CN117783344A - 一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的hplc方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，色谱柱采用苯基硅烷键合硅胶为填充剂，调节柱温为25‑35℃，流动相流速为0.7ml/min‑0.9ml/min，检测波长为253nm‑255nm，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，用于人体血浆中利奈唑胺及其代谢产物PNU142300、PNU142586的浓度检测。具体操作步骤为：制备待测定利奈唑胺及其代谢产物的人体血浆样品，设置标准品和对照品溶液，加入蛋白沉淀剂以沉淀其中的蛋白质，离心分离出上清液，将上清液注入HPLC系统进行检测分析。本发明能够同时测定人体血浆中利奈唑胺及其代谢物PNU142300、PNU142586的含量，操作方法简单，检测设备成本低，检测结果准确稳定，便于临床上进行推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱)方法。
背景技术
利奈唑胺是人工合成的噻唑烷酮类抗生素，2000年由FDA批准上市，2006年获批进入我国。利奈唑胺通过与病原菌核糖体50S亚基上RNA结合，抑制70S转录起始复合物的形成，干扰蛋白质合成过程，从而发挥抗菌作用，主要用于耐药金黄色葡萄球菌引起的院内或社区获得性肺炎、皮肤软组织感染及耐万古霉素屎肠球菌导致的G+感染，是特殊使用级抗菌药物。利奈唑胺在体内经非肝药酶途径代谢，其吗啉环氧化，进而产生两个无活性的开环羧酸代谢产物PNU142300、PNU142586，但具体的代谢酶及机制尚不明确，原型药物及代谢产物主要经肾随尿液排泄。
利奈唑胺有效率约为82.2％，但治愈率仅为9.3％，其不良反应主要包括血小板减少症、周围神经病变、乳酸酸中毒、视神经病变等，发生率约为16.9％，但在重症患者中血小板减少症的发生率高达35.9％-48.3％，如何提高利奈唑胺抗感染的疗效，同时减少其主要不良反应是临床亟需解决的问题(Ma A,Dong M,Cheng J,et al.2023；Xu J,Lu J,Yuan Y,et al.2023)。
Ma A,Dong M,Cheng J,et al.Clinical efficacy and safety of linezolidin intensive care unit patients[J].Journal ofIntensive Medicine,2023,3(01):65-72.
Xu J,Lu J,Yuan Y,et al.Establishment and validation of a riskprediction model incorporating concentrations of linezolid and its metabolitePNU142300for linezolid-induced thrombocytopenia[J].Journal of AntimicrobialChemotherapy,2023:dkad191.
利奈唑胺的疗效、不良反应与其原型药物及代谢产物浓度密切相关，国外的研究显示利奈唑胺谷浓度大于8μg/ml时，易导致患者血小板减少症的发生；国内的研究表明利奈唑胺谷浓度高于7.85μg/ml时，血小板减少症发生率高达50％以上，而谷浓度低于2μg/mL时则难以产生抗菌效力(Fang J,Chen C,Wu Y,et al.2020；自雪梅,张峻,何瑾.2022)。
Fang J,Chen C,Wu Y,et al.Does the conventional dosage of linezolidnecessitate therapeutic drug monitoring—Experience from a prospectiveobservational study[J].Annals of Translational Medicine,2020,8(7).
自雪梅,张峻,何瑾.利奈唑胺血药浓度监测研究进展[J].中国现代应用药学,2022,39(03):424-428.
最新的研究表明血小板减少症产生与PNU142300、PNU142586在体内的蓄积有关，肾功能不全患者的PNU142300、PNU142586浓度较正常患者分别升高了2.3倍和1.8倍，血小板减少症的发生率显著增高，且PNU142300与利奈唑胺的比值大于1.3可作为血小板减少的预测指标，灵敏度高达83％。已有文献根据PNU142300和PNU142586的浓度，建立利奈唑胺引起血小板减少症预测模型，同时检测利奈唑胺原型药物、PNU142300及PNU142586浓度，依据浓度调整用药方案可有效的提高利奈唑胺抗感染治疗的疗效并减少不良反应(Xu J,Lu J,Yuan Y,et al.2023)。
Xu J,Lu J,Yuan Y,et al.Establishment and validation of a riskprediction model incorporating concentrations of linezolid and its metabolitePNU142300for linezolid-induced thrombocytopenia[J].Journal of AntimicrobialChemotherapy,2023:dkad191.
