CN105004803A - 一种分离测定托伐普坦中多个杂质的液相色谱方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离测定托伐普坦中多个杂质的液相色谱方法。高效液相色谱的检测条件为：检测波长：230nm～280nm；色谱柱：Symmetry？shield？RP18；流动相：乙腈-含有0.2％磷酸的水溶液，其中，乙腈的体积分数为43-47％。本发明方法解决了托伐普坦及其五个杂质分离测定的问题，特别是解决了托伐普坦的位置异构体杂质之间及托伐普坦中间体的位置异构体杂质之间的分离测定问题，专属性强，简便、快速、精确，测定结果准确可靠，从而可以有效监控托伐普坦的质量，提高了药物的安全性。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种分离测定托伐普坦中多个杂质的液相色谱方法。
背景技术
托伐普坦(Tolvaptan商品名：Samsca)，化学名为N-[4-[(5RS)-7-氯-5-羟基-2,3,4,5-四氢-1H-苯并[b]氮杂卓-1-甲酰基]-3-甲基苯基]-2-甲基苯甲酰胺(分子量：C26H25ClN2O3)，化学结构式见式Ⅰ，是由日本大冢制药公司(OtsukaPharm)开发的一种口服选择性非肽类新型精氨酸加压素V2受体拮抗剂。美国FDA于2009年5月批准其用于治疗由充血性心力衰竭(CHF)、肝硬化以及抗利尿激素分泌不足综合征所导致的高容性或等容性低钠血症(血钠＜125mg/L，或者症状轻微)。口服托伐普坦片能明显减轻患者体重和水肿，且不破坏血电解质平衡，并能有效升高CHF患者并发的低钠血症。临床研究表明，托伐普坦与其它抗心衰药物相比耐受性好，治疗中不必限制水的摄入，不良反应轻，应用前景广阔。
托伐普坦可以通过下述路线合成：
其中，式Ⅳ所示的N-[4-[7-氯-5-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-苯并[b]氮杂卓-1-甲酰基]-3-甲基苯基]-2-甲基苯甲酰胺(分子量：C26H23ClN2O3)是托伐普坦合成路线的重要中间体，同时也是托伐普坦的主要降解产物。
式(a)所示的邻甲基苯甲酰氯，是合成托伐普坦的重要起始物料，式(b)所示的对甲基苯甲酰氯和式(c)所示的间甲基苯甲酰氯均为其位置异构体杂质。由于邻甲基苯甲酰氯(a)在紫外光波长下无吸收，且较易水解，无法通过高效液相色谱法进行检测。即使采用现有气相色谱法进行检测，也无法对其位置异构体杂质对甲基苯甲酰氯(b)和间甲基苯甲酰氯(c)进行质量控制。
因此，当对甲基苯甲酰氯(b)参与托伐普坦的合成反应，会生成式Ⅱ所示的N-[4-[7-氯-5-羟基-2,3,4,5-四氢-1H-苯并[b]氮杂卓-1-甲酰基]-3-甲基苯基]-4-甲基苯甲酰胺和式Ⅴ所示的N-[4-[7-氯-5-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-苯并[b]氮杂卓-1-甲酰基]-3-甲基苯基]-4-甲基苯甲酰胺；而间甲基苯甲酰氯(c)参与托伐普坦的合成反应，则生成式Ⅲ所示的N-[4-[7-氯-5-羟基-2,3,4,5-四氢-1H-苯并[b]氮杂卓-1-甲酰基]-3-甲基苯基]-3-甲基苯甲酰胺和式Ⅵ所示的N-[4-[7-氯-5-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-苯并[b]氮杂卓-1-甲酰基]-3-甲基苯基]-3-甲基苯甲酰胺。
可见，由于邻甲基苯甲酰氯中含有难以控制的位置异构体杂质，会导致式Ⅳ化合物含有杂质Ⅴ、Ⅵ，这些杂质会在制备托伐普坦的反应中分别生成式Ⅱ和式Ⅲ化合物。因此，以上五个杂质的存在对托伐普坦的临床用药安全构成了潜在的威胁。然而，仅有托伐普坦喷雾干燥粉质量标准的复核说明(标准号：JX20110046)报道了杂质Ⅳ的检测。而托伐普坦Ⅰ的位置异构体杂质Ⅱ、Ⅲ以及托伐普坦中间体Ⅳ的位置异构体杂质Ⅴ和Ⅵ的检测方法的并未见相关报道。
因此，实现托伐普坦的位置异构体杂质及托伐普坦中间体的位置异构体杂质的分离测定对于托伐普坦质量控制方面具有现实意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种分离测定托伐普坦中多个杂质的液相色谱方法，实现了托伐普坦及其五个杂质的分离测定。包括以下步骤：
(1)获得各杂质对照品的保留时间以及峰面积与浓度的对应关系：
a、分别取杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的对照品，加入溶剂溶解，作为对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行检测，检测条件为：
检测波长：230nm～280nm；
色谱柱：Symmetry shield RP18；
流动相：乙腈-含有0.2％磷酸的水溶液，其中，乙腈的体积分数为43-47％；
b、记录各杂质相应的保留时间、浓度和峰面积；
(2)检测待测样品：
c、取待测托伐普坦样品，加入溶剂溶解，作为供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行检测，以步骤a相同的检测条件检测；
d、根据步骤b的结果确定步骤c所得谱图中的各峰归属，记录供试品溶液中杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的峰面积，按外标法计算供试品中杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的含量。
