CN110274966A

CN110274966A - 高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法

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Publication number: CN110274966A
Application number: CN201910177048.2A
Authority: CN
Inventors: 胡国宜; 胡锦平; 李艳芬; 王仁冬; 黄健
Original assignee: CHANGZHOU SUNLIGHT PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: CHANGZHOU SUNLIGHT PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: CN110274966B

Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法，采用流动相A+流动相B的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氟乙酸水溶液中的一种，流动相A中，酸的体积百分比为0.05%～0.5%，流动相B为甲醇和/或乙腈。本发明的方法通过选择合适的流动相以及洗脱条件，能够将托伐普坦原料药与各杂质在同一色谱条件下进行快速有效的分离，主峰与相邻杂质峰、各杂质峰之间均能达到基线分离。本发明的方法专属性强、灵敏度高、精密度好、准确度高，能够有效控制托伐普坦原料药的质量，最终保证了托伐普坦原料药的有效性和安全性。

Description

高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法。

背景技术

托伐普坦是由日本大冢制药公司（Otsuka Pharmaceutical Co.）研制开发，2009年分别在美国和欧洲上市，2010年在日本上市，商品名：Samsca®。托伐普坦为特异性拮抗精氨酸加压素，用于治疗高容或等容性低钠血症伴心力衰竭、肝硬化、抗利尿激素分泌异常综合征。其化学名称为：N-[4-[(5R)-7-氯-5-羟基-2,3,4,5-四氢-1-苯并氮杂卓-1-甲酰基]-3-甲基苯基]-2-甲基苯甲酰胺，其结构式如下：

。

托伐普坦常规合成路线如下：

。

托伐普坦原料药中的特定杂质和非特定杂质一般有以下几个原因引起：合成过程中引入的起始物料、中间体、副产物等；另外，样品在贮存过程中也可能产生降解产物，目前，主要关注的杂质有以下7种：

杂质1：。

杂质2：。

杂质3：。

杂质4：。

杂质5：。

杂质6：。

杂质7：。

对于合成、生产、贮存托伐普坦原料药的过程中都可能产生以上杂质，均需进行严格控制，以保证产品质量。

中国专利文献CN105004803A公开了一种分离测定托伐普坦中多个杂质的液相色谱方法，该文献提及的杂质除了杂质Ⅳ（相当于上述杂质1）外，其余四种均是由于采用对甲基苯甲酰氯或者间甲基苯甲酰氯导致的，而这些情况在托伐普坦常规合成中几乎不可能存在，因此，该文献的方法无法解决测定托伐普坦常规合成中存在的上述杂质。

发明内容

本发明的目的在于解决上述问题，提供一种高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法。

实现本发明目的的技术方案是：一种高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法，采用流动相A+流动相B的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱。

所述流动相A为甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氟乙酸水溶液中的一种，优选为甲酸水溶液。

所述流动相A中，酸的体积百分比为0.05%～0.5%，优选为0.15%。

所述流动相B为甲醇和/或乙腈，优选为乙腈。

所述梯度洗脱条件如下：

0～28min，流动相A与流动相B的体积比为（90%～10%）∶（10%～90%）。

28～30min，流动相A与流动相B的体积比为10%∶90%。

30～30.1min，流动相A与流动相B的体积比为（10%～90%）∶（90%～10%）。

30.1～40min，流动相A与流动相B的体积比为90%∶10%。

具体见表1。

表1

时间（min）	流动相A	流动相B
			0	90%	10%
28	10%	90%
			30	10%	90%
30.1	90%	10%
			40	90%	10%

其它色谱条件如下：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。

柱温为25～45℃，优选为35℃。

检测波长为250nm～275nm，优选为265nm。

进样量为2～20μL，优选为10μL。

流动相的流速为0.6～1.4mL/min，优选为1.0mL/min。

稀释液为甲醇和/或乙腈-水，优选为乙腈-水。

所述稀释液中乙腈与水的体积比为60%∶40%～40%∶60%，优选为55%∶45%。

本发明具有的积极效果：

（1）本发明的方法通过选择合适的流动相以及洗脱条件，能够将托伐普坦原料药与各杂质（包括关注的特定杂质以及相关非特定杂质）在同一色谱条件下进行快速有效的分离，主峰与相邻杂质峰、各杂质峰之间均能达到基线分离。