目前利奈唑胺已有较成熟的临床检测技术，但由于PNU142300与PNU142586化学结构相似，且在体内的浓度水平较低，因此能够同时检测利奈唑胺、PNU142300和PNU142586的方法较少，出现报道的仅有LC-MS/MS液相色谱串联质谱技术和一例报告采用UPLC超高效液相色谱技术(Sakurai N,Nakamura Y,et al.2019)，
Sakurai N,Nakamura Y,et al.Measurement of Linezolid and ItsMetabolites PNU-142300and PNU-142586in Human Plasma Using Ultra-PerformanceLiquid Chromatography Method.Chem Pharm Bull(Tokyo).2019；67(5):439-444.doi:10.1248/cpb.c18-00840.PMID:31061368.
以上两种技术均采用C18色谱柱，虽然能同时检测利奈唑胺、PNU142300与PNU142586的浓度，由于LC-MS/MS、UPLC仪器昂贵，操作复杂，检测及维护成本较高，且LC-MS/MS检测结果稳定性较差，检测方法难以推广普及。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于如何降低同时检测利奈唑胺及其代谢产物PNU142300、PNU142586的检测成本。
本发明提供了一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，HPLC色谱条件具体包括：
色谱柱采用苯基硅烷键合硅胶为填充剂，调节柱温为25-35℃，调节流动相流速为0.7ml/min-0.9ml/min，调节检测波长为253nm-255nm，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述的梯度洗脱是将所述流动相的总体积为100％计，
0～1min，流动相A的体积为10％A，流动相B的体积为90％B；
1～5min，流动相A的体积由10％递增为30％，流动相B的体积由90％递减为70％；
5～8.5min，流动相A的体积由30％递增为70％，流动相B的体积由70％递减为30％；
8.5～11.6min，流动相A的体积为70％A，流动相B的体积为30％B；
11.6～11.8min，流动相A的体积由70％递减为30％，流动相B的体积由30％递增为90％；
11.8～15min，流动相A的体积为10％A，流动相B的体积为90％B。
采用高效液相色谱仪器进行检测，使用设备简单、检测成本低。
进一步的，所述的代谢产物为PNU142300和PNU142586。
流动相的比例对利奈唑胺杂质及其代谢产物的分离有较大影响，采用上述梯度洗脱的方式能够将利奈唑胺杂质及其代谢产物PNU142300和PNU142586进行很好的分离，出峰位置无内源性物质干扰，检测方法快速、简便、准确。
进一步的，所述HPLC方法的色谱系统包括Waters2695高效液相色谱仪和配备Waters2489的紫外检测器；
进一步的，所述的色谱柱规格为4.6×150mm，3μm的Ultimate PFP分析柱；
进一步的，所述的流动相A为乙腈，B为pH为3.4的20mM磷酸二氢钾溶液；
所述的HPLC方法用于人体血浆中利奈唑胺及其代谢产物PNU142300、PNU142586的浓度检测，具体的检测方法为：
S1.制备待测定利奈唑胺及其代谢产物的人体血浆样品，加入蛋白沉淀剂到样品中以沉淀其中的蛋白质；
S2.将沉淀后的样品进行涡旋振荡后，放置4℃条件下离心速度为14000-18000rpm/min离心8-12分钟，分离得到上清液；
S3.取上清液注入HPLC系统，在所述的色谱条件下进行检测，记录色谱图；
S4.采用空白血浆稀释标准品溶液，按照所述的S1～S3步骤进行标准品溶液检测处理，以分析物浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线；
S5.设立对照品溶液，按照所述的S1～S3步骤进行处理检测。
该检测方法对人体血浆样本中的利奈唑胺与其代谢产物PNU142300、PNU142586均可有效分离，专属性强、重现性高、检测结果准确稳定，大大降低了利奈唑胺与其代谢产物的检测成本和检测难度，易于在临床上进行推广应用。
进一步的，所述的蛋白沉淀剂为甲醇。
进一步的，所述上清液的进样量为10μl，注入HPLC进行测量。
进一步的，所述待测定利奈唑胺及其代谢产物的人体血浆样品与蛋白沉淀剂的比例为1:3。
该检测方法能够依据人体的药物浓度调整利奈唑胺的用药方案，可有效地提高利奈唑胺抗感染的疗效，并减少药物的不良反应。
本发明的优点在于：