进一步优选地，所述检测波长为254nm。
进一步优选地，所述色谱柱的长度为150mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。
进一步优选地，所述流动相中乙腈的体积分数为45％。
进一步优选地，所述色谱条件的柱温为20-30℃。
进一步优选地，所述柱温为25℃。
进一步优选地，所述流动相的流速为1.0mL/min。
进一步优选地，所述溶剂为甲醇。
进一步优选地：所述对照品溶液的浓度为1.0-6.0μg/mL
进一步优选地，所述高效液相色谱检测的进样量为10μL。
本发明通过筛选出的高效液相色谱检测条件，尤其是对色谱柱的筛选和流动相比例的筛选，能够测定出托伐普坦产品中的杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的含量，解决了通常情况下托伐普坦的位置异构体杂质之间及托伐普坦中间体的位置异构体杂质之间难以分离的问题。该方法专属性强，简便、快速、精确，测定结果准确可靠，从而可以有效监控托伐普坦的质量，提高了药物的安全性。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1为本发明检测条件的对照品溶液的HPLC图；
图2为实施例1中对比检测条件1的对照品溶液的HPLC图；
图3为实施例1中对比检测条件2的对照品溶液的HPLC图；
图4为实施例1中对比检测条件3对照品溶液的HPLC图；
图5为试验例第1项的托伐普坦Ⅰ的紫外光谱图；
图6为试验例第1项的杂质Ⅱ的紫外光谱图；
图7为试验例第1项的杂质Ⅲ的紫外光谱图；
图8为试验例第1项的杂质Ⅳ的紫外光谱图；
图9为试验例第1项的杂质Ⅴ的紫外光谱图；
图10为试验例第1项的杂质Ⅵ的紫外光谱图；
图11为试验例第2项的供试品溶液的HPLC图；
图12为试验例第2项的杂质Ⅱ定位溶液的HPLC图；
图13为试验例第2项的杂质Ⅲ定位溶液的HPLC图；
图14为试验例第2项的杂质Ⅳ定位溶液的HPLC图；
图15为试验例第2项的杂质Ⅴ定位溶液的HPLC图；
图16为试验例第2项的杂质Ⅵ定位溶液的HPLC图；
图17为试验例第2项的系统适用性溶液的HPLC图；
图18为试验例第2项的溶剂的HPLC图；
图19-23为各杂质的标准曲线图，纵坐标为峰面积，横坐标为浓度；
图19为试验例第3项的杂质Ⅱ的标准曲线；
图20为试验例第3项的杂质Ⅲ的标准曲线；
图21为试验例第3项的杂质Ⅳ的标准曲线；
图22为试验例第3项的杂质Ⅴ的标准曲线；
图23为试验例第3项的杂质Ⅵ的标准曲线。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，均可通过购买市售产品获得。具体如下：
托伐普坦Ⅰ(粗品)的批号为20131101；杂质Ⅱ对照品的批号为20131218，含量：99.14％；杂质Ⅲ对照品的批号为20131218A，含量：99.11％；杂质Ⅳ对照品的批号为20131101，含量：99.7％；杂质Ⅴ对照品的批号为20131215，含量：99.0％；杂质Ⅵ对照品的批号为20131216，含量：99.24％；均来源于成都百裕科技制药有限公司。实施例和试验例中的托伐普坦Ⅰ和杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的对照品均为上述产品。
UV-2600型紫外-可见分光光度计可购自岛津公司；AUW220D型精密电子天平可购自岛津公司；LC-20AT型高效液相色谱泵可购自岛津公司；SPD-20A紫外检测器可购自岛津公司；SIL-20A自动进样器可购自岛津公司；LcSolution工作站可购自岛津公司；C18(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱可购自岛津公司；YMC-Pack ODS-A(150mm×6.0mm I.D.S-5μm，12nm)可购自北京绿百草科技有限公司；Symmetry shieldTM RP18(4.6×150mm，5μm)可购自沃特世科技(上海)有限公司。
实施例1 本发明的检测条件
高效液相色谱仪：LC-20AT，SPD-20A
色谱柱：Symmetry shieldTM RP18(4.6×150mm，5μm)；
流动相：乙腈-水(含有0.2％的磷酸)(45:55)；
流速：1.0mL/min；
检测波长：254nm；
柱温：25℃；
进样体积：10μL。
检测步骤：
取杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的对照品各适量，用甲醇溶解，配制成每1mL各约含6.0μg的对照品溶液
测定法：取上述溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图1所示。图谱中杂质Ⅱ和杂质Ⅲ的色谱峰分离度为1.518；杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的色谱峰分离度为1.688。图1的峰值数据如表1所示。
表1对照品溶液的检测结果表
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 高度 | 面积％ | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) |