（2）本发明的方法专属性强、灵敏度高、精密度好、准确度高，能够有效控制托伐普坦原料药的质量，最终保证了托伐普坦原料药的有效性和安全性。

附图说明

图1为实施例1中的系统适用性溶液的高效液相色谱图。

图2为实施例2中的0.1%的对照溶液的高效液相色谱图。

图3为实施例2中的供试品溶液的高效液相色谱图。

图4a～图4e为试验例1中各专属性试验的高效液相色谱图；其中，图4a为氧化破坏溶液的，图4b为酸破坏溶液的，图4c为碱破坏溶液的，图4d为高温破坏溶液的，图4e为光照破坏溶液的。

图5为试验例2中的0.05%的灵敏度溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

一、仪器。

高效液相色谱仪：Agilent 1260，DAD检测器。

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（4.6×150mm×3.5μm）。

二、色谱条件。

柱温：35℃。

检测波长：265nm。

稀释液：乙腈-水（体积比为55%∶45%）。

流动相A：0.15%甲酸水溶液。

流动相B：乙腈。

流动相流速：1.0mL/min。

进样量：10μL。

梯度洗脱条件见表1。

表1

时间（min）	0.15%甲酸水溶液	乙腈
			0	90%	10%
28	10%	90%
			30	10%	90%
30.1	90%	10%
			40	90%	10%

（实施例1）

分别精密称取杂质1～杂质7对照品各10mg，置于同一个20mL量瓶中，先用10mL乙腈溶解后，再用水稀释至刻度，摇匀，作为杂质储备液。

精密称取托伐普坦对照品10mg，置于20mL量瓶中，再精密量取0.2mL上述杂质储备液置于该量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，得到系统适用性溶液。

精密量取10μL系统适用性溶液，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图1，具体结果参见表2。

表2

	保留时间（min）	相对保留时间（min）	分离度
				杂质5	13.392	0.68	/
杂质6	15.719	0.80	19.13
				杂质2	17.348	0.88	13.10
杂质4	18.971	0.97	12.74
				托伐普坦	19.645	1.00	5.16
杂质7	20.047	1.02	3.03
				杂质1	21.115	1.07	7.83
杂质3	25.082	1.28	27.48

其中，托伐普坦的理论塔板数为355948，主峰拖尾因子为1.08。

由图1以及表2可以看出：系统适用性溶液中托伐普坦与各杂质（尤其是相邻杂质）间均能达到有效的分离。

（实施例2）

分别精密称取三批次（分别记为批次1～批次3）托伐普坦原料药25mg，分别置于三个50mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，得到三批次供试品溶液（0.5mg/mL）。

精密量取0.1mL各批次供试品溶液，置于三个100mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为三批次0.1%的对照溶液（0.5μg/mL）。

精密量取三批次0.1%的对照溶液以及三批次供试品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见表3。

表3

	批次1	批次2	批次3
				杂质1	/	/	/
杂质2	/	/	/
				杂质3	/	/	/
杂质4	0.04%	0.04%	0.03%
				杂质5	/	/	/
杂质6	/	/	/
				杂质7	0.01%	0.01%	0.04%
其他最大单杂	0.02%	0.04%	/
				总杂	0.09%	0.15%	0.07%

