CN115436515B - 一种米铂脂质体包封率的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，具体公开一种米铂脂质体包封率的检测方法。本发明提供的米铂脂质体包封率的检测方法，通过向米铂脂质体分散液中加入特定量的磷酸盐缓冲溶液，中和米铂脂质体表面的电荷，使米铂脂质体充分发生凝聚，且凝聚后的米铂脂质体的密度小于磷酸盐溶液，因此，离心后米铂脂质体上浮，通过简单过滤就可实现凝聚脂质体与游离药物的快速有效分离，且磷酸盐缓冲液不会干扰游离米铂的测定，也不会导致米铂降解，保证了游离米铂和脂质体中米铂含量测试的准确度，从而保证了米铂脂质体包封率测试的准确度，有利于更好地监控米铂脂质体产品的质量，对米铂脂质体产品的开发提供有力保障。

Description

一种米铂脂质体包封率的检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种米铂脂质体包封率的检测方法。

背景技术

米铂(Miriplatin)为脂溶性铂类金属络合物，是由日本住友制药株式会社研发并开发上市的新型铂(II)类抗肿瘤药物，主要用于治疗肝细胞癌，具有良好的疗效和安全性。米铂作为一种脂溶性铂类络合物，极低的水溶性使其难以制备成常规注射剂。米铂的常规使用方法是溶于碘化罂粟子油制成混悬液，通过经导管肝动脉化疗栓塞术(TACE)，肝动脉内给药(即介入治疗)，2010年1月，米铂及专用混悬液上市销售。但是，米铂的混悬液制剂长时间放置时出现粘度随时间延长而增加、混悬液分离成两层的问题，制剂的稳定性较差。

米铂脂质体是以米铂为基础制备的新型纳米药物，载药量大，完全溶于水，可静脉全身给药，扩大了肿瘤种类治疗范围，具有重要的临床应用价值。米铂脂质体的包封率是决定其药效的关键因素。包封率指的是包封在脂质双分子层中的药物含量占投药量的百分比，包封率测定的关键是将包封药物和未包封药物分离，再利用光谱、色谱等分析手段检测包封药物或游离药物的浓度。目前，常用的包封率的测定方法有离心法、超滤离心法、葡聚糖凝胶柱法、微微柱离心法、透析与反透析法、鱼精蛋白法、固相萃取法和荧光法等。由于米铂不溶于水的性质，目前有文献报道的米铂脂质体包封率的检测方法主要为超高速离心法。但是，此方法较强的离心力作用可能会破坏脂质体的双分子层结构，导致药物发生泄漏，导致包封率测试结果偏高。且超高速离心仅能使大部分脂质体沉淀，但是仍会有粒径小的脂质体存在于上清液中，因此，上清液中并非单纯是游离米铂，还包括未沉淀的小粒径米铂脂质体。为了更好地监控米铂脂质体产品的质量，保证米铂脂质体产品质量的一致性和稳定性，有必要研发一种准确度高且操作简便的米铂脂质体包封率的检测方法。

发明内容

针对现有技术中米铂脂质体包封率的检测方法准确度不高的问题，本发明提供一种米铂脂质体包封率的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

一种米铂脂质体包封率的检测方法，包括如下步骤：

步骤a，将米铂脂质体分散于水中，加入磷酸盐缓冲液，混合均匀，得凝聚米铂脂质体悬浮液；将所述凝聚米铂脂质体悬浮液离心，过滤，得凝聚米铂脂质体和游离米铂供试品溶液；其中，所述凝聚米铂脂质体悬浮液中磷酸盐的质量百分含量为20％-30％；

步骤b，将所述凝聚米铂脂质体加入水中，混合均匀，加入稀释剂稀释，过滤，得米铂脂质体供试品溶液；

步骤c，采用高效液相色谱法对所述游离米铂供试品溶液和米铂脂质体供试品溶液进行检测。

相对于现有技术，本发明提供的米铂脂质体包封率的检测方法，向米铂脂质体分散液中加入特定量的磷酸盐缓冲溶液，中和米铂脂质体表面的电荷，使米铂脂质体充分发生凝聚，且凝聚后的米铂脂质体的密度小于磷酸盐溶液，因此，离心后米铂脂质体上浮，通过简单过滤就可实现凝聚脂质体与游离药物的快速有效分离，且磷酸盐缓冲液不会干扰游离米铂的测定，也不会导致米铂降解，保证了游离米铂和脂质体中米铂含量测试的准确度，从而保证了米铂脂质体包封率测试的准确度，有利于更好地监控米铂脂质体产品的质量，对米铂脂质体产品的开发提供有力保障。