| 1 | 14.063 | 141680 | 6869 | 20.201 | 10496 | —— |
| 2 | 14.748 | 121819 | 5595 | 17.369 | 10474 | 1.518 |
| 3 | 17.754 | 144282 | 5705 | 20.572 | 11256 | 5.827 |
| 4 | 21.891 | 153445 | 4977 | 21.878 | 11422 | 6.557 |
| 5 | 23.056 | 140130 | 4320 | 19.980 | 11513 | 1.688 |
| 总计 | 701356 | 27467 | 100.000 |
以上结果证明，上述检测条件下托伐普坦各有关物质的色谱峰分离度均达到1.5以上，五个杂质在该检测条件下均能达到良好的分离，可以满足中国药典的要求，为准确测定托伐普坦中各杂质的含量提供了有效保障。
除此之外，以上杂质的保留时间均在30min以内，时间较短，适合于工业应用。
对比检测条件1：
高效液相色谱仪：LC-20AT，SPD-20A
色谱柱：C18(150mm×4.6mm，5μm)；
流动相：乙腈-水(含有0.2％的磷酸)(50:50)；
流速：1.0mL/min；
检测波长：254nm；
柱温：25℃；
进样体积：10μL。
检测步骤：
取杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的对照品各适量，用甲醇溶解，配制成每1mL各约含6.0μg的对照品溶液。
测定法：取上述溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图2所示。图谱中杂质Ⅱ和杂质Ⅲ的色谱峰的分离度为0.609；杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的色谱峰的分离度为0.888。图1的峰值数据如表1所示。
表2对照品溶液的检测结果表
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 高度 | 面积％ | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) |
| 1 | 9.730 | 145055 | 9217 | 20.403 | 6366 | —— |
| 2 | 10.047 | 121598 | 7722 | 17.104 | 5264 | 0.609 |
| 3 | 12.747 | 146324 | 7438 | 20.582 | 9421 | 5.003 |
| 4 | 15.087 | 156843 | 6789 | 22.061 | 9059 | 4.036 |
| 5 | 15.664 | 141122 | 5988 | 19.850 | 8870 | 0.888 |
| 总计 | 710942 | 37155 | 100.000 |
以上结果证明，上述检测条件无法将托伐普坦的五个杂质的色谱峰完全分离。
对比检测条件2：
托伐普坦片标准YBH03332011所述的检测条件：
高效液相色谱仪：LC-20AT，SPD-20A；
色谱柱：YMC-Pack ODS-A(150mm×6.0mm I.D.S-5μm，12nm)；
流动相：乙腈-水(含有0.2％的磷酸)(50:50)；
流速：1.0mL/min；
检测波长：254nm；
柱温：25℃；
进样体积：10μL。
检测步骤：
取杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的对照品各适量，用甲醇溶解，配制成每1mL各约含6.0μg的对照品溶液。
测定法：取上述溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图3所示。图谱中杂质Ⅱ和杂质Ⅲ的色谱峰的分离度为0.739；杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的色谱峰的分离度为0.953。图3的峰值数据如表2所示。
表3对照品溶液的检测结果表
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 高度 | 面积％ | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) |
| 1 | 15.588 | 144925 | 5989 | 20.298 | 8601 | —— |
| 2 | 16.169 | 121928 | 4925 | 17.077 | 8051 | 0.739 |
| 3 | 20.735 | 146901 | 4720 | 20.574 | 10055 | 5.901 |
| 4 | 25.373 | 157311 | 4148 | 22.032 | 9999 | 5.036 |
| 5 | 26.447 | 142937 | 3630 | 20.019 | 9905 | 0.953 |
| 总计 | 714002 | 23411 | 100.000 |
以上结果证明，托伐普坦片标准YBH03332011中所述的检测条件无法将托伐普坦的五个杂质的色谱峰完全分离。
对比检测条件3：
高效液相色谱仪：LC-20AT，SPD-20A
色谱柱：YMC-Pack ODS-A(150mm×6.0mm I.D.S-5μm，12nm)；
流动相：乙腈-水(含有0.2％的磷酸)(45:55)；
