CN115902026B - 一种吲哚布芬片中新杂质的分离检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种吲哚布芬片中新杂质的分离检测方法，涉及医药检测技术领域。所述新杂质为杂质C，步骤如下：采用HPLC法，以十六烷基键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测，流动相A为高氯酸盐缓冲溶液；流动相B为0.5%三氟乙酸的四氢呋喃。该检测方法专属性强、灵敏度高、准确性好、操作方便，可有效控制药品品质。

Description

一种吲哚布芬片中新杂质的分离检测方法

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种吲哚布芬片中新杂质的分离检测方法。

背景技术

肾病综合征是一个较难治的疾病，对难治性肾病综合征一直没有最佳或者特殊的治疗手段，临床治疗中主要对患者使用糖皮质激素从而达到控制疾病发展的目的，随着糖皮质激素在患者治疗中被广泛使用，人们发现其治疗效果较为有限，不能满足难治性肾病综合征患者的治疗需求。而且肾病综合征由于血液粘稠度增加、机体凝血抗凝和纤溶系统失衡、血小板过度激活、以及利尿剂和糖皮质激素等进一步加重高凝状态，因此肾病综合征尤其是难治性肾病综合征易发生血栓、栓塞并发症，是直接影响肾病综合征治疗效果和预后的重要原因。所以治疗上当血浆白蛋白<20g/L时即应开始而防性抗凝抗血小板治疗。既往传统抗血小板药物双嘧达莫或阿司匹林疗效有限，而且胃肠道反应及出血等副作用较大。

吲哚布芬是一种抑制血小板大量聚集的受体抑制剂，为一类比较新颖的对血小板起到阻碍作用的药物，借助可逆性对血小板环氧化酶起到阻碍作用，降低血小板的凝聚效率，避免血栓的出现。吲哚布芬片是一种中国独家新型处方药，临床研究发现，在肾病综合征患者的治疗中效果较为显著，起到了良好的舒缓、治疗作用。吲哚布芬具有独特“双抗”特点，其抗血小板作用特点如下：①选择性：抑制血小板环氧化酶-1(COX-1)，使血栓素B2 生成减少；较低抑制前列环素的生成，胃肠反应更少。②可逆性：可逆抑制血小板功能，出血风险更低，出血后易于止血。③多途径：同时抑制二磷酸腺苷(ADP)、肾上腺素血小板活化因子(PAF)、胶原和花生四烯酸(AA)。其抗凝作用特点为：①降低血小板因子3、4 的释放；②降低凝血因子Ⅱ、Ⅹ的含量。

肾病综合征并发血栓或者血栓形成，确诊后应尽早开始抗凝治疗，通常采用静脉肝素抗凝5-7d，然后口服吲哚布芬维持1 年，高危者应维持更长。《国家基本药物临床应用指南》(2018) 中提到有关肾病综合征，当血浆白蛋白<20 g/L（模性肾病<25 g/L）时，应在抗凝的基础上，辅以口服吲哚布芬、双嘧达莫、阿司匹林等抗血小板聚集治疗。研究发现，使用吲哚布芬出血事件、胃肠道反应等总药物不良事件发生率低于阿司匹林，差异具有统计学意义(P<0.05)，在临床净效益（卒中、系统性栓塞、出血事件及全因死亡率）事件发生数上比较，可降低临床净效益事件发生数，且1年观察期内吲哚布芬组未观察到任何严重出血事件发生。

综上所述，吲哚布芬具有独特抗血小板作用和抗凝作用，且具有选择性、可逆性、多途径。在在难治性肾病综合征患者治疗中使用吲哚布芬片，效果可靠，安全性更好，胃肠道反应、出血等少，明显优于传统的抗血小板药物，更能起到良好的促进作用，值得在临床治疗中广泛使用。故健全吲哚布芬片杂质研究，有助于严格控制产品质量，在临床上有着重要的现实意义。

吲哚布芬片的国家药品标准中列出的吲哚布芬、杂质A及公开文献报道的杂质B结构式如下：

吲哚布芬

在吲哚布芬片研发过程中，发明人采用国家药品标准中的方法发现杂质A在放置过程有明显增长，在高温条件下增长尤为明显，增长至超过0.2%，会影响药品质量。

对比杂质A与吲哚布芬结构，杂质A应为工艺杂质，其在稳定性放置过程中不会有明显的增长趋势，推测有未知杂质在杂质A处降解产生，本品最大日剂量为400mg，根据ICH指导原则Q3B，本品杂质鉴定限为0.2%，故需将该未知杂质分离并确证该杂质结构，加以严格控制，以保证产品的质量。

