CN117705981A - 一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及属于药物检测技术领域，且公开了一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，包括步骤Step1.取2‑[[(2'‑氰基联苯‑4‑基)甲基]氨基]‑3‑硝基苯甲酸乙酯，以乙腈溶为溶剂，制备对照样品溶液；Step2.取坎地沙坦酯，以空白溶液为溶剂制备片剂供试品溶液；Step3.分别取对照样品溶液和片剂供试品溶液，利用超高效液相色谱串联质谱法进行测定，记录MRM质谱图，并计算中间体杂质的含量；方法通过采用UPLC‑MS/MS法快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量，能够将检测时间短至8min，且能快速检测该产品中基因毒性杂质的含量，为坎地沙坦酯片剂的风险监控提供便捷有力的技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法。
背景技术
坎地沙坦酯(candesartan cilexetil)，化学名为2-乙氧基-1-[[2＇-(1H-四氮唑-5-基)[1，1＇-联苯基]-4-基]甲基]-1H-苯并咪唑-7-甲酸-1-[[(环已氧基)羰基]氧基]乙酯)；是一种结构独特、口服有效的高选择性血管紧张素II受体拮抗剂类抗高血压药物，能够与血管平滑肌上的受体结合，拮抗血管紧张素的作用，所以能够抑制血管的收缩，起到扩张血管的作用，能够降低血压。一般情况下可以使收缩压、舒张压下降，能够使左室心肌重量、末梢血管阻力减少，对心排出量、射血分数、肾血管阻力、肾血流量没有影响，对于脑血管障碍的原发性高血压患者，对脑血流量也没有影响。在临床上主要用于治疗原发性高血压，可以单独使用，也可以跟其他治疗高血压的药物联合应用。
作为一种广泛应用于临床治疗的药物，坎地沙坦酯在合成时，主要以3-硝基邻苯二甲酸为起始原料，经酯化、重排、取代、水解、成酯、脱保护、精制合成高纯度的坎地沙坦酯。但在这个过程中会产生中间体2-[[(2-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯(简称杂质I)(杂质结构式见图2)。杂质I含有芳香硝基类化合物类警示结构，属于遗传毒性杂质中的第三类，即具有警示结构的杂质，应当对其含量进行控制；目前国内外尚无对坎地沙坦酯基因毒性杂质I进行检测的文献。
因此，亟需设计一种测定坎地沙坦酯片剂中中间体2-[[(2-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯含量的方法，以检测定坎地沙坦酯片剂中的中间体2-[[(2-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯含量，从而解决上述现有技术存在的问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种测定坎地沙坦酯片剂中中间体2-[[(2-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯含量的方法，以检测定坎地沙坦酯片剂中的中间体2-[[(2-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯含量，从而解决现有技术中存在的定坎地沙坦酯片剂中的中间体2-[[(2-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯含量难以有效测定的问题。
(二)技术方案
为实现上述检测定坎地沙坦酯片剂中的中间体2-[[(2-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯含量目的，本发明提供如下技术方案：
一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，所述方法基于超高效液相色谱串联质谱法进行坎地沙坦酯片剂中间体杂质的限度检查和定量测定，所述中间体杂质为2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯，分子式为C23H19N3O4，分子结构为
优选的，利用超高效液相色谱串联质谱法测定2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯含量的过程包括步骤
Step1.取2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯，以乙腈溶为溶剂，制备2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯对照样品溶液；
Step2.取坎地沙坦酯，以空白溶液为溶剂制备片剂供试品溶液；
Step3.分别取2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯对照样品溶液和片剂供试品溶液，利用超高效液相色谱串联质谱法进行测定，记录MRM质谱图，并计算2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯的含量。
优选的，所述的对照品溶液的制备过程包括
(1)取2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯10mg，称定，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；