流速：1.0mL/min；
检测波长：254nm；
柱温：25℃；
进样体积：10μL。
检测步骤：
取杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的对照品各适量，用甲醇溶解，配制成每1mL各约含6.0μg的对照品溶液。
测定法：取上述溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图4所示。图谱中杂质Ⅱ和杂质Ⅲ的色谱峰的分离度为0.909；杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的色谱峰的分离度为1.068。图4的峰值数据如表4所示。
表4对照品溶液的检测结果表
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 高度 | 面积％ | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) |
| 1 | 24.470 | 142632 | 4334 | 20.637 | 12347 | —— |
| 2 | 25.367 | 115406 | 3521 | 16.697 | 12744 | 0.909 |
| 3 | 32.115 | 141422 | 3171 | 20.461 | 11702 | 6.468 |
| 4 | 39.781 | 154026 | 2705 | 22.285 | 11028 | 5.673 |
| 5 | 41.432 | 137675 | 2365 | 19.919 | 11065 | 1.068 |
| 总计 | 691161 | 16096 | 100.000 |
以上结果证明，上述检测条件无法将托伐普坦的五个杂质的色谱峰完全分离。
实施例2 托伐普坦及其杂质的检测
检测条件：
高效液相色谱仪：LC-20AT，SPD-20A
色谱柱：Symmetry shieldTM RP18(4.6×150mm，5μm)；
流动相：乙腈-水(含有0.2％的磷酸)(45:55)；
流速：1.0mL/min；
检测波长：254nm；
柱温：25℃；
溶剂：甲醇；
进样体积：10μL。
a、取托伐普坦Ⅰ(粗品)10mg，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；
b、取杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ对照品适量，分别用溶剂溶解并稀释制成浓度各约为1.0μg/mL的对照品溶液；
c、分别取步骤a的供试品溶液和步骤b的对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行检测；
d、分别记录步骤c供试品溶液和对照品溶液中杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的峰面积，按外标法计算，供试品溶液中杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的峰面积均为0，供试品中该5个杂质均未检出。
为进一步说明本发明方法的有益效果，本发明提供以下试验例。
试验例 本发明检测方法的方法学研究
本试验例中各种试验均采用如下条件：
高效液相色谱仪：LC-20AT，SPD-20A；
色谱柱：Symmetry shieldTM RP18(4.6×150mm，5μm)；
流动相：乙腈-水(含有0.2％的磷酸)(45:55)；
流速：1.0mL/min；
检测波长：254nm；
柱温：25℃；
溶剂：甲醇；
进样体积：10μL。
1、检测波长
取托伐普坦Ⅰ(粗品)和杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的对照品各适量，用溶剂溶解并稀释制成适宜浓度的溶液，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版二部附录IVA)在200～400nm范围内进行光谱扫描，紫外光谱图如图5～图10所示。结果显示，托伐普坦Ⅰ、杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的紫外光谱图基本一致，在200～280nm范围内均有较高的吸收，避开末端吸收段，在230～280nm范围内选择测定波长，参照现有的托伐普坦片标准YBH03332011，最终选择托伐普坦的通用检测波长254nm作为有关物质测定的检测波长。
2、专属性试验
取杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的对照品各适量，用溶剂溶解并稀释制成每1mL中各约含1.0mg的溶液，分别作为杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的对照品贮备液；取杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的对照品贮备液，用溶剂稀释制成每1mL约含10μg的溶液，分别作为杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的定位溶液。另取托伐普坦Ⅰ(粗品)适量，用溶剂溶解并稀释制成每1mL中约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液。取杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的对照品贮备液和供试品溶液各适量，用溶剂稀释制成每1mL含杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ各约1μg，含托伐普坦Ⅰ约10μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。分别精密取上述各杂质的定位溶液、供试品溶液、系统适用性溶液及溶剂各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如图11～18所示。