优选的，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢盐-磷酸氢二盐缓冲液。

优选的，所述磷酸二氢盐与磷酸氢二盐的质量比为1:0.9-1.1。

优选的，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液或磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液。

优选的，所述磷酸盐缓冲液中磷酸二氢盐或磷酸氢二盐的浓度均为200mg/mL-300mg/mL。

优选的磷酸盐缓冲液有利于使米铂脂质体充分发生凝聚，实现游离米铂与脂质体中米铂的充分分离，从而有利于提高包封率检测的准确度。

需要说明的是，步骤a中，为了提高米铂脂质体包封率测试结果的可靠性，选择5支米铂脂质体产品，每支米铂脂质体产品中加入3.7mL水，混合均匀，然后再合并5支米铂脂质体分散液，从米铂脂质体分散液中取2mL加入磷酸盐缓冲液。

需要说明的是，步骤b中，为了提高米铂脂质体包封率检测结果的准确度，将过滤后的滤纸与凝聚米铂脂质体共同加入水中，且将步骤a中离心后的离心管用水洗涤后，再加入稀释剂洗涤多次，直至洗涤液目视无可见凝聚物，将洗涤液合并后也加入滤纸和凝聚米铂脂质体的体系中。

优选的，检测游离米铂供试品溶液和米铂脂质体供试品溶液的高效液相色谱的条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；

流动相A：水；

流动相B：体积比为88-92:12-8的甲醇-乙腈的混合溶液；

UV检测器，检测波长：208nm-212nm；

梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：

0min，5％-15％流动相A，95％-85％流动相B；

3min，100％流动相B；

8min，100％流动相B；

8.1min，5％-15％流动相A，95％-85％流动相B；

15min，5％-15％流动相A，95％-85％流动相B。

本发明提供的米铂脂质体包封率的检测方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶柱，通过特定的流动相，以特定的梯度洗脱方式，实现了米铂与各杂质、辅料间的有效分离，从而实现了游离米铂和脂质体中米铂含量的检测。且本发明提供的方法经专属性、准确度、精密度等方法学研究及验证，发现本发明的方法灵敏、准确、重现性较好，能够用更为简便的方法实现游离米铂和脂质体中米铂含量的准确检测，从而为提高和更好地控制米铂脂质体产品的质量提供有效保障，有利于保证米铂脂质体产品质量的一致性和稳定性，从而有利于提高米铂脂质体产品用药的临床安全性和有效性。

优选的，所述色谱柱为ZORBAX SB-C18，4.6mm*150mm，5μm。

优选的色谱柱，色谱柱规格可以使各组分峰形、分离度及检测的灵敏度俱佳，且基线干扰较小，保证检测结果准确可靠，重复性好。

优选的，流动相B：体积比为90:10的甲醇-乙腈的混合溶液。

优选的流动相在不产生基线干扰的前提下，能够更好地分离米铂原料和各杂质，并且有效改善峰形，使检测结果的准确度及精密度更高。

优选的，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：

0min，10％流动相A，90％流动相B；

3min，100％流动相B；

8min，100％流动相B；

8.1min，10％流动相A，90％流动相B；

15min，10％流动相A，90％流动相B。

优选的梯度洗脱顺序，可以提高米铂主成分与各杂质峰之间的分离度和检测的准确度，使检测结果定量准确，且精密度高。

优选的，流速为1.3mL/min-1.7mL/min。

进一步优选的，流速为1.5mL/min。

优选的，检测波长为210nm。

优选的，柱温为30℃-40℃。

进一步优选的，柱温为35℃。

优选的，进样体积为20μL-30μL。

进一步优选的，进样体积为25μL。

优选的检测条件可使米铂原料与各杂质达到更高的分离度，从而实现米铂含量的准确定量检测。

优选的，米铂分散液的浓度为2.2mg/mL。

优选的，系统适用性溶液的制备方法为：将杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、INT2、十四烷酸钠和米铂对照品加入无水乙醇中溶解，并用稀释剂稀释制成每1mL含杂质C 40μg、杂质D 40μg、杂质F 40μg、杂质G 40μg、杂质INT2 40μg、十四烷酸钠40μg、米铂40μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。各杂质的结构如表1所示。

