CN116559325A - 一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析化学技术领域，具体公开了一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法；一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，该方法采用高效液相色法进行检测；色谱柱为C18色谱柱，流动相A为体积浓度0.1%‑0.3%的三氟乙酸水溶液，pH为2.8‑3.2，流动相B为乙腈溶液，流动相流速0.8‑1.2mL/min，采用梯度洗脱，检测器为紫外吸收检测器，检测波长为210‑230nm，色谱柱柱温为25‑35℃，进样量为10‑50μL；本发明提供的检测方法具有优异的专属性、灵敏度、线性、精密度、准确度、耐用性和溶液稳定性；适用于肾上腺色腙原料及片剂中杂质的质量控制。

Description

一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，尤其是涉及一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法。
背景技术
肾上腺色腙是一种止血药物，主要的止血原理就是增强毛细血管对损伤的抵抗力，而且降低毛细血管通透性来达到止血目的，因此，临床上常常用于鼻出血、视网膜出血、消化道出血、血尿等患者，还可以用于痔疮患者，但是对于血小板减少性紫癜所引起出血的疗效并不是特别好。
肾上腺色腙化学名为3-羟基-1-甲基二氢吲哚-5,6-二酮缩氨脲，分子式为C10H12N4O3，分子量为236.23，其结构式为：
通过分析本品原料药的合成工艺路线，肾上腺色腙工艺合成过程中产生的杂质及对应结构式如下：
Cb-1(1,2-苯二酚)：Cb-3(盐酸肾上腺酮)：/>Cb-4(盐酸肾上腺素)：/>Cb-5(氧化环合产物)：
为了确保肾上腺色腙药品安全性有效性，须对原料药合成过程中产生的杂质进行研究和质控，现有技术中均未报道过对上述杂质的分离检测方法，不便于成品肾上腺色腙中杂质的控制。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本申请提供了一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，为制定肾上腺色腙原料药或片剂的质量标准提供依据，从而提高药品的安全性。
第一方面，本申请提供一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，采用如下的技术方案：
一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，该方法利用高效液相色谱法进行检测，流动相A为体积浓度0.1％-0.3％三氟乙酸水溶液(氨水调节pH＝2.8-3.2)，流动相B为乙腈溶液，采用梯度洗脱方式进行洗脱。
有关物质包括1,2-苯二酚、盐酸肾上腺酮、盐酸肾上腺素以及式1所示的化合物中至少一种；
Cb-1(1,2-苯二酚)：Cb-3(盐酸肾上腺酮)：Cb-4(盐酸肾上腺素)：/>Cb-5(氧化环合产物)：
优选的，流动相A为体积浓度0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液。
优选的，采用梯度洗脱方式进行洗脱，梯度洗脱程序如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80-95 5-20
8 80-95 5-20
30 35-55 45-65
31 80-95 5-20
40 80-95 5-20
优选的，采用梯度洗脱方式进行洗脱，梯度洗脱程序如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80 20
8 80 20
30 35 65
31 80 20
40 80 20
优选的，采用梯度洗脱方式进行洗脱，梯度洗脱程序如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
8 95 5
30 45 55
31 95 5
40 95 5
优选的，采用梯度洗脱方式进行洗脱，梯度洗脱程序如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 90 10
8 90 10
30 D5 45
31 90 10
40 90 10
优选的，色谱柱为C18色谱柱，更优选的，色谱柱为Waters Atlantis T3色谱柱，规格为250×4.6mm，填料粒径为5μm。
优选的，流动相流速为0.8-1.2mL/min。
优选的，流动相流速为0.9-1.1mL/min，例如0.9mL/min、1.0mL/min或1.1mL/min。更优选的，流动相流速为1.0mL/min。
