：称取5-羟甲基糠醛对照品约10mg，精密称定，至10ml量瓶中，加水溶解稀释制成每1ml中约含135ug的溶液，作为5-羟基糠醛对照品溶液的贮备液；再精密量取1ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度制成含13.5ug的溶液，作为5-羟甲基糠醛对照品溶液。
供试品溶液：取本品约5.125g(约相当于无水葡萄糖3.375g)至25ml量瓶中，加入溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液储备液；再精密量取1ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测试方法：对照溶液及供试品溶液分别精密量取5ul至液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中5-羟甲基糠醛的含量。测试方法：采用上述色谱条件对样品用HPLC法进行测试。
表24不同方法的梯度变化表
表25不同方法下的分离数据汇总表
根据表25的分离结果可见，方法8的5羟甲基糠醛的保留时间在5分钟左右，与其它临近峰的分离度较高，理论板数也能满足色谱条件的要求，拖尾因子宜符合相关的技术要求，因此，本发明优选采用方法8的梯度洗脱条件。
Claims (9)
1.一种医药产品中5-羟甲基糠醛含量的HPLC检测方法，包括，分别精密取对照品溶液和待测试医药产品的样品溶液注入色谱仪后进行洗脱，记录色谱图，按外标法以峰面积计算得到样品溶液中的5-羟甲基糠醛含量；其特征在于，所采用的色谱条件包括：用流动相进行梯度洗脱，所述流动相由流动相A和流动相B组成，所述的流动相A由0.7％冰醋酸水溶液和甲醇按照75:25的体积比例组成；所述的流动相B为甲醇；
所述的梯度洗脱条件是：
时间0分钟，采用流动相A进行洗脱；
时间10分钟，采用流动相A进行洗脱；
时间12分钟，由流动相A和流动相B按照40:60的体积比例组成的流动相进行洗脱；
时间20分钟，由流动相A和流动相B按照40:60的体积比例组成的流动相进行洗脱；
时间22分钟，采用流动相A进行洗脱；
时间35分钟，采用流动相A进行洗脱。
2.按照权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所采用的色谱条件包括：所采用的色谱柱为C18色谱柱。
3.按照权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所采用的色谱条件包括：所采用的检测波长为284nm。
4.按照权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所采用的色谱条件包括：所采用的流速为0.5ml/min。
5.按照权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所采用的色谱条件包括：所采用的柱温为25℃。
6.按照权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，分别精密取对照品溶液和待测试医药产品的样品溶液各5-20μl注入色谱仪。
7.按照权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述5-羟甲基糠醛对照品溶液浓度为1.4-14ug/ml。
8.按照权利要求7所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述5-羟甲基糠醛对照品溶液浓度为7-14ug/ml。
9.按照权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，5-羟甲基糠醛与临近峰的分离度不小于2.0，理论塔板数以5-羟甲基糠醛计不低于3000。
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