表1

优选的，对照品溶液的制备方法为：取米铂对照品加入稀释剂中溶解，并用稀释剂稀释至每1mL含米铂40μg的溶液，作为对照品溶液。

优选的，所述稀释剂为体积比7:3的叔丁醇和乙腈的混合溶液。

本发明提供的检测方法，能够实现游离米铂和米铂脂质体的有效分离，且能对游离米铂和脂质体中米铂进行准确定量检测，有利于对米铂脂质体的质量进行有效控制，从而保证米铂脂质体产品的质量，具有较高的实用价值。

附图说明

图1为实施例2中2.1项下空白溶剂的色谱图；

图2为实施例2中2.1项下系统适用性溶液的色谱图；

图3为实施例2中2.1项下空白脂质体溶液的色谱图；

图4为实施例2中2.1项下对照品溶液的色谱图；

图5为实施例2中2.1项下米铂脂质体供试品溶液的色谱图；

图6为对比例1中加入800mg柠檬酸钠制备的游离米铂供试品溶液的色谱图；

图7为对比例1中加入1200mg柠檬酸钠制备的游离米铂供试品溶液的色谱图；

图8为对比例5中硫酸鱼精蛋白溶液和米铂脂质体分散液与10mg/mL硫酸鱼精蛋白溶液按照比例1:10混合离心30min的上清液的照片，其中，(a)为10mg/mL硫酸鱼精蛋白溶液图，(b)为米铂脂质体分散液与10mg/mL硫酸鱼精蛋白溶液按照比例1:10混合离心30min的上清液的照片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例和对比例中所用米铂脂质体为石家庄四药有限公司生产的注射用米铂脂质体，规格为8mg/支。

实施例1

1.1溶液的配制

(1)稀释剂：体积比为70:30的叔丁醇和乙腈的混合溶液。

(2)系统适用性溶液：精密称取杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、INT2、十四烷酸钠和米铂对照品各适量，加入无水乙醇中溶解，并用稀释剂稀释制成每1mL含杂质C 40μg、杂质D40μg、杂质F 40μg、杂质G 40μg、杂质INT2 40μg、十四烷酸钠40μg、米铂40μg的混合溶液，作为系统适用性溶液，作为系统适用性溶液。

(3)对照品溶液：取米铂对照品加入稀释剂中溶解，并用稀释剂稀释至每1mL含米铂40μg的溶液，作为对照品溶液。

(4)杂质定位溶液：分别精密称取质C、杂质D、杂质F、杂质G、INT2、十四烷酸钠和米铂对照品各适量，置于不同的容量瓶中，用无水乙醇溶解并用稀释剂稀释制成每1mL含杂质C 0.4mg、杂质D 0.4mg、杂质F0.4mg、杂质G 0.4mg、杂质INT2 0.4mg、十四烷酸钠0.4mg、米铂0.4mg的溶液，即得各自定位溶液。

(5)供试品溶液：取注射用米铂脂质体供试品5支，分别加入3.7mL水，振摇混合均匀，合并5支混合液，得米铂脂质体分散液。称取无水磷酸二氢钠约400mg，无水磷酸氢二钠约400mg，精密称定，加入10mL离心管中，精密加入2mL水，超声溶解，精密加入上述米铂脂质体分散液2mL，涡旋120s使混合均匀，然后以5000rpm转速离心5min，用定量滤纸过滤，滤液作为游离米铂供试品溶液。

将过滤后的滤纸和过滤所得的凝聚脂质体加入100mL容量瓶中，加水5mL，振摇混合均匀；向上述所用的离心管中加水1mL，涡旋15s，加入稀释剂7mL，振摇均匀，转移至上述100mL容量瓶中，继续上离心管中加入稀释剂8mL，振摇后转移至上述100mL容量瓶中，重复向离心管中加入稀释剂进行洗涤，洗涤液均转移至上述100mL容量瓶中，直至洗涤液目视无可见凝聚物，然后向上述100mL容量瓶中加入稀释剂定容，摇匀，取续滤液，作为米铂脂质体供试品溶液。