优选的，检测器为紫外吸收检测器，检测波长为210nm-230nm，例如，检测波长为210nm、215nm、220nm、225nm或230nm。
更优选的，检测波长为220nm。
优选的，色谱柱柱温为25-35℃。
优选的，色谱柱柱温为28-32℃，例如，色谱柱柱温为28℃、29℃、30℃、31℃或32℃，更优选的，色谱柱柱温为30℃。
优选的，进样量为10-50μL；例如，进样量为10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL或50μL。
更优选的，进样量为30μL。
优选的，流动相A的pH为2.8-3.2，例如2.8、2.9、3.0、3.1、3.2。
更优选的，流动相A的pH为3.0。
在一个具体的可实施方案中，一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，色谱检测条件如下：
色谱柱为Waters Atlantis T3色谱柱(C18色谱柱)，规格为250×4.6mm，填料粒径为5μm。
流动相A为体积浓度0.1％三氟乙酸水溶液(氨水调pH＝3.0)，流动相B为乙腈。
检测波长为220nm，色谱柱柱温为30℃，进样量为30μL。
流动相流速为1.0mL/min。
梯度洗脱程序如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
8 95 5
30 45 55
31 95 5
40 95 5
在一个具体的可实施方案中，一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，检测方法步骤如下：
(1)配制供试品溶液、对照品溶液和系统适用性溶液；
(2)按照上述的检测方法，设置高效液相检测条件；
(3)分别吸取对照品溶液、供试品溶液和系统适用性溶液，注入高效液相色谱仪，进行HPLC分析。
优选的，供试品溶液的制备方法如下：精密称取肾上腺色腙，加入稀释剂溶解，配制成质量浓度为0.5mg/ml的肾上腺色腙溶液；
优选的，系统适用性溶液的制备方法如下：精密称取肾上腺色腙杂质1，2-苯二酚、盐酸肾上腺酮、盐酸肾上腺素、式1所示的化合物和肾上腺色腙对照品，加稀释剂溶解，配制成质量浓度为0.5mg/ml的肾上腺色腙对照品，肾上腺色腙各杂质(1，2-苯二酚、盐酸肾上腺酮、盐酸肾上腺素、式1所示的化合物)的质量浓度均为0.5μg/ml；
优选的，对照品溶液的制备方法如下：精密量取供试品溶液，加入稀释剂溶解，配制成质量浓度为0.5μg/ml的对照品溶液。
优选的，稀释剂为流动相A、流动相B的混合物，流动相A和流动相B的体积比为7-10∶1。
更优选的，稀释剂为流动相A、流动相B的混合物，流动相A和流动相B的体积比为9∶1。
在一个具体的可实施方案中，一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，包括如下步骤：
(1)配制供试品溶液、对照品溶液和系统适用性溶液；
(2)设置高效液相检测条件：采用Waters Atlantis T3色谱柱(C18色谱柱)，规格为250×4.6mm，填料粒径为5μm，流动相A为体积浓度0.1％三氟乙酸水溶液(氨水调节pH＝3.0)，流动相B为乙腈溶液，流动相流速1.0mL/min，采用梯度洗脱，检测器为紫外吸收检测器，检测波长为220nm，色谱柱柱温为30℃，进样量为30μL；
(3)分别吸取对照品溶液、供试品溶液和系统适用性溶液，注入高效液相色谱仪，进行HPLC分析。
其中，系统适用性溶液的配制方法为：精密称取肾上腺色腙杂质Cb-1、Cb-3、Cb-4、Cb-5(式1所示的化合物)和肾上腺色腙对照品适量，加稀释剂溶解，配制成肾上腺色腙对照品浓度约为0.5mg/ml，肾上腺色腙各杂质浓度约为0.5μg/ml的混合溶液。
供试品溶液的配制方法为：精密称取肾上腺色腙适量，加稀释剂溶解，配制成肾上腺色腙浓度约为0.5mg/ml的溶液。
对照品溶液的配制方法为：精密量取1ml供试品溶液，置100ml量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，加稀释剂定容，摇匀；对照品溶液的终浓度为0.5μg/ml。
梯度洗脱程序如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
8 95 5
30 45 55
31 95 5
40 95 5
优选的，稀释剂为流动相A、流动相B的混合物，流动相A和流动相B的体积比为(7-10)∶1，更优选的，稀释剂为流动相A和流动相B的体积比9∶1。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
1、本发明公开了一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，该检测方法具有优异的专属性、灵敏度、线性、精密度、准确度、耐用性和溶液稳定性，可用于肾上腺色腙中有关物质的质量控制；
