CN116124942A - 一种硫辛酸中光学异构体含量检测方法 - Google Patents

一种硫辛酸中光学异构体含量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药分析技术领域，具体公开了一种硫辛酸中光学异构体含量检测方法。该方法主要包括以下步骤：A.配置硫辛酸供试品溶液；B.取R‑硫辛酸、S‑硫辛酸对照品适量，用稀释剂溶解配置对照品混合溶液；C.分别将步骤A、B配置好的供试品溶液以及对照品混合溶液各10ul注入液相色谱仪中，按设定的色谱条件进行分离、洗脱，记录色谱图中R‑硫辛酸和S‑硫辛酸的峰面积；D.利用外标法计算硫辛酸供试品中R‑硫辛酸和S‑硫辛酸的含量。所述色谱条件为：选用3,5‑二氯苯基氨基甲酸酯涂布的手性色谱柱，柱温为35℃～45℃，流动相为0.1％磷酸的水溶液和甲醇按体积比1:8～10混合的溶液，流速为0.8～1.2ml/min，所述稀释剂为甲醇。

Description

一种硫辛酸中光学异构体含量检测方法
技术领域
本发明涉及医药分析技术领域，具体是指一种硫辛酸中光学异构体含量检测方法。
背景技术
硫辛酸(alpha lipoic acid)，俗称α-硫辛酸，是一种能消除加速老化与致病的自由基、类似维他命的物质，硫辛酸是一种存在于线粒体的酵素,硫辛酸在体内经肠道吸收后进入细胞,兼具脂溶性与水溶性的特性,因此可以在全身通行无阻，到达任何一个细胞部位,提供人体全面效能，是唯一兼具脂溶性与水溶性的万能活氧剂。因此被称为“万能抗氧化剂”，更是自由基捕手，是机体细胞利用糖类等能源物质产生能量所需的一种限制性必需营养物质，广泛用于治疗和预防心脏病、糖尿病等多种疾病。一般认为它能保存和再生其它抗氧化剂，如维生素C和E等，并能平衡血糖浓度。有效增强体内免疫系统，免受于自由基的破坏。有研究表明它对肝病、糖尿病、阿尔茨海默症等多种病症具有治疗功效。
自然界的硫辛酸非常少，无法直接提取或制备，我们目前所能购买的硫辛酸，都是人工合成的。它是不纯净的混合物，包含了2种组成元素相同、立体结构不同的硫辛酸分子：R-硫辛酸(R-lipoic Acid，右旋硫辛酸)和S-硫辛酸(S-lipoic Acid，左旋硫辛酸)。
R-硫辛酸是从α-硫辛酸分离的高纯度有效成分，R-硫辛酸和人体内、大自然的天然硫辛酸化学结构一样，口服能够迅速被人体识别、吸收、利用；而S-硫辛酸是α-硫辛酸中的杂质，是生产过程中的“废渣”，口服不但不能被机体识别、吸收、利用，还容易刺激胃肠道。
R-硫辛酸和S-硫辛酸的结构式和区别如下：
Figure BDA0004073618260000021
目前，国内外暂未出现有关硫辛酸手性异构体含量检测方法的相关报道，现有技术一般是通过比旋度表征其光学纯度，但比旋度测定受温度、杂质等影响较大，准确度不高。这就给硫辛酸的光学异构体的分析检测带来障碍，影响其质量分析和控制，进而影响该药品的安全有效性。
因此，提供一种操作简单、准确可靠、灵敏度高的硫辛酸的光学异构体含量的检测方法十分重要。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有技术中的不足之处，提供一种快速有效测定硫辛酸样品中硫辛酸异构体含量的检测方法，将硫辛酸的两种光学异构体进行分离，最终测出硫辛酸中两种光学异构体R-硫辛酸和S-硫辛酸含量，解决了硫辛酸原料药生产中光学异构体的含量测定的问题,为原料药及其制剂的质量分析和质量控制奠定基础,保证了原料药产品的安全有效性。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种硫辛酸中光学异构体含量检测方法，主要包括以下步骤：
A.配置硫辛酸供试品溶液；
B.取R-硫辛酸、S-硫辛酸对照品适量，用稀释剂溶解配置对照品混合溶液；