(6)空白脂质体溶液：取空白脂质体5支，分别加入3.7mL水，振摇混合均匀，合并5支混合液，得空白脂质体分散液。称取无水磷酸二氢钠约400mg，无水磷酸氢二钠约400mg，精密称定，加入10mL离心管中，精密加入2mL水，超声溶解，精密加入上述空白脂质体分散液2mL，涡旋120s使混合均匀，然后以5000rpm转速离心5min，用定量滤纸过滤，将过滤后的滤纸和过滤所得的凝聚脂质体加入100mL容量瓶中，加水5mL，振摇混合均匀；向上述所用的离心管中加水1mL，涡旋15s，加入稀释剂7mL，振摇均匀，转移至上述100mL容量瓶中，继续上离心管中加入稀释剂8mL，振摇后转移至上述100mL容量瓶中，重复向离心管中加入稀释剂进行洗涤，洗涤液均转移至上述100mL容量瓶中，直至洗涤液目视无可见凝聚物，然后向上述100mL容量瓶中加入稀释剂定容，摇匀，取续滤液，作为空白脂质体溶液。

1.2米铂含量的检测方法：

色谱柱：ZORBAX SB-C18，4.6mm*150mm，5μm；

流动相A：水；

流动相B：体积比为90:10的甲醇-乙腈的混合溶液；

检测波长：210nm；

流速：1.5mL/min；

进样体积：25μL；

柱温：35℃；

梯度洗脱，洗脱程序如下：

0min，10％流动相A，90％流动相B；

3min，100％流动相B；

8min，100％流动相B；

8.1min，10％流动相A，90％流动相B；

15min，10％流动相A，90％流动相B。

计算方法：按照外标法以峰面积计算包封于脂质体中米铂的质量。

包封率计算公式：

包封率(％)＝包封于脂质体中米铂的含量/脂质体中米铂的总质量×100％

精密量取上述对照品溶液、游离米铂供试品溶液和米铂脂质体供试品溶液，注入液相色谱仪中，按照如上液相色谱条件进行检测，理论塔板数按照米铂峰计算不低于3000。

实施例2

方法学验证：

2.1系统适用性

取空白溶剂(稀释剂)、上述系统适用性溶液、各杂质定位溶液、对照品溶液、空白脂质体溶液和米铂脂质体供试品溶液各25μL，分别按照上述条件进行高效液相色谱检测，记录色谱图，空白溶剂、系统适用性溶液、空白脂质体溶液、对照品溶液、米铂脂质体供试品溶液的色谱图如图1-图5所示，结果如表2所示。

表2专属性结果

试验结果表明，杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、INT2、十四烷酸钠在米铂出峰位置处无色谱峰，不干扰米铂测定，空白溶剂及空白脂质体辅料峰不干扰米铂检测，表明本方法专属性良好，适合米铂脂质体中米铂含量的检测。

2.2线性范围

精密称取米铂对照品约10mg，置于50mL容量瓶中，加入稀释剂溶解并定容至刻度，摇匀，作为线性储备液。

精密量取线性储备液1.0mL、1.0mL、1.0mL、2.0mL、2.0mL、3.0mL，分别置200mL、50mL、25mL、20mL、10mL、10mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，作为线性1、线性2、线性3、线性4、线性5、线性6溶液。分别按照上述条件进行高效液相色谱检测，记录色谱图，以峰面积对数值为纵坐标，以浓度对数值为横坐标进行线性回归计算，结果如表3所示。

表3线性结果

线性	C(μg/mL)	峰面积A
			线性1	1.017	7452
线性2	4.068	30319
			线性3	8.135	66384
线性4	20.339	149937
			线性5	40.677	303511
线性6	61.016	448097