2、本发明选用Waters Atlantis T3色谱柱，使得本品与各有关物质达到有效分离，实现对肾上腺色腙中有关物质的高灵敏、高准确地定性定量研究，为肾上腺色腙中有关物质的质量控制奠定基础。
附图说明
图1为空白溶液液相色谱图；
图2为肾上腺色腙供试品溶液液相色谱图；
图3为系统适用性溶液液相色谱图。
具体实施方式
本申请涉及的原料均采用市售产品，以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例1：一种肾上腺色腙中有关物质的检测方法
1、色谱条件：
仪器：岛津LC-20A高效液相色谱仪；
色谱柱：Waters Atlantis T3色谱柱(C18色谱柱)，规格为250×4.6mm，填料粒径为5μm。
流动相：流动相A为体积浓度0.1％三氟乙酸水溶液(氨水调pH为3.0)，流动相B为乙腈溶液。
稀释剂：900ml流动相A和100ml流动相B混合，得到稀释剂。
流动相流速：1.0mL/min，采用梯度洗脱方式进行洗脱。
检测器为紫外吸收检测器，检测波长为220nm，进样量30μL，色谱柱柱温为30℃。
梯度洗脱程序如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
8 95 5
30 45 55
31 95 5
40 95 5
2、样品配制：
系统适用性溶液：精密称取肾上腺色腙杂质Cb-1、Cb-3、Cb-4、Cb-5(式1所示的化合物)和肾上腺色腙对照品适量，加稀释剂溶解，配制成肾上腺色腙对照品浓度约为0.5mg/ml，肾上腺色腙各杂质浓度约为0.5μg/ml的混合溶液。
供试品溶液：精密称取肾上腺色腙适量，加稀释剂溶解，配制成肾上腺色腙浓度约为0.5mg/ml的溶液。
对照品溶液：精密量取1ml供试品溶液，置100ml量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，对照品溶液的终浓度为0.5μg/ml。
3、检测方法
精密量取系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行HPLC分析，记录色谱图。
实施例2：一种肾上腺色腙中有关物质的检测方法
本实施例与实施例1的区别之处在于：流动相流速为0.9ml/min。
实施例3：一种肾上腺色腙中有关物质的检测方法
本实施例与实施例1的区别之处在于：流动相流速为1.1ml/min。
实施例4：一种肾上腺色腙中有关物质的检测方法
本实施例与实施例1的区别之处在于：色谱柱柱温为28℃。
实施例5：一种肾上腺色腙中有关物质的检测方法
本实施例与实施例1的区别之处在于：色谱柱柱温为32℃。
实施例6：一种肾上腺色腙中有关物质的检测方法
本实施例与实施例1的区别之处在于：更换另外一根同型号色谱柱，即WatersAtlantis T3色谱柱。
实施例7：一种肾上腺色腙中有关物质的检测方法
本实施例与实施例1的区别之处在于：流动相A的pH值为2.8。
实施例8：一种肾上腺色腙中有关物质的检测方法
本实施例与实施例1的区别之处在于：流动相A的pH值为3.2。以上实施例1-8结果汇总如下：
分析结果：与实施例1检测结果比较，实施例2-8中系统适用性符合要求。按加校正因子自身对照法计算，校正后已知杂质的含量差值绝对值≤0.05％，其他单杂含量差值绝对值≤0.05％，总杂含量差值绝对值≤0.10％，符合规定。
按照实施例1对本发明检测方法进行方法学验证，包括专属性、灵敏度、线性、校正因子、精密度、准确性、耐用性、溶液稳定性等项目。
结果汇总如下：
专属性结果显示：空白稀释剂在已知杂质出峰处无可检测到的峰，对供试品溶液测定无干扰；肾上腺色腙峰与相邻杂质峰的分离度均符合规定、肾上腺色腙峰纯度均符合要求、物料平衡率均在90％-110％。
灵敏度结果显示：肾上腺色腙的检测限浓度为0.026μg/ml,定量限浓度为0.052μg/ml；Cb-4的检测限浓度为0.052μg/ml,定量限浓度为0.104μg/ml；Cb-5的检测限浓度为0.052μg/ml,定量限浓度为0.104μg/ml；Cb-3的检测限浓度为0.052μg/ml,定量限浓度为0.105μg/ml；Cb-1的检测限浓度为0.079μg/ml,定量限浓度为0.158μg/ml；因此，本申请的检测方法灵敏度高。
定量限结果显示：定量限水平溶液色谱图中，连续进样6针峰面积的RSD<10.0％，符合规定。
线性、校正因子结果显示：经线性回归处理，截距的绝对值小于100％浓度峰面积的10％，相关系数r大于0.99，符合规定。Cb-4校正因子为2.1，Cb-5校正因子为1.4，Cb-3校正因子为1.8，Cb-1校正因子为1.2。
系统进样精密度结果显示：精密度溶液色谱图中，各组分保留时间及峰面积的RSD≤2％，符合规定。
重复性结果显示：按加校正因子自身对照法计算，6份供试品中测得的有关物质含量与平均值差值绝对值≤0.05％，符合规定。
中间精密度结果显示：第二人次按加校正因子自身对照法计算，6份供试品中测得的有关物质含量与平均值差值绝对值≤0.05％；两人次12份供试品中测得的有关物质含量与平均值差值绝对值≤0.05％，符合规定。