中国专利（CN114594168A）公开了一种吲哚布芬杂质的检测方法，以十八烷基硅烷键合硅胶或辛烷基键合硅胶为固定相进行色谱分离，采用紫外检测仪进行分析检测；所述流动相为溶剂A和溶剂B的混合，所述溶剂A为磷酸缓冲溶液，所述的溶剂B选自甲醇、乙腈或两者混合。期刊文献（HPLC-MS/MS法同时测定吲哚布芬中4个基因毒性杂质，石小娜等，《药物分析杂志》）采用 HPLC-MS/MS方法同时检测吲哚布芬中的4个杂质，具有快速准确，简单高效的特点，检测限和定量限、线性、重复性、准确度、稳定性和耐用性均符合方法学验证要求。然而以上专利和期刊文献均只实现了现有技术中已知杂质的分离和检测，并不涉及上述未知杂质的分离和检测。

考虑到国家药品标准中的方法以及现有技术采用的方法对该未知杂质的专属性较差，故需要重新开发吲哚布芬片的杂质检测方法，更好的实现吲哚布芬片中各杂质的检出和分离，并对以上未知杂质进行结构鉴定，明确其结构，利于对吲哚布芬片进行质量控制，从而解决产品的安全性问题。

发明内容

为克服以上技术问题，本发明提供了一种吲哚布芬片中新杂质（即杂质C）的分离检测方法，采用HPLC法，以十六烷基键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中流动相A为高氯酸盐缓冲溶液，流动相B为0.5%三氟乙酸的四氢呋喃。该检测方法能够有效分离测定吲哚布芬片中的杂质C，专属性强、灵敏度高、操作方便。此外，本发明还对分离的杂质C进行富集，并进行结构鉴定，明确了新杂质的结构，可通过监测杂质C来有效控制药品品质。

为实现以上目的，本发明提供了一种吲哚布芬片中新杂质的分离检测方法，步骤如下：

采用HPLC法，以十六烷基键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测。

其中，新杂质为杂质C，杂质C结构式为

。

其中，所述流动相A为高氯酸盐缓冲溶液；流动相B为0.5%三氟乙酸的四氢呋喃。

其中，高氯酸盐选自高氯酸钾、高氯酸钠、高氯酸铵中的任一种或多种，优选为高氯酸钠；高氯酸盐的浓度为10-30mmol/L，优选为20mmol/L；高氯酸盐的pH为4.5-6.0，优选为5.0。

所述梯度洗脱过程设置如表1，其中，流动相A用量与流动相B用量之和为100%：

表1

优选梯度洗脱过程设置如表2：

表2 梯度洗脱过程

流速为0.5-1.5ml/min，优选为1.0 ml/min；检测波长为223-233nm，优选为228nm；优柱温为20- 40 ℃，优选为30 ℃；进样量为10μL。

与现有技术比，本发明的技术优势在于：

（1）本发明提供的HPLC法能有效分离测定吲哚布芬片中杂质C的含量，且灵敏度高、专属性强，检查结果可靠准确，有利于对吲哚布芬片中杂质的检出提供技术手段，从而对其进行质量控制。

（2）本发明富集得到了杂质C，检测其质谱及氢谱，得到杂质的质核比为426.3[M+H]⁺，结合该杂质的氢谱数据，根据吲哚布芬分子式并分析其可能的降解途径，推测出杂质C的结构，与目前已公布的已知杂质结构进行比较，确定为新杂质；

（3）本发明发现的新杂质可以为吲哚布芬片的质量控制和临床安全用药的安全性检测提供参考标准，从而保证临床用药的安全性和可靠性。

附图说明

图1为杂质C-LC-MS图。

图2杂质C-¹H-NMR图。

图3为专属性-空白溶液色谱图。

图4为专属性-空白辅料溶液色谱图。

图5为专属性-对照品溶液色谱图；其中峰1为吲哚布芬。

图6为吲专属性-供试品溶液色谱图；其中，峰1为吲哚布芬、峰2为杂质C。

图7为专属性-专属性溶液色谱图；

其中，峰1为杂质A、峰2为杂质B、峰3为吲哚布芬、峰4为杂质C。

图8为吲哚布芬的线性标准曲线图。

图9为杂质A线性标准曲线图。

图10为杂质B线性标准曲线图。

图11为杂质C线性标准曲线图。

现结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

以下将结合说明书附图，对本发明的优选实例进行详细描述。优选实例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明中的具体实施过程中使用的试剂、设备、工艺参数信息如下：