1、本发明提供了一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，采用高效液相色谱仪器进行检测，使用设备简单、检测成本低，能够将利奈唑胺杂质及其代谢产物PNU142300和PNU142586进行很好的分离，出峰位置无内源性物质干扰，检测方法快速、简便、准确。
2、该检测方法对人体血浆样本中的利奈唑胺与其代谢产物PNU142300、PNU142586均可有效分离，专属性强、重现性高、检测结果准确稳定，大大降低了利奈唑胺与其代谢产物的检测成本和检测难度，易于在临床上进行推广应用。
3、该检测方法能够依据人体的药物浓度调整利奈唑胺的用药方案，可有效地提高利奈唑胺抗感染的疗效，并减少药物的不良反应。
附图说明
图1为本发明实施例中PNU142586标准曲线的线性示意图；
图2为本发明实施例中PNU142300标准曲线的线性示意图；
图3为本发明实施例中利奈唑胺标准曲线的线性示意图；
图4为本发明实施例中有关专属性方法学验证的色谱示意图。
其中A空白血浆；B空白血浆稀释的标准品；C患者血浆；D甲醇溶液稀释的标准品；1为PNU142586；2为PNU142300；3为利奈唑胺。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
本实施例提供一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，具体采用以下方法进行测定：
(一)仪器及色谱条件
色谱系统为Waters2695高效液相色谱仪和配备Waters2489的紫外检测器；色谱柱采用苯基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱的规格为4.6×150mm，3μm的Ultimate PFP分析柱；流动相A：乙腈，流动相B：精密称定适量的磷酸二氢钾，加水溶解并定量稀释制成20mM的溶液，用磷酸调节pH值至3.4。调节柱温为25-35℃，流动相流速为0.7ml/min-0.9ml/min，检测波长为253nm-255nm，具体优选柱温为：30℃，流速：0.8ml/min，检测波长为254nm，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相的总体积为100％计：
0～1min，流动相A的体积为10％A，流动相B的体积为90％B；
1～5min，流动相A的体积由10％递增为30％，流动相B的体积由90％递减为70％；
5～8.5min，流动相A的体积由30％递增为70％，流动相B的体积由70％递减为30％；
8.5～11.6min，流动相A的体积为70％A，流动相B的体积为30％B；
11.6～11.8min，流动相A的体积由70％递减为30％，流动相B的体积由30％递增为90％；
11.8～15min，流动相A的体积为10％A，流动相B的体积为90％B。
(二)样本处理
样本处理：取待测定利奈唑胺及其代谢产物的人体血浆样品100μL，加入300μL蛋白沉淀剂到样品中以沉淀其中的蛋白质，具体优选甲醇作为蛋白沉淀剂，将沉淀后的样品涡旋振荡2分钟，在4℃条件下离心速度为14000-18000rpm/min的条件下离心8-12分钟，具体优选离心速度为16000rpm/min，离心时间为10分钟，分离出上清液，即为待测样品溶液。
(三)标准曲线的建立
分别精密称取利奈唑胺及其代谢产物PNU142586、PNU142300各适量，
采用空白血浆稀释制备成血浆中浓度为40、20、10、5、2.5、1.25、0.4μg/mL的利奈唑胺，浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.2μg/mL的PNU142586和PNU142300，作为标准品溶液，其余同(二)样品处理的方法，离心得上清液即为进样的标准品溶液。
分别取各个浓度的进样标准品溶液，注入HPLC系统，进样量为10μl，采用(一)仪器及色谱条件进行检测，记录色谱图，以利奈唑胺及其代谢产物PNU142586、PNU142300分析物的浓度作为横坐标，以其对应的色谱峰面积作为纵坐标，分别绘制标准曲线，具体数据如图1、图2和图3所示，
PNU142586标准曲线的线性方程：Y＝7228.1X+2955.4，相关系数：
R2＝0.9994；
PNU142300标准曲线的线性方程：Y＝12121X+5073.1，相关系数：R2＝0.999；
利奈唑胺标准曲线的线性方程：Y＝10111X+7446.3，相关系数：R2＝0.999；
因此，利奈唑胺在0.4μg/mL-40μg/mL范围内、PNU142586在0.2μg/mL-20μg/mL范围内、PNU142300在0.2μg/mL-20μg/mL范围内，均线性良好，相关系数R2＞0.99。
(四)设置对照品
同时设立2份对照品溶液，一份是空白血浆，用于检测空白血浆对样本是否存在干扰；另一份采用甲醇溶液对标准品进行稀释，用于检测蛋白沉淀剂甲醇溶液对样本是否存在干扰，制备方法同(三)中标准溶液的制备。