准确度结果显示：准确度溶液回收率均在90％-110％之间，回收率结果的RSD≤10％，符合规定。
稳定性结果显示：对照品溶液在36小时内溶液稳定；按加校正因子自身对照法计算，已知杂质的含量差值绝对值≤0.05％，总杂含量差值绝对值≤0.10％，供试品溶液在47小时内溶液稳定。
耐用性结果显示：各耐用性条件下的检测结果(实施例2-8)，与正常色谱条件检测结果(实施例1)比较，已知杂质的含量、其他单杂含量、总杂含量的结果均在可接受范围内，符合规定，耐用性良好。
根据上述结果，本发明肾上腺色腙中有关物质的检测方法具有；具有优异的专属性、线性、灵敏度、精密度、准确度、耐用性和溶液稳定性，适用于肾上腺色腙中有关物质的检测。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测，流动相A为体积浓度0.1％-0.3％的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱方式进行洗脱；
其中，梯度洗脱程序如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 80-95 5-20 8 80-95 5-20 30 35-55 45-65 31 80-95 5-20 40 80-95 5-20
。
2.根据权利要求1所述的一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，其特征在于：色谱柱为C18色谱柱，流动相流速为0.8-1.2mL/min，检测器为紫外吸收检测器，检测波长为210-230nm，色谱柱柱温为25-35℃，进样量为10-50μL；流动相A的pH为2.8-3.2。
3.根据权利要求2所述的一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，其特征在于：流动相流速为0.9-1.1mL/min，色谱柱柱温为28-32℃。
4.根据权利要求3所述的一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，其特征在于：流动相流速为1.0mL/min；色谱柱柱温为30℃。
5.根据权利要求2所述的一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，其特征在于：色谱柱为Waters Atlantis T3色谱柱，规格为250×4.6mm，填料粒径为5μm；检测波长为220nm，进样量为30μL；流动相A的pH为3.0。
6.根据权利要求1所述的一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，其特征在于：流动相A为体积浓度0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈。
7.根据权利要求1所述的一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，其特征在于：其中，梯度洗脱程序如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 95 5 8 95 5 30 45 55 31 95 5 40 95 5
。
8.根据权利要求1所述的一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，其特征在于：有关物质包括1,2-苯二酚、盐酸肾上腺酮、盐酸肾上腺素以及式1所示的化合物中至少一种；
9.根据权利要求1-8任一项所述的一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤如下：
(1)配制供试品溶液、对照品溶液和系统适用性溶液；
(2)按照权利要求1-8任一项所述的检测方法，设置高效液相检测条件；
(3)分别吸取对照品溶液、供试品溶液和系统适用性溶液，注入高效液相色谱仪，进行HPLC分析。
10.根据权利要求9所述的一种肾上腺色腙中有关物质的分离检测方法，其特征在于：
供试品溶液的制备方法如下：精密称取肾上腺色腙，加入稀释剂溶解，配制成质量浓度为0.5mg/ml的肾上腺色腙溶液；
对照品溶液的制备方法如下：精密量取供试品溶液，加入稀释剂溶解，配制成质量浓度为0.5μg/ml的对照品溶液；
系统适用性溶液的制备方法如下：精密称取肾上腺色腙杂质1,2-苯二酚、盐酸肾上腺酮、盐酸肾上腺素、式1所示的化合物和肾上腺色腙对照品，加稀释剂溶解，配制成质量浓度为0.5mg/ml的肾上腺色腙对照品，肾上腺色腙各杂质的质量浓度均为0.5μg/ml；
稀释剂为流动相A、流动相B的混合物，流动相A和流动相B的体积比为(7-10):1。
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