(2)取10mL，置50mL量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，作为2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯对照品贮备液；
(3)取1mL，置20mL量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1mL中约1μg的对照品溶液，过滤，取续滤液，得对照品溶液。
优选的，所述的片剂供试品溶液的制备过程包括
取坎地沙坦酯100mg，置20mL量瓶中，加空白溶液溶解并定量稀释制成每1mL中含坎地沙坦酯5mg的片剂供试品溶液。
优选的，所述的空白溶液为体积比为55:45的乙腈-水溶液。
优选的，在计算坎地沙坦酯中间体杂质含量时，以色谱图中对应的定量离子对峰面积A为纵坐标，各杂质的质量浓度C为横坐标，利用线性方程计算确定2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯的含量；且所述线性方程为A＝591058140.77134C-11673.46939，且线性方程的相关系数r＝0.99984，线性范围在0.1-2μg·mL-1之间。
优选的，本方法测定坎地沙坦酯片剂中2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-硝基苯甲酸乙酯含量时，测定2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-硝基苯甲酸乙酯的检测限下限为0.0004ng·mL-1；定量限下限为0.001ng·mL-1。
优选的，所述的利用超高效液相色谱串联质谱法测定坎地沙坦酯片剂中2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯含量的测定条件包括色谱条件和质谱条件。
优选的，所述的色谱条件为
色谱柱：Waters Cortecs@T3，柱规格，2.1mm×100mm，2.7μm；
流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸水溶液；
流速：0.5mL·min-1；
柱温：30℃；
进样体积：5μL，通过六通切换阀，0min进质谱，将4.5min之后的液相流出液切换至旁路，不进入质谱分析，在5.5min时候的液相流出液再切换至主路；
梯度洗脱程序：等度洗脱。
优选的，所述的质谱条件为
采用ESI+源多反应监测采集模式，参数如下表
2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯测定的ESI离子源参数为
2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯测定的母离子、子离子、离子模式、去簇电压、碰撞能和保留时间为
其中：“*”表示MRM定量离子。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，具备以下有益效果：
1.本发明设计了一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，本方法通过采用UPLC-MS/MS法快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量，能够将检测时间短至8min，且能快速检测该产品中基因毒性杂质的含量，为坎地沙坦酯片剂的风险监控提供便捷有力的技术支撑；
2.本发明建立了超高效液相色谱串联质谱法来考察坎地沙坦酯片剂中基因毒性杂质I的含量，方法操作简便、快速准确、灵敏度高，适用于坎地沙坦酯片剂中基因毒性杂质I的限度检查和定量测定，为监管机构快速评估坎地沙坦酯片产品质量和政策制定提供了数据支撑。
附图说明
图1为本发明快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法的流程图；
图2为本发明杂质1的结构图。
图3为本发明坎地沙坦酯中基因毒性杂质I专属性试验MRM质谱图。
在图3中，图A为空白溶液(blank solvent)的MRM质谱图，图B为空白辅料溶液(blank excipient solution)的MRM质谱图，图C为对照品溶液(reference solution)的MRM质谱图，图D为片剂供试品溶液(test solution for tabletproduct)的MRM质谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：请参阅图1-3，本发明提供一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，包括
步骤1：准备仪器与试药
步骤1.1：准备仪器
超高效液相色谱仪UPLC-30AD(日本岛津Shimadzu公司)，QTRAP 6500质谱仪；Analyst 1.6.3数据采集和处理软件(AB SCIEX公司，美国)；ME235S型十万分之一电子分析天平(德国Sartorius)；Milli-QA10制水机。
步骤1.2：准备试药
2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯(杂质IV，郑州阿尔法化工有限公司，含量质量分数98％，批号A2856710908)；化学文摘登记号、分子式和分子量等信息见表1。坎地沙坦酯对照品(批号：100685-201903，纯度：99.8％，中国食品药品检定研究院)；坎地沙坦酯片(规格4mg，批号04221203、04221015、04230404)及混合辅料均由企业提供；甲酸、乙腈均为质谱级(美国默克公司)；水为Milli-Q水(18.20MΩ·cm-1)。