结果表明，米铂在1.017μg/ml-61.016μg/ml范围内，浓度与峰面积呈良好线性关系，线性方程y＝7337.6x+2214，相关系数r＝0.999。

2.3仪器精密度

取米铂对照品适量，精密称定，加入稀释剂溶解，用稀释剂稀释至每1mL中含米铂40μg的溶液，作为对照品溶液，取对照品溶液，连续进样6次，计算峰面积的相对标准偏差。结果如表4所示。

表4仪器精密度结果

	A1	A2	A3	A4	A5	A6	平均A	RSD％
									对照品溶液	303008	302743	302180	302681	302133	301623	302395	0.17

结果表明，连续进样6针，峰面积的相对标准偏差RSD为0.17％，表明仪器精密度良好。

2.4定量限

取线性储备液，逐级稀释至米铂峰的S/N在10-20之间，平行配制6份，计算峰面积和保留时间的相对标准偏差，结果如表5所示。

表5定量限结果

结果表明，米铂定量限浓度为1.017μg/mL，相当于主成分浓度的2.54％，方法灵敏度良好；定量限重复配制6次，S/N均大于10，保留时间的RSD为0.06％，峰面积的RSD为0.69％，定量限重复性良好。

2.5准确度

将400mg米铂原料及处方量辅料加入200mL水中，超声分散均匀，均质机中循环2min，于100bar下均质3次，于700bar下均质3次，再于900bar下均质2次，然后用0.2μm滤膜过滤，取续滤液，得游离米铂溶液。经检测，游离米铂溶液中米铂的浓度为0.5803mg/mL。

取米铂对照品适量，精密称定，加稀释剂超声溶解，用稀释剂稀释至美1mL含米铂40μg的溶液，作为对照品溶液。

另取注射用米铂脂质体供试品5支，分别加入3.7mL水，振摇混合均匀，合并5支混合液，得脂质体分散液。称取无水磷酸二氢钠约400mg，无水磷酸氢二钠约400mg，精密称定，加入10mL离心管中，精密加入1mL水，超声溶解，精密加入上述米铂脂质体分散液1.6mL，精密加入上述游离米铂溶液1.4mL，涡旋120s使混合均匀，然后以5000rpm转速离心5min，用定量滤纸过滤，取续滤液，得回收率80％-游离样品溶液。

将过滤后的滤纸和过滤所得的凝聚脂质体加入100mL容量瓶中，加水5mL，振摇混合均匀；向上述所用的离心管中加水1mL，涡旋15s，加入稀释剂7mL，振摇均匀，转移至上述100mL容量瓶中，继续上离心管中加入稀释剂8mL，振摇后转移至上述100mL容量瓶中，重复向离心管中加入稀释剂进行洗涤，洗涤液均转移至上述100mL容量瓶中，直至洗涤液目视无可见凝聚物，然后向上述100mL容量瓶中加入稀释剂定容，摇匀，取续滤液，作为回收率80％-包封样品溶液。平行配制6份。按照上述液相色谱检测条件对回收率80％-游离样品溶液和回收率80％-包封样品溶液进行检测，结果如表6所示。

表6准确度试验结果

结果表明，6次试验的回收率均在98.0％-101.1％，平均回收率为99.7％，以上结果表明方法准确度良好。

2.6重复性

按照实施例1的方法平行配制6份米铂脂质体供试品溶液(2112211批)，按照上述液相色谱条件进样检测，并计算包封率，结果如表7所示。

表7重复性试验结果

结果表明，6份供试品样品的包封率含量均值为96.5％，RSD为1.08％，说明检测方法的重复性良好。

2.7中间精密度

由不同分析人员分别于不同时间、采用相同型号色谱柱、不同仪器测定同一批样品(2112211批)的包封率。

按照实施例1的方法平行配制6份米铂脂质体供试品溶液，按照上述液相色谱条件进样检测，并计算包封率，结果如表8所示。

表8中间精密度试验结果

结果表明，不同分析人员，分别于不同时间，用不同仪器测定12份样品的包封率的平均值为97.3％，RSD＝1.3％，方法中间精密度良好。

2.8溶液稳定性

取实施例1制备的对照品溶液、米铂脂质体供试品溶液(2112211批)于室温放置，分别于不同时间取样检测，记录色谱图，峰面积的结果如表9-表10所示。

表9米铂脂质体供试品溶液稳定性试验结果

0h	1h	2h	4h	6h	平均	RSD％
							283306	282705	281599	279347	277212	280834	0.90

表10对照品溶液稳定性试验结果

0h	1h	2h	4h	6h	8h	10h	12h	平均	RSD％
										296343	301411	302596	302405	300021	297786	296469	295609	299080	0.86