三批次色谱图基本相似，其中，批次3的0.1%的对照溶液色谱图以及供试品溶液色谱图分别见图2和图3。

由表3以及图2和图3可以看出：三批次样品均检测出特定杂质4及杂质7，但均不超过0.1%，其他特定杂质未检测出，其他未知单杂均不超过0.1%，总杂不超过0.5%。

（试验例1）

本试验例为本发明的检测方法的专属性试验。

a、氧化破坏：

称取托伐普坦原料药25mg，置于50mL量瓶中，先加10mL稀释液溶解，再加5mL的10wt%双氧水，在80℃下放置2h，冷却至室温，再用稀释液稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图4a。

b、酸破坏：

称取托伐普坦原料药25mg，置于50mL量瓶中，先加10mL稀释液溶解，再加5mL的1mol/L盐酸，在80℃下放置2h，冷却至室温，用氢氧化钠中和，再用稀释液稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图4b。

c、碱破坏：

称取托伐普坦原料药25mg，置于50mL量瓶中，先加10mL稀释液溶解，再加5mL的0.5mol/L氢氧化钠，在80℃下放置4h，冷却至室温，用盐酸中和，再用稀释液稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图4c。

d、高温破坏：

称取托伐普坦原料药25mg，置于称量瓶中，105℃下放置12h，冷却至室温，完全转移至50mL量瓶中，再用稀释液稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图4d。

e、光照破坏：

称取托伐普坦原料药25mg，置于50mL量瓶中，加入10mL稀释液溶解后，在光照条件下（总照度不低于1.2×106Lux·hr、近紫外能量不低于200W·hr/m²）放置10天，再用稀释液稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图4e。

由图4a～图4e可以看出：托伐普坦峰与各条件下破坏产生的降解峰均能有效分离，表明本发明的色谱条件专属性良好。

（试验例2）

本试验例为本发明的检测方法的灵敏度试验。

分别精密称取托伐普坦对照品以及杂质1～杂质7对照品各12.5mg，分别置于八个50mL量瓶中，用乙腈溶解稀释定容，作为托伐普坦以及杂质1～杂质7的储备液。

精密量取上述各储备液1mL，置于同一个25mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，作为混合储备液。

精密量取2.5mL上述混合储备液，置于100mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，得到0.05%的灵敏度溶液，精密量取10μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图5。

信噪比检测结果见表4。

表4

	信噪比（S/N）
		杂质1	29.7
杂质2	31.1
		杂质3	29.6
杂质4	28.0
		杂质5	15.0
杂质6	53.2
		杂质7	27.9
托伐普坦	32.4

由表4可以看出：信噪比均大于10，均在定量限以上，符合要求。

（试验例3）

本试验例为本发明的检测方法的线性与范围以及校正因子的试验。

精密量取上述各储备液1mL，置于同一个100mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，作为混合储备液。

分别精密量取1.0、2.5、4.0、5.0、6.0、7.5mL的线性储备液，分别置于六个25 mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，精密量取10μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，以浓度对峰面积进行线性回归，得线性回归方程，具体见表5。

表5

	线性回归方程	相关系数r	校正因子
				杂质1	y=0.1827x+0.0003	0.9997	1.09
杂质2	y=0.1855x-0.0034	0.9995	1.08
				杂质3	y=0.2085x-0.0020	0.9997	0.96
杂质4	y=0.1620x+0.0002	0.9997	1.23
				杂质5	y=0.0828x-0.0001	0.9994	2.41
杂质6	y=0.2657x-0.0040	0.9974	0.75
				杂质7	y=0.1676x-0.0010	0.9996	1.19
托伐普坦	y=0.1995x+0.0037	0.9999	1.00

由表5可以看出：各杂质在0.1μg/mL～0.75μg/mL的浓度范围内，线性关系良好。

（试验例4）

本试验例为本发明的检测方法的进样精密度试验。

将实施例1中的系统适用性溶液，按照上述色谱条件连续进样6针（分别记为针1～针6），按面积归一化法统计各杂质的RSD值，结果见表6。

表6

	针1峰面积百分比（%）	针2峰面积百分比（%）	针3峰面积百分比（%）	针4峰面积百分比（%）	针5峰面积百分比（%）	针6峰面积百分比（%）	峰面积百分比平均值（%）	RSD（%）
									杂质1	0.991	0.991	0.974	0.991	0.979	0.99	0.986	0.76
杂质2	0.95	0.953	0.937	0.956	0.941	0.95	0.948	0.77
									杂质3	1.059	1.058	1.043	1.056	1.046	1.058	1.053	0.66
杂质4	0.875	0.875	0.858	0.874	0.864	0.875	0.870	0.85
									杂质5	0.426	0.428	0.425	0.431	0.429	0.435	0.429	0.85
杂质6	1.631	1.634	1.607	1.634	1.616	1.634	1.626	0.72
									杂质7	0.897	0.898	0.885	0.896	0.888	0.898	0.894	0.64
托伐普坦	97.765	97.766	96.215	97.718	96.704	97.762	97.322	0.70