表1：杂质I的相关信息
步骤2：配制检测溶液
步骤2.1：制备对照品溶液
称取杂质I约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取10mL，置50mL量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，作为杂质I对照品贮备液；精密量取1mL，置20mL量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1mL中约1μg的对照品溶液，过滤，取续滤液，得对照品溶液；
步骤2.2：制备片剂供试品溶液
取细粉适量(约相当于坎地沙坦酯100mg)，精密称定，置20mL量瓶中，加空白溶液溶解并定量稀释制成每1mL中约含坎地沙坦酯5mg的片剂供试品溶液；
步骤2.3：制备空白溶液
采用乙腈-水(55:45)作为空白溶液；
步骤2.4：制备空白辅料溶液
按企业提供的处方比例，精密称取混合辅料适量，照步骤2.2所述方法制备。
步骤3：给定UPLC-MS/MS法的测定条件
色谱条件：采用Waters Cortecs@T3(2.1mm×100mm，2.7μm)色谱柱；流动相为乙腈：0.1％甲酸水溶液(55:45)，等度洗脱；流速0.5mL·min-1；柱温30℃，进样体积为5μL，通过六通切换阀，0min进质谱，将4.5min之后的液相流出液切换至旁路，不进入质谱分析，在5.5min时候的液相流出液再切换至主路。
质谱条件：采用ESI+源多反应监测采集模式，参数见表2～3。
表2杂质I测定的ESI离子源参数
表3：杂质I的母离子、子离子、离子模式、去簇电压、碰撞能和保留时间
注(note)：*MRM定量离子(*means quantitative MRM ion)；
步骤4：测定坎地沙坦酯片剂中的2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯含量
分别取步骤2制备得到的各溶液，按照步骤3所述的光谱条件和方法进行分析，记录MRM质谱图，得到杂质I的对照品溶液MRM色谱图，典型色谱图见图2；结果为杂质与主成分能有效分离，主成分在5.19min出峰，空白溶液、辅料和主成分均不干扰杂质I的检测；并利用线性方程计算确定2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯的含量。
实施例2：与上述实施例1不同的是，本实施例对实施例1提供的测定方法的线性范围进行考察
1.线性关系考察
精密量取实施例1步骤2.1制备得到的对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL，分别置20mL量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，得到系列对照品溶液，分别进样5μL，记录色谱图，以对应的定量离子对峰面积A为纵坐标，各杂质的质量浓度C(μg·mL-1)为横坐标，进行线性回归，结果见表4；杂质I在线性范围内与峰面积线性关系良好。
2.检测限与定量限考察
精密量取实施例1步骤2.1制备得到的对照品溶液，用空白溶液逐级稀释，按照实施例1步骤3所述的光谱条件和方法进样测定，分别按信噪比S/N＝10和S/N＝3计算，确定杂质I的方法检测限和定量限。结果见表4。
表4：杂质I的线性、范围、检测限及定量限
实施例3：与上述实施例不同的是，本实施例对实施例1提供的测定方法的精密度、准确度和稳定性进行考察
1.精密度考察
取实施例1步骤2.1制备得到的对照品溶液，连续进样6次分析测定，杂质I峰面积RSD为0.7％，说明仪器精密度良好，表明实施例1提供的测定方法具有良好的重复性。
2.准确度考察
精密称取杂质I含量已知的片剂细粉适量(约相当于坎地沙坦酯100mg)共9份分三组，照实施例1步骤2.1所述方法制备回收率本底供试品溶液，每组分别加入对照品贮备液0.5、1.0、1.5mL，用空白溶液稀释至刻度，制备回收率加标供试品溶液，分别进样，采用回归方程进行计算，杂质I回收率为99.9～110.2％，RSD为2.0％～3.5％，表明实施例1提供的测定方法具有良好的准确度。
3.稳定性考察
取实施例1步骤2.1制备得到的对照品溶液和实施例1步骤2.2制备得到的供试品溶液，室温下分别在0、2、4、6、8、10、12h进样测定，对照品溶液中杂质I峰面积的RSD值在1.0％，表明对照品溶液在12h内稳定性良好。供试品溶液中杂质I的含量低于限度，表明供试品溶液在室温12h内稳定性良好。
4.样品测定
按照实施例1步骤2.2所述方法配制坎地沙坦酯片剂供试品溶液，按照实施例1步骤3所述的光谱条件和方法进样分析，结果片剂中均未检出杂质I，说明企业生产该药品工艺良好，未检出该杂质残留。
结合上述分析可以看出，本发明实施例1建立了超高效液相色谱串联质谱法考察坎地沙坦酯片剂中基因毒性杂质I的含量，方法操作简便、快速准确、灵敏度高，适用于坎地沙坦酯片剂中基因毒性杂质I的限度检查和定量测定。本研究结果为监管机构快速评估坎地沙坦酯片产品质量和政策制定提供了数据支撑。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，其特征在于：所述方法基于超高效液相色谱串联质谱法进行坎地沙坦酯片剂中间体杂质的限度检查和定量测定，所述中间体杂质为2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯，分子式为C23H19N3O4，分子结构为