由图11-18可知，在本发明检测方法可以将托伐普坦Ⅰ、杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的色谱峰完全分离，且溶剂对托伐普坦Ⅰ及五个杂质的测定无干扰，证明本发明检测方法的专属性强。
3、标准曲线和线性范围
精密量取试验例第2项下杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ对照品贮备液各适量，用溶剂稀释制成一系列浓度的对照品溶液。分别精密取不同浓度的对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。分别测定峰面积，结果如表5所示。
表5线性关系
以杂质对照品溶液的浓度为横坐标X，以其峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的线性回归方程及相关系数r；标准曲线如图19～23所示。
结果表明，本发明检测方法中杂质Ⅱ的浓度在0.20μg/mL～10.06μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝23314X-3.775，r＝0.9999；杂质Ⅲ的浓度在0.21μg/mL～10.25μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝21499X-420.5，r＝1；杂质Ⅳ的浓度在0.20μg/mL～10.16μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝23646X-298.7，r＝1；杂质Ⅴ的浓度在0.20μg/mL～10.10μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝25780X-894.0，r＝1；杂质Ⅵ的浓度在0.21μg/mL～10.36μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝22887X-566.0，r＝0.9999。证明本发明方法线性范围广，准确度高。
此外，从各杂质的标准曲线方程和图可以看出，斜率远远大于截距，标准曲线接近原点，说明各杂质的含量测定适合于本发明的外标一点法。
4、精密度试验
取试验例第3项下各杂质对照品浓度约为1.0μg/mL的对照品溶液，精密取10μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，按照本发明的检测方法分别测定峰面积，结果如表6所示。
表6精密度试验结果
计算得到杂质Ⅱ峰面积的RSD为：0.99％，杂质Ⅲ峰面积的RSD为：1.16％，杂质Ⅳ峰面积的RSD为：1.01％，杂质Ⅴ峰面积的RSD为：0.64％，杂质Ⅵ峰面积的RSD为：0.84％，证明本发明的检测方法精密度优异。
5、定量限
精密量取试验例第3项下浓度约为1.0μg/mL的杂质对照品溶液适量，用溶剂稀释25倍，精密取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。杂质Ⅱ(浓度：0.040μg/mL)的峰高约为基线噪音的10倍，按信噪比S/N＝10计，得杂质Ⅱ的定量限为0.40ng；杂质Ⅲ(浓度：0.041μg/mL)的峰高约为基线噪音的10倍，按信噪比S/N＝10计，得杂质Ⅲ的定量限为0.41ng；杂质Ⅳ(浓度：0.041μg/mL)的峰高约为基线噪音的10倍，按信噪比S/N＝10计，得杂质Ⅳ的定量限为0.41ng；杂质Ⅴ(浓度：0.040μg/mL)的峰高约为基线噪音的10倍，按信噪比S/N＝10计，得杂质Ⅴ的定量限为0.40ng；杂质Ⅵ(浓度：0.041μg/mL)的峰高约为基线噪音的10倍，按信噪比S/N＝10计，得杂质Ⅵ的定量限为0.41ng。证明本发明方法的检测灵敏度高，可以充分满足有关物质测定的要求。
6、重复性试验
精密称取托伐普坦Ⅰ(粗品)6份，各约10mg，分别置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，得供试品溶液。精密量取上述6份供试品溶液各10μL，按照本发明的检测方法进行检测，按外标法以峰面积计算杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的含量，结果如表7所示。
表7重复性试验结果
| 样品编号 | 杂质Ⅱ％ | 杂质Ⅲ％ | 杂质Ⅳ％ | 杂质Ⅴ％ | 杂质Ⅵ％ |
| 1 | 0％ | 0％ | 0％ | 0％ | 0％ |
| 2 | 0％ | 0％ | 0％ | 0％ | 0％ |
| 3 | 0％ | 0％ | 0％ | 0％ | 0％ |