（1）吲哚布芬片的来源为浙江和沐康医药科技有限公司，批号：Z-IND2201055-3；规格0.2g；

（2）对照品来源信息如下：

吲哚布芬对照品：成都伊诺达博医药科技有限公司；批号：YB211022B；含量：99.9%；

杂质A对照品：成都伊诺达博医药科技有限公司；批号：211215；含量：91.6%；

杂质B对照品：成都伊诺达博医药科技有限公司；批号：CZY210907；含量：99.0%；

杂质C对照品：成都伊诺达博医药科技有限公司；批号：XB211018；含量：99.9%。

实施例

制备样品，采用HPLC法，以十六烷基键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测，流动相A为高氯酸盐缓冲溶液，流动相B为0.5%三氟乙酸的四氢呋喃。

其中，具体样品配制如下：

对照品溶液：取吲哚布芬对照品，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含2μg吲哚布芬的溶液。

供试品溶液：取本品（高温30天）10片，精密称定，研细，精密称取细粉260mg（约相当于吲哚布芬100mg），置于100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声5min，取出放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得；

分别取空白溶液（甲醇）、对照品溶液、供试品溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，计算杂质的含量。

其中，色谱条件如下：

仪器：Thermo Vanquish；

色谱柱：用十六烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Supelco SUPELCOSIL ABZ+Plus，4.6mm× 150mm，5µm）；

流动相A：20mmol/L高氯酸盐溶液，用高氯酸酸调节pH值至5.0（精密称取高氯酸钠适量，用水溶解并配置成20mmol/L的溶液，用高氯酸调pH值至5.0，过滤，超声脱气，即得）；

流动相B：0.5%三氟乙酸的四氢呋喃。

线性洗脱梯度如表3：

表3 洗脱梯度

检测器：UV；检测波长：228nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。

试验例

对以上方法进行方法学验证，验证项目包括专属性、定量限、检测限、线性、耐用性，具体如下：

实验一专属性

空白溶液：甲醇。

空白辅料溶液：精密称取空白辅料（总混）160.09mg，置100ml量瓶中，加入甲醇适量并超声，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过（针式过滤器使用为津腾、0.45μm×φ25mm、尼龙6），取续滤液，即得。

主成分贮备液：精密称取吲哚布芬对照品20.39mg，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液：精密移取主成分贮备液1ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品粉末：取本品20片，精密称定，研细，即得，20片供试品实际称样量为10.4644g。

供试品溶液：精密称取供试品粉末259.92mg，置于100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声5min，期间不时振摇，取出放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过（针式过滤器使用为津腾、0.45μm×φ25mm、尼龙6），取续滤液即得。

杂质A定位溶液：精密称取杂质A对照品1.005mg，置10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置50ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质B定位溶液：精密称取杂质B对照品0.996mg，置10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置50ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质C定位溶液：精密称取杂质C对照品0. 957mg，置10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置50ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质贮备液：精密称取杂质A对照品2.480mg、杂质B对照品2.544mg、杂质C对照品2.524mg，置同一25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

专属性溶液：精密称取供试品粉末260.20mg，置于100ml量瓶中，加入甲醇适量并超声，取出放冷，加入杂质贮备液2ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过（针式过滤器使用为津腾、0.45μm×φ25mm、尼龙6），即得。

按上述色谱条件，精密量取空白溶液、空白辅料溶液、对照品溶液、供试品溶液、各杂质定位溶液及专属性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，专属性结果见表4、专属性溶液色谱图见附图5。

表4 专属性

结果表明：专属性溶液中各杂质与前后杂质分离度均大于1.5，分离度良好，本发明提供的分离检测方法专属性好。

实验二定量限

杂质A对照品贮备液、杂质B对照品贮备液、杂质C对照品贮备液：配制同“专属性”项下。

主成分贮备液：精密称取吲哚布芬对照品20.08mg，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

定量限贮备液：精密量取杂质贮备液2ml，主成分贮备液1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

定量限溶液：精密量取定量限贮备液1ml，置10ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（平行配制6份）。

按上述色谱条件，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算6份吲哚布芬和杂质峰面积的RSD%。定量限结果见表5-表8。

表5定量限试验（杂质A）

表6定量限试验（杂质B）

表7 定量限试验（吲哚布芬）

表8 定量限试验（杂质C）

结果表明：6份定量限溶液各峰信噪比均大于10，各杂质峰峰面积相对标准偏差（RSD）均小于10%。当样品浓度为1mg/ml时，杂质A、杂质B、杂质C、其他单杂分别在超出供试品浓度的0.02%时，可被准确定量。