C.分别将步骤A、B配置好的供试品溶液以及对照品混合溶液注入液相色谱仪中，按设定的色谱条件进行分离、洗脱，记录色谱图中R-硫辛酸和S-硫辛酸的峰面积；
所述色谱条件为：选用3,5-二氯苯基氨基甲酸酯涂布的手性色谱柱，柱温为35℃～45℃，流动相为0.1％磷酸的水溶液和甲醇按体积比1:8～10混合的溶液，流速为0.8～1.2ml/min；
D.利用外标法计算硫辛酸供试品中R-硫辛酸和S-硫辛酸的含量。
本发明中，用通用型示差折光检测器RID进行检测，所述检测器温度为25℃～40℃。
本发明中，所述色谱柱采用规格为4.6mm×250mm，5μm的phenomenexlux i-Cellulose-5色谱柱。
本发明中，优选色谱柱的柱温为40℃；流动相为0.1％磷酸的水溶液和甲醇按体积比1:9混合的溶液，流速为1.0ml/min。
所述检测时进样量为10μl。
本发明中，所述供试品溶液和对照品混合溶液配制方法如下：
1)取硫辛酸供试品适量，用稀释剂溶解成浓度为5.0mg/ml硫辛酸供试品溶液，并标记为a；
2)取R-硫辛酸、S-硫辛酸对照品适量，用稀释剂溶解成浓度为5.0mg/ml的R-硫辛酸和0.05mg/ml的S-硫辛酸的对照品混合溶液，并标记为b；
本发明中，所述稀释剂为甲醇。
综上所述，本发明的有益效果如下：
本发明采用高效液相色谱法(HPLC)快速准确地分离定量硫辛酸中光学异构体(R-硫辛酸和S-硫辛酸)的含量，并应用示差折光检测器(HPLC-RID法)来测定硫辛酸中光学异构体(R-硫辛酸和S-硫辛酸)的含量。该分析方法专属性强，其大大缩短了分析时间，提高了检测效率。
附图说明
图1为空白溶剂(稀释剂)色谱图；
图2为R-硫辛酸和S-硫辛酸混合对照溶液色谱图；
图3为硫辛酸供试品溶液色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
1.本实施例所采用的色谱条件
1.1色谱柱：纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)涂布的手性色谱柱(phenomenexlux i-Cellulose-5)，4.6mm×250mm，5μm或效能相当色谱柱。
1.2流动相：0.1％磷酸的水溶液:甲醇＝1:9(体积比)；
1.3稀释剂：甲醇；
1.4流速：1.0ml/min；
1.5柱温：40℃；
1.6进样体积：10μl；
1.7检测器：示差折光检测器(RID)；
2.溶液的配置和硫辛酸光学异构体含量测定的方法
A.取硫辛酸供试品适量，用稀释剂溶解成浓度为5.0mg/ml的供试品溶液，标记为a；
B.精密称取R-硫辛酸、S-硫辛酸对照品适量，用稀释剂溶解成浓度为5.0mg/ml的R-硫辛酸和0.05mg/ml的S-硫辛酸对照品混合溶液，标记为b；
C.分别将步骤A、B配置好的供试品溶液a以及对照品混合溶液b各10ul注入液相色谱仪中，每份溶液进样2次，按照1中的色谱条件进行分离、洗脱，记录色谱图中R-硫辛酸和S-硫辛酸的峰面积如图2和图3所示。
D.按照外标法计算光学异构体(R-硫辛酸及S-硫辛酸)的响应因子Rf值及含量C。计算公式如下：
Figure BDA0004073618260000051
式中：Cs为对照溶液的浓度(mg/ml)；
As为对照溶液中对照品峰面积；
Ai为供试品溶液中R-硫辛酸(或S-硫辛酸)的峰面积；
Ci为供试品溶液的浓度(mg/ml)。
计算得出样品中R-硫辛酸的浓度为98.7％，S-硫辛酸的浓度为1.1％。
方法学考察
为了进一步验证本方法的可行性，还进行了以下试验：
1.专属性试验