| 4 | 0％ | 0％ | 0％ | 0％ | 0％ |
| 5 | 0％ | 0％ | 0％ | 0％ | 0％ |
| 6 | 0％ | 0％ | 0％ | 0％ | 0％ |
由上述结果可知，本发明检测方法的重复性良好。
7、溶液稳定性试验
精密称取托伐普坦Ⅰ(粗品)10.26mg，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，得供试品溶液。分别于配制后0h、1h、2h、4h、6h、8h进样10μL，记录色谱图，考察其供试品溶液中主成分及杂质的稳定性情况，用面积归一化法分别计算本品单个杂质和杂质总量，并统计杂质个数，结果如表8所示。
表8供试品溶液稳定性试验结果表
由上述结果可知，在配制后8小时内供试品溶液的主峰面积、单个杂质含量和杂质总量几乎无变化，杂质个数未增加。证明本发明检查方法供试品溶液较稳定。
8、回收率试验
精密称取托伐普坦Ⅰ(粗品)9份，各约10mg，分别置10mL量瓶中，加入试验例第3项下各杂质浓度约为10μg/mL的对照品溶液0.8mL、1.0mL、1.2mL各3份，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为回收率供试品溶液。分别精密取9份回收率供试品溶液及试验例第4项下的对照品溶液各10μL进样测定，记录色谱图，计算杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的测得量、对照品加入量及回收率，结果如表9～13所示。
计算公式：
式中：a为供试品中所含特定杂质的量(μg)；
b为特定杂质对照品加入量(μg)；
c为特定杂质的测得量(μg)。
表9杂质Ⅱ回收率试验结果表
表10杂质Ⅲ回收率试验结果表
表11杂质Ⅳ回收率试验结果表
表12杂质Ⅴ回收率试验结果表
表13杂质Ⅵ回收率试验结果表
以上试验结果表明，本发明检测方法测定托伐普坦Ⅰ(粗品)中的杂质Ⅱ-Ⅵ，杂质Ⅱ的回收率在84.79％～86.45％之间，相对标准偏差为0.56％；杂质Ⅲ的回收率在91.49％～96.48％之间，相对标准偏差为1.58％；杂质Ⅳ的回收率在97.58％～100.57％之间，相对标准偏差为1.06％；杂质Ⅴ的回收率在92.35％～101.31％之间，相对标准偏差为3.08％；杂质Ⅵ的回收率在94.99％～99.87％之间，相对标准偏差为2.02％；证明本发明的检测方法回收率好，准确度高。
综上所述，本发明检测方法能够测定出托伐普坦Ⅰ产品中杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的含量，特别是解决了托伐普坦的位置异构体杂质之间及托伐普坦中间体的位置异构体杂质之间的分离测定问题，专属性强，简便、快速、精确，测定结果准确可靠，从而可以有效监控托伐普坦产品的质量，提高了药物的安全性。
Claims (10)
1.一种分离测定托伐普坦Ⅰ中杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的液相色谱方法，包括以下步骤：
(1)获得各杂质对照品的保留时间以及峰面积与浓度的对应关系：
a、分别取杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的对照品，加入溶剂溶解，作为对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行检测，检测条件为：
检测波长：230nm～280nm；
色谱柱：Symmetry shield RP18；
流动相：乙腈-含有0.2％磷酸的水溶液，其中，乙腈的体积分数为43-47％；
b、记录各杂质相应的保留时间、浓度和峰面积；
(2)检测待测样品：
c、取待测托伐普坦样品，加入溶剂溶解，作为供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行检测，以步骤a相同的检测条件检测；
d、根据步骤b的结果确定步骤c所得谱图中的各峰归属，记录供试品溶液中杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的峰面积，按外标法计算供试品中杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测波长为254nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述色谱柱的长度为150mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。
4.根据权利要求1-3任一一项所述的方法，其特征在于：所述流动相中乙腈的体积分数为45％。
5.根据权利要求1-3任一一项所述的方法：所述色谱条件的柱温为20-30℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述柱温为25℃。
7.根据权利要求1-3任一一项所述的方法，其特征在于：所述流动相的流速为1.0mL/min。
8.根据权利要求1-3任一一所述的方法，其特征在于：所述溶剂为甲醇。
9.根据权利要求1-3任一一所述的方法，其特征在于：所述对照品溶液的浓度为1.0-6.0μg/mL。
10.根据权利要求1-3任一一所述的方法，其特征在于：所述高效液相色谱检测的进样量为10μL。
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