结果表明，本品供试品溶液室温放6小时，峰面积的RSD为0.90％，供试品溶液在室温下6小时内稳定；对照品溶液室温放置12小时，峰面积的RSD为0.86％，对照品溶液在室温下放置12小时内稳定。

2.9耐用性

参照实施例1色谱条件，调节流动相起始比例、色谱柱控制温度、流速，调整范围参见表10，分别对实施例1制备的对照品溶液和米铂脂质体供试品溶液(2112211批)进行高效液相色谱分析，结果见表11。

表11耐用性试验结果

结果表明，随着起始流动相比例变化、流速变化、柱温变化，样品包封率的测试结果变化不大，说明本方法色谱条件耐用性良好。

实施例3

本实施例提供的米铂脂质体包封率的检测方法与实施例1完全相同，不同的是无水磷酸二氢钠和无水磷酸氢二钠的加入量均为600mg。

进样米铂脂质体供试品溶液计算所得的2203282批注射用米铂脂质体的包封率为94.6％。

实施例1中进样米铂脂质体供试品溶液计算所得的2203282批注射用米铂脂质体的包封率为94.8％。

将实施例1中和实施例3中米铂脂质体分散液与磷酸盐缓冲液混合后的过滤液经光束照射未出现丁达尔现象。而将米铂脂质体分散液稀释100倍后经光束照射依然会出现丁达尔现象，说明米铂脂质体分散液加缓冲盐离心过滤后，几乎所有的米铂脂质体都已经发生凝聚并被滤纸截留，滤液中未絮凝的脂质体在1％以下。

实施例4

本实施例提供的米铂脂质体包封率的检测方法与实施例1完全相同，不同的是将磷酸二氢钠和磷酸氢二钠替换为等量的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。

进样米铂脂质体供试品溶液计算所得的2203282批注射用米铂脂质体的包封率为94.9％。

对比例1

本对比例提供的米铂脂质体包封率的检测方法与实施例1中完全相同，不同的仅是将实施例1中供试品溶液制备中的400mg无水磷酸二氢钠和400mg无水磷酸氢二钠替换为800mg柠檬酸钠，其他步骤完全相同。

将制备得到的游离米铂供试品溶液和米铂脂质体供试品溶液按照实施例1的液相色图条件进行检测，记录色谱图，游离米铂供试品溶液的色谱图如图6所示。

从图中可以看出，游离米铂供试品溶液的基线波动大，干扰米铂检测，且由于柠檬酸钠在210nm处具有较强吸收，干扰游离米铂的测定，后期无法进行方法学中准确度的测定。

将本对比例中柠檬酸钠的含量替换为400mg，无法获得澄清的为游离米铂供试品溶液，说明加入400mg柠檬酸钠米铂脂质体未完全凝聚。

将本对比例中柠檬酸钠的含量替换为1200mg，液相色谱图如图7所示，虽然可以获得澄清的游离米铂供试品溶液，但是，同柠檬酸钠800mg的结果一样，即所得游离米铂供试品溶液的基线波动大，干扰米铂检测，且由于柠檬酸钠在210nm处具有较强吸收，干扰游离米铂的测定，后期无法进行方法学中准确度的测定。

对比例2

本对比例提供的米铂脂质体包封率的检测方法与实施例1中完全相同，不同的仅是将实施例1中供试品溶液制备中的无水磷酸二氢钠和无水磷酸氢二钠的加入量均替换为300mg，其他步骤完全相同。

结果表明，无法获得澄清的游离米铂供试品溶液，说明加入300mg磷酸二氢钠和300mg磷酸氢二钠，米铂脂质体未完全凝聚。进样米铂脂质体供试品溶液(2203282批)，检测的脂质体的包封率为63.0％，检测结果偏低。