2.如权利要求1所述的一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，其特征在于：利用超高效液相色谱串联质谱法测定2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯含量的过程包括步骤
Step1.取2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯，以乙腈溶为溶剂，制备2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯对照样品溶液；
Step2.取坎地沙坦酯，以空白溶液为溶剂制备片剂供试品溶液；
Step3.分别取2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯对照样品溶液和片剂供试品溶液，利用超高效液相色谱串联质谱法进行测定，记录MRM质谱图，并计算2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯的含量。
3.如权利要求2所述的一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，其特征在于：所述的对照品溶液的制备过程包括
(1)取2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯10mg，称定，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；
(2)取10mL，置50mL量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，作为2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯对照品贮备液；
(3)取1mL，置20mL量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1mL中约1μg的对照品溶液，过滤，取续滤液，得对照品溶液。
4.如权利要求1所述的一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，其特征在于：所述的片剂供试品溶液的制备过程包括
取坎地沙坦酯100mg，置20mL量瓶中，加空白溶液溶解并定量稀释制成每1mL中含坎地沙坦酯5mg的片剂供试品溶液。
5.如权利要求2-4任一项所述的一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，其特征在于：所述的空白溶液为体积比为55:45的乙腈-水溶液。
6.如权利要求2所述的一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，其特征在于：在计算坎地沙坦酯中间体杂质含量时，以色谱图中对应的定量离子对峰面积A为纵坐标，各杂质的质量浓度C为横坐标，利用线性方程计算确定2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯的含量；且所述线性方程为A＝591058140.77134C-11673.46939，且线性方程的相关系数r＝0.99984，线性范围在0.1-2μg·mL-1之间。
7.如权利要求2所述的一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，其特征在于：本方法测定坎地沙坦酯片剂中2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-硝基苯甲酸乙酯含量时，测定2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-硝基苯甲酸乙酯的检测限下限为0.0004ng·mL-1；定量限下限为0.001ng·mL-1。
8.如权利要求2所述的一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，其特征在于：所述的利用超高效液相色谱串联质谱法测定坎地沙坦酯片剂中2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯含量的测定条件包括色谱条件和质谱条件。
9.如权利要求8所述的一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，其特征在于：所述的色谱条件为
色谱柱：Waters Cortecs@T3，柱规格，2.1mm×100mm，2.7μm；
流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸水溶液；
流速：0.5mL·min-1；
柱温：30℃；
进样体积：5μL，通过六通切换阀，0min进质谱，将4.5min之后的液相流出液切换至旁路，不进入质谱分析，在5.5min时候的液相流出液再切换至主路；
梯度洗脱程序：等度洗脱。
10.如权利要求8所述的一种快速测定坎地沙坦酯片剂中间体杂质含量的方法，其特征在于：所述的质谱条件为
采用ESI+源多反应监测采集模式，参数如下表
2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯测定的ESI离子源参数为
2-[[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]氨基]-3-硝基苯甲酸乙酯测定的母离子、子离子、离子模式、去簇电压、碰撞能和保留时间为
其中：“*”表示MRM定量离子。
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