精密称取R-硫辛酸和S-硫辛酸对照品适量，分别用稀释剂配制成5.0mg/ml和0.05mg/ml的对照溶液，取硫辛酸样品适量，用稀释剂配制成5.0mg/ml的供试品溶液，配制相同浓度的R-硫辛酸、S-硫辛酸和硫辛酸供试样品的混合溶液，上述溶液分别取10μl进样，记录色谱图R-硫辛酸峰和S-硫辛酸峰的分离度和理论塔板数，结果见表1。
表1专属性试验
Figure BDA0004073618260000061
结果表明：S-硫辛酸和R-硫辛酸的理论踏板数不小于2000，分离度不小于1.5。
2.检测限和定量限试验
精密称取R-硫辛酸和S-硫辛酸对照品适量，用稀释剂分别配制成一定浓度，分别吸取10μl溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。以信噪比约为3:1时的浓度作为检测限，以信噪比约为10:1时的浓度作为定量限，结果见表2。
表2检测限和定量限试验
Figure BDA0004073618260000071
结果表明：R-硫辛酸的检测限为0.0075mg/ml，定量限为0.015mg/ml；S-硫辛酸的检测限为0.0075mg/ml，定量限为0.015mg/ml。
3.线性试验
精密称取R-硫辛酸对照品适量，用稀释剂分别配制为0.01mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml的线性溶液。精密称取S-硫辛酸对照品适量，用稀释剂分别配制为0.01mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml的线性溶液。分别取10μl溶液，注入液相色谱仪中，记录色谱图，各浓度的峰面积见表3和表4。
表3R-硫辛酸线性实验
Figure BDA0004073618260000072
Figure BDA0004073618260000081
以浓度对峰面积做线性回归，得线性方程相关系数r＝0.9998。
表4 S-硫辛酸线性实验
Figure BDA0004073618260000082
以浓度对峰面积做线性回归，得线性方程相关系数r＝0.9999。
结果表明：R-硫辛酸在浓度范围内线性良好，S-硫辛酸在浓度范围内线性良好。
4.准确性试验
对照溶液的制备：精密称取R-硫辛酸和S-硫辛酸对照品适量，用稀释剂溶解成浓度为5.0mg/ml的R-硫辛酸和0.05mg/ml的S-硫辛酸对照品混合溶液。
供试品溶液的制备：取硫辛酸样品适量，用稀释剂稀释至5mg/ml，作为供试品溶液。
回收溶液的制备：精密称取R-硫辛酸和S-硫辛酸对照品适量，分别用稀释剂稀释至10mg/ml的R-硫辛酸和0.1mg/ml的S-硫辛酸作为加样溶液。称取硫辛酸样品25mg于10.0ml容量瓶中，加入2.5ml的R-硫辛酸加样溶液和2.5ml的S-硫辛酸加样溶液，加稀释剂至刻度线，摇匀，得回收溶液，回收溶液配置6份。按含量测定项下分别测定回收率，结果见表5和表6。
表5R-硫辛酸回收率测定结果
Figure BDA0004073618260000091
表6S-硫辛酸回收率测定结果
Figure BDA0004073618260000092
Figure BDA0004073618260000101
结果表明：本法测定R-硫辛酸和S-硫辛酸准确性良好。
5.精密度试验
精密称取R-硫辛酸和S-硫辛酸对照品适量，分别用稀释剂溶解成浓度为5.0mg/ml的R-硫辛酸和0.05mg/ml的S-硫辛酸对照溶液，分别取10μl溶液，注入液相色谱仪中，各连续进样6次。记录色谱图。结果见表7和表8。
表7R-硫辛酸重现性试验结果
Figure BDA0004073618260000102
表8S-硫辛酸重现性试验结果
Figure BDA0004073618260000103
Figure BDA0004073618260000111
在不同的时间，由不同人员重复上述试验，结果见表9和表10。