由表6可以看出：各杂质峰面积6针RSD均小于2%，表明本发明的检测方法进样精密度良好。

（试验例5）

本试验例为本发明的检测方法的重复性试验。

精密称取托伐普坦原料药25mg，置于50mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，作为样品溶液（平行配制6份，分别记为样1～样6），按照上述色谱条件进样检测，按面积归一化法统计RSD值，结果见表7。

表7

	峰面积百分比（%）	RSD（%）
			样1	99.92	0.00
样2	99.92	0.00
			样3	99.92	0.00
样4	99.92	0.00
			样5	99.92	0.00
样6	99.92	0.00

由表7可以看出：本发明的检测方法重复性良好。

（试验例6）

本试验例为本发明的检测方法的准确度试验。

分别精密称取杂质1～杂质7对照品各25mg，分别置于七个50mL量瓶中，用乙腈溶解稀释定容，作为各杂质的储备液。

精密量取上述各杂质的储备液1mL，置于同一个100mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，作为混合杂质储备液。

分别称取托伐普坦对照品25mg（平行称取10份，其中一份作为空白对照），分别置于十个50mL量瓶中，再分别精密量取上述混合杂质储备液各4mL、5mL、6mL（各三份），分别置于其中九个50mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

精密量取5mL上述混合杂质储备液，置于50mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

精密量取各供试品溶液和对照品溶液10μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，采用外标法以峰面积计算各杂质的回收率，结果见下表8。

表8

由表8可以看出：回收率均在90%～108%之间，RSD均小于5%，符合要求。

Claims

1.一种高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法，采用流动相A+流动相B的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱；所述流动相A为甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氟乙酸水溶液中的一种，所述流动相B为甲醇和/或乙腈。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法，其特征在于：所述流动相A中，酸的体积百分比为0.05%～0.5%。

3.根据权利要求2所述的高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法，其特征在于：所述流动相A中，酸的体积百分比为0.15%。

4.根据权利要求1至3之一所述的高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法，其特征在于：所述流动相A为甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈。

5.根据权利要求1至3之一所述的高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法，其特征在于：所述梯度洗脱条件如下：0～28min，流动相A与流动相B的体积比为（90%～10%）∶（10%～90%）；28～30min，流动相A与流动相B的体积比为10%∶90%；30～30.1min，流动相A与流动相B的体积比为（10%～90%）∶（90%～10%）；30.1～40min，流动相A与流动相B的体积比为90%∶10%。

6.根据权利要求4所述的高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法，其特征在于：所述梯度洗脱条件如下：0～28min，流动相A与流动相B的体积比为（90%～10%）∶（10%～90%）；28～30min，流动相A与流动相B的体积比为10%∶90%；30～30.1min，流动相A与流动相B的体积比为（10%～90%）∶（90%～10%）；30.1～40min，流动相A与流动相B的体积比为90%∶10%。

7.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法，其特征在于：采用的稀释液为甲醇和/或乙腈-水，体积比为60%∶40%～40%∶60%。

8.根据权利要求7所述的高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法，其特征在于：采用的稀释液为乙腈-水，体积比为60%∶40%～40%∶60%。

9.根据权利要求8所述的高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法，其特征在于：采用的稀释液为乙腈-水，体积比为55%∶45%。

10.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定托伐普坦原料药中有关物质的方法，其特征在于其它色谱条件如下：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25～45℃；检测波长为250nm～275nm；进样量为2～20μL；流动相的流速为0.6～1.4mL/min。