(五)方法学验证
采用上述配制的待测样品溶液、标准品溶液以及对照品溶液，精密量取各个溶液的进样量10μl，注入液相色谱仪，采用(一)仪器及色谱条件进行检测，分别对利奈唑胺、PNU142586和PNU142300的专属性、日内日间精密度、回收率和准确度，以及稳定性进行方法学验证。
①专属性试验
结论：色谱图如图4所示，其中A：空白血浆、B：空白血浆稀释的标准品、C：患者血浆、D：采用甲醇溶液稀释的标准品溶液。待测样品和标准品中的利奈唑胺、PNU142586和PNU142300主峰之间分离，PNU142586出峰时间为6.3min，PNU142300出峰时间为7.4min，利奈唑胺出峰时间为8.3min，在此色谱条件下利奈唑胺、PNU142586和PNU142300相互分离，出峰位置无内源性物质干扰，本方法的专属性良好。
②日内、日间精密度
采用空白血浆稀释的各个浓度的标准品溶液，重复分析测定5次，进行日内、日间准确度和精密度的方法学验证，有关检测数值如表1。
表1.日内、日间准确度和精密度实验结果
结论：浓度分别为0.2μg/mL、0.625μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL的PNU14258进行日内精密度考察的RSD值均在1.46％-4.11％之间，日间精密度考察的RSD值均在0.02％-4.84％之间。
浓度分别为0.2μg/mL、0.625μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL的PNU142300进行日内精密度考察的RSD值均在1.09％-4.57％之间，日间精密度考察的RSD值均在1.09％-3.29％之间。
浓度分别为0.4μg/mL、1.25μg/mL、5μg/mL、20μg/mL的利奈唑胺进行日内精密度考察的RSD值均在1.49％-3.56％之间，日间精密度考察的RSD值均在1.57％-4.13％之间。
因此，在该方法中利奈唑胺、PNU142586和PNU142300日内精密度、日间精密度的RSD均小于5.0％，结果良好。
③回收率和准确度试验
采用空白血浆稀释的各个浓度的标准品溶液，重复分析测定5次，进行回收率的方法学验证，以含药血浆利奈唑胺、PNU142586和PNU142300峰面积与甲醇溶液相应面积的比值表示回收率；用标准曲线法测得含药血浆内利奈唑胺、PNU142586和PNU142300浓度与配制浓度比值为准确度，有关检测数值如表2。
表2.回收率实验结果
结论：浓度分别为0.2μg/mL、0.625μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL的PNU142586的回收率在90.04％～99.48％之间，准确度在83.96％～104.08％之间。
浓度分别为0.2μg/mL、0.625μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL的PNU142300的回收率在90.14％～95.19％之间，准确度在82.92％～103.82％之间。
浓度分别为0.4μg/mL、1.25μg/mL、5μg/mL、20μg/mL的利奈唑胺的回收率在94.34％～97.35％之间，准确度在81.98％～98.44％之间。
因此在该方法中利奈唑胺、PNU142586和PNU142300回收率均≥90％、准确度均≥80％，回收率和准确度均良好。
④稳定性试验
采用空白血浆稀释的各个浓度的标准品溶液，进行3种条件下的稳定性考察：在室温放置24h、4℃条件下放置7天和-80℃条件下进行三次冻融循环处理，取稳定性考察后的标准品溶液进行检测，重复分析测定5次，有关检测数值如表3。
表3稳定性实验结果
结论：浓度分别为0.2μg/mL、0.625μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL的PNU14258溶液在室温放置24h进行稳定性考察的RSD值均在1.84％～4.89％之间，在4℃放置7天进行稳定性考察的RSD值均在0.78％～4.32％之间，在-80℃冻融三次进行稳定性考察的RSD值均在0.09％～4.95％之间。
浓度分别为0.2μg/mL、0.625μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL的PNU142300溶液在室温放置24h进行稳定性考察的RSD值均在2.23％～5.00％之间，在4℃放置7天进行稳定性考察的RSD值均在1.15％～3.31％之间，在-80℃冻融三次进行稳定性考察的RSD值均在1.82％～4.93％之间。