表9R-硫辛酸中间精密度试验结果
Figure BDA0004073618260000112
表10S-硫辛酸中间精密度试验结果
Figure BDA0004073618260000113
结果表明：本方法的精密度良好。
6.溶液稳定性试验
精密称取R-硫辛酸和S-硫辛酸对照品适量，用稀释剂溶解成浓度为5.0mg/ml的R-硫辛酸和0.05mg/ml的S-硫辛酸对照品混合溶液，分别在常温下放置0、4、8、12、24h，进样，记录主成分的峰面积变化，结果见表11。
表11溶液稳定性试验
Figure BDA0004073618260000121
结果表明：常温下24h内R-硫辛酸和S-硫辛酸对照品混合溶液稳定性良好。
7.方法耐用性试验
精密称取R-硫辛酸和S-硫辛酸对照品适量，用稀释剂溶解成浓度为5.0mg/ml的R-硫辛酸和0.05mg/ml的S-硫辛酸对照品混合溶液，对色谱条件中的流速和色谱柱温度条件进行小范围改动，考察对主成分保留时间、分离度和理论塔板数的影响，考察结果见表12。
表12方法耐用性试验结果
Figure BDA0004073618260000131
各条件下R-硫辛酸和S-硫辛酸的理论塔板数大于2000，相邻两峰间的分离度大于1.5，说明在测定条件有小的变动时，测定条件符合耐用性要求。
8.含量测定
根据硫辛酸中光学异构体含量检测方法测定3批不同批次的硫辛酸样品，3批不同批次的硫辛酸样品中R-硫辛酸和S-硫辛酸含量结果见表13。
表13不同批次的硫辛酸样品中R-硫辛酸和S-硫辛酸含量结果
Figure BDA0004073618260000132
Figure BDA0004073618260000141

Claims (7)

1.一种硫辛酸中光学异构体含量检测方法，其特征在于主要包括以下步骤：
A.配置硫辛酸供试品溶液；
B.取R-硫辛酸、S-硫辛酸对照品适量，用稀释剂溶解配置对照品混合溶液；
C.分别将步骤A、B配置好的供试品溶液以及对照品混合溶液注入液相色谱仪中，按设定的色谱条件进行分离、洗脱，记录色谱图中R-硫辛酸和S-硫辛酸的峰面积；
所述色谱条件为：选用3,5-二氯苯基氨基甲酸酯涂布的手性色谱柱，柱温为35℃～45℃，流动相为0.1％磷酸的水溶液和甲醇按体积比1:8～10混合的溶液，流速为0.8～1.2ml/min；
D.利用外标法计算硫辛酸供试品中R-硫辛酸和S-硫辛酸的含量。
2.根据权利要求1所述的硫辛酸中光学异构体含量检测方法，其特征在于用通用型示差折光检测器RID进行检测，所述检测器温度为25℃～40℃。
3.根据权利要求1所述的硫辛酸中光学异构体含量检测方法，其特征在于所述色谱柱采用规格为4.6mm×250mm，5μm的phenomenexlux i-Cellulose-5色谱柱。
4.根据权利要求1或3所述的硫辛酸中光学异构体含量检测方法，其特征在于所述色谱柱的柱温为40℃；流动相为0.1％磷酸的水溶液和甲醇按体积比1:9混合的溶液，流速为1.0ml/min。
5.根据权利要求1所述的硫辛酸中光学异构体含量检测方法，其特征在于所述检测时进样量为10μl。
6.根据权利要求1所述的硫辛酸中光学异构体含量检测方法，其特征在于所述供试品溶液和对照品混合溶液配制方法如下：
1)取硫辛酸供试品适量，用稀释剂溶解成浓度为5.0mg/ml硫辛酸供试品溶液，并标记为a；
2)取R-硫辛酸、S-硫辛酸对照品适量，用稀释剂溶解成浓度为5.0mg/ml的R-硫辛酸和0.05mg/ml的S-硫辛酸的对照品混合溶液，并标记为b。
7.根据权利要求1或6所述的硫辛酸中光学异构体含量检测方法，其特征在于所述稀释剂为甲醇。
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