对比例3

本对比例提供的米铂脂质体包封率的检测方法与实施例1中完全相同，不同的仅是将实施例1中供试品溶液制备中的无水磷酸二氢钠和无水磷酸氢二钠替换为800mg的氯化钠。

结果表明，无法获得澄清的游离米铂供试品溶液，说明加入800mg氯化钠，米铂脂质体未完全凝聚。

将本对比例中氯化钠的加入量替换为1200mg，将氯化钠加入米铂脂质体分散液后离心的下层溶液略显浑浊，灯光下泛蓝，说明米铂脂质体凝聚不完全。

对比例4

本对比例提供的米铂脂质体包封率的检测方法与实施例1中完全相同，不同的仅是将实施例1中供试品溶液制备中的无水磷酸二氢钠和无水磷酸氢二钠替换为800mg的氯化钾。

结果表明，无法获得澄清的游离米铂供试品溶液，说明加入800mg氯化钾，米铂脂质体未完全凝聚。

将本对比例中氯化钾的加入量替换为1200mg，将氯化钾加入米铂脂质体分散液后离心的下层溶液略显浑浊，灯光下泛蓝，说明米铂脂质体凝聚不完全。

对比例5

本对比例提供一种鱼精蛋白凝聚法检测米铂脂质体包封率的方法，具体步骤如下：

取注射用米铂脂质体供试品5支，分别加入3.7mL水，振摇混合均匀，合并5支混合液，得米铂脂质体分散液。将米铂脂质体分散液与10mg/mL硫酸鱼精蛋白溶液按照比例1:1，1:5，1:10混合均匀，涡旋120s，于10000rpm的转速下离心15min和30min，最终发现三种比例的硫酸鱼精蛋白溶液均不能使米铂脂质体完全凝聚沉淀。

参见图8，图(a)为10mg/mL硫酸鱼精蛋白溶液图，图(b)为米铂脂质体分散液与10mg/mL硫酸鱼精蛋白溶液按照比例1:10混合离心30min的上清液的照片。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种米铂脂质体包封率的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤a，将米铂脂质体分散于水中，加入磷酸盐缓冲液，混合均匀，得凝聚米铂脂质体悬浮液；将所述凝聚米铂脂质体悬浮液离心，过滤，得凝聚米铂脂质体和游离米铂供试品溶液；其中，所述凝聚米铂脂质体悬浮液中磷酸盐的质量百分含量为20％-30％；

步骤b，将所述凝聚米铂脂质体加入水中，混合均匀，加入稀释剂稀释，过滤，得米铂脂质体供试品溶液；

步骤c，采用高效液相色谱法对所述游离米铂供试品溶液和米铂脂质体供试品溶液进行检测；

所述磷酸盐缓冲液为质量比为1:0.9-1.1的磷酸二氢盐-磷酸氢二盐缓冲液。

2.如权利要求1所述的米铂脂质体包封率的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液或磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液。

3.如权利要求1所述的米铂脂质体包封率的检测方法，其特征在于，高效液相色谱的条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；

流动相A：水；

流动相B：体积比为88-92:12-8的甲醇-乙腈的混合溶液；

UV检测器，检测波长：208nm-212nm；

梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：

0min，5％-15％流动相A，95％-85％流动相B；

3min，100％流动相B；

8min，100％流动相B；

8.1min，5％-15％流动相A，95％-85％流动相B；

15min，5％-15％流动相A，95％-85％流动相B。

4.如权利要求3所述的米铂脂质体包封率的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为ZORBAX SB-C18，4.6mm*150mm，5μm。

5.如权利要求3所述的米铂脂质体包封率的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：

0min，10％流动相A，90％流动相B；

3min，100％流动相B；

8min，100％流动相B；

8.1min，10％流动相A，90％流动相B；

15min，10％流动相A，90％流动相B。

6.如权利要求3所述的米铂脂质体包封率的检测方法，其特征在于，流速：1.3mL/min-1.7mL/min，柱温：30℃-40℃，进样体积：20μL-30μL。

7.如权利要求3所述的米铂脂质体包封率的检测方法，其特征在于，流速：1.5mL/min，柱温：35℃，进样体积：25μL，检测波长210nm。

8.如权利要求3所述的米铂脂质体包封率的检测方法，其特征在于，所述稀释剂为体积比7:3的叔丁醇和乙腈的混合溶液。

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