浓度分别为0.4μg/mL、1.25μg/mL、5μg/mL、20μg/mL的利奈唑胺溶液在室温放置24h进行稳定性考察的RSD值均在0.35％～2.16％之间，在4℃放置7天进行稳定性考察的RSD值均在0.07％～4.00％之间，在-80℃冻融三次进行稳定性考察的RSD值均在2.45％～4.16％之间。
因此，将利奈唑胺、PNU142586和PNU142300进行室温放置24h、4℃条件下放置7天和-80℃条件下三次冻融循环处理的稳定性验证，RSD均≤5％，溶液的稳定性良好。
综合上述验证试验，本发明的HPLC方法同时检测人体血液中利奈唑胺及其代谢产物PNU142586、PNU142300的浓度，无干扰、专属性强，精密度、回收率和准确度高，检测结果准确稳定，操作方法简单，检测设备成本低，便于临床上进行推广应用。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，其特征在于：
HPLC色谱条件包括，色谱柱采用苯基硅烷键合硅胶为填充剂，调节柱温为25-35℃，流动相流速为0.7ml/min-0.9ml/min，检测波长为253nm-255nm，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述的梯度洗脱是将所述流动相的总体积为100％计，
0～1min，流动相A的体积为10％A，流动相B的体积为90％B；
1～5min，流动相A的体积由10％递增为30％，流动相B的体积由90％递减为70％；
5～8.5min，流动相A的体积由30％递增为70％，流动相B的体积由70％递减为30％；
8.5～11.6min，流动相A的体积为70％A，流动相B的体积为30％B；
11.6～11.8min，流动相A的体积由70％递减为30％，流动相B的体积由30％递增为90％；
11.8～15min，流动相A的体积为10％A，流动相B的体积为90％B。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，其特征在于：所述的代谢产物为PNU142300和PNU142586。
3.根据权利要求1所述的一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，其特征在于：所述HPLC方法的色谱系统包括Waters2695高效液相色谱仪和配备Waters2489的紫外检测器。
4.根据权利要求1所述的一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，其特征在于：所述的色谱柱规格为4.6×150mm，3μm的Ultimate PFP分析柱。
5.根据权利要求1所述的一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，其特征在于：所述的流动相A为乙腈，B为pH为3.4的20mM磷酸二氢钾溶液。
6.根据权利要求1所述的一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，其特征在于：所述的HPLC方法用于人体血浆中利奈唑胺及其代谢产物PNU142300、PNU142586的含量检测。
7.根据权利要求6所述的一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，其特征在于：所述人体血浆中利奈唑胺及其代谢产物PNU142300、PNU142586的HPLC检测方法的具体操作步骤为：
S1.制备待测定利奈唑胺及其代谢产物的人体血浆样品，加入蛋白沉淀剂到样品中以沉淀其中的蛋白质；
S2.将沉淀后的样品进行涡旋振荡后，放置4℃条件下离心速度为14000-18000rpm/min离心8-12分钟，分离得到上清液；
S3.取上清液注入HPLC系统，在所述的色谱条件下进行检测，记录色谱图；
S4.采用空白血浆稀释标准品溶液，按照所述的S1～S3步骤进行标准品溶液检测处理，以分析物浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线；
S5.设立对照品溶液，按照所述的S1～S3步骤进行处理检测。
8.根据权利要求7所述的一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，其特征在于：所述的蛋白沉淀剂为甲醇。
9.根据权利要求7所述的一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，其特征在于：所述上清液的进样量为10μl，注入HPLC进行测量。
10.根据权利要求7所述的一种同时测定利奈唑胺及其代谢产物的HPLC方法，其特征在于：所述待测定利奈唑胺及其代谢产物的人体血浆样品与蛋白沉淀剂的比例为1:3。
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