实验三检测限

检测限溶液1（杂质A）：精密移取3ml杂质A定量限溶液，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

检测限溶液2（杂质B）：精密移取3ml杂质B定量限溶液，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

检测限溶液3（杂质C）：精密移取3ml杂质C定量限溶液，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

检测限溶液4（吲哚布芬）：精密移取3ml吲哚布芬定量限溶液，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

取上述溶液，按上述色谱条件，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，检测限结果见表9。

表9 检测限试验

结果表明：杂质A、杂质B、吲哚布芬、杂质C的信噪比分别为4.6、9.9、9.8、4.3，均大于3。当样品浓度为1mg/ml时，杂质A、杂质B、杂质C、其他单杂分别超出供试品浓度的0.005%、0.006%、0.006%、0.006%时，杂质可被检出，方法检测灵敏度高。

实验四线性与范围

吲哚布芬贮备液：同“实验二定量限”项下。

杂质贮备液：同“实验一专属性”项下。

线性（定量限）：分别精密移取吲哚布芬贮备液0.1ml、杂质贮备液0.2ml置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

线性（50%）：分别精密移取吲哚布芬贮备液0.5ml、杂质贮备液1ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

线性（100%）：分别精密移取吲哚布芬贮备液1ml、杂质贮备液2ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

线性（150%）：分别精密移取吲哚布芬贮备液1.5ml、杂质贮备液3ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

线性（200%）：分别精密移取吲哚布芬贮备液1ml、杂质贮备液2ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

精密量取上述线性溶液各10μl，注入液相色谱仪（Thermo Vanquish），记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作线性回归方程。计算杂质的校正因子。结果见表10-表13、附图6-附图9。

杂质的校正因子=主成分线性回归方程斜率/杂质线性回归方程斜率

表10线性-吲哚布芬

表11线性-杂质A

表12线性-杂质B

表13线性-杂质C

结果表明：杂质A、杂质B、杂质C、吲哚布芬在各自的浓度范围内，线性回归方程的相关系数（r）均大于0.995，Y轴截距均在100%响应值的10%以内，响应因子的RSD%均在10%以内，均符合要求，本方法线性关系良好。

实验五耐用性

取专属性溶液，进行耐用性考察结果如下。

表14耐用性

结果表明：36h内单个杂质及总杂均无明显变化，溶液稳定性良好，本方法耐用性良好。

最后应当说明的是，上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种吲哚布芬片中新杂质的分离检测方法，其特征在于：包含如下步骤：采用HPLC法，以十六烷基键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测，流动相A为高氯酸盐缓冲溶液，流动相B为0.5%三氟乙酸的四氢呋喃；

所述新杂质为杂质C，杂质C结构式为：

；

所述梯度洗脱过程设置如下：

0分钟，流动相A用量为80%，流动相B 用量为20%；

15分钟，流动相A用量为55%，流动相B 用量为45%；

65分钟，流动相A用量为40%，流动相B 用量为60%；

70分钟，流动相A用量为30%，流动相B 用量为70%；

85分钟，流动相A用量为20%，流动相B 用量为80%；

86分钟，流动相A用量为80%，流动相B 用量为20%；

100分钟，流动相A用量为80%，流动相B 用量为20%；

检测器的检测波长为228nm。

2.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于，该分离检测方法可同时实现杂质A和杂质B的分离，杂质A和杂质B的结构式如下：

。

3.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于，所述高氯酸盐缓冲溶液中，高氯酸盐选自高氯酸钾、高氯酸钠、高氯酸铵中的任一种或多种。

4.如权利要求3所述的分离检测方法，其特征在于，所述高氯酸盐的浓度为10-30mmol/L，pH为4.5-6.0。

5.如权利要求4所述的分离检测方法，其特征在于，所述高氯酸盐的浓度为20mmol/L，pH为5.0。

6.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.5-1.5ml/min。

7.如权利要求6所述的分离检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为1ml/min。

8.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于，样品检测过程中的进样量为10μL；检测过程中色谱柱的柱温为20-40℃。

9.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于，流动相A配置方式包括如下步骤：取20mmol/L高氯酸盐溶液，用高氯酸调节pH值至5.0。

10.如权利要求9所述的分离检测方法，其特征在于，流动相A配置方式包括如下步骤：精密称取高氯酸钠适量，用水溶解并配置成20mmol/L的溶液，用高氯酸调pH值至5.0，过滤，超声脱气，即得。

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