CN102269741A

CN102269741A - 一种同时检测鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林残留的方法

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Publication number: CN102269741A
Application number: CN2011101751979A
Authority: CN
Inventors: 谢恺舟; 徐东; 贾龙飞; 郭辉生; 黄玉萍; 谢星; 张小杰; 孙瑛瑛; 陈学森; 戴国俊; 王金玉; 陈国宏
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2011-06-27
Filing date: 2011-06-27
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2031-06-27
Also published as: CN102269741B

Abstract

本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种同时检测鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林残留的方法。该方法是将鸡蛋样品经过提取、净化、衍生后，以0.01mol/L的乙腈-磷酸二氢钾溶液为流动相,采用5μm，250mm×4.6mm的C₁₈柱，在激发波长354nm、发射波长为445nm处用荧光检测器检测。本发明方法灵敏度高，样品杂质峰较少，对样品的净化要求较低。

Description

一种同时检测鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林残留的方法

技术领域

本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种同时检测鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林残留的方法。

背景技术

目前国内外关于测定阿莫西林和氨苄西林的研究已有不少文献报道，检测方法主要有毛细管电泳法、荧光检测法、紫外分光光度法、化学发光法、荷移光谱测定法、原子吸收分光光度法、微生物法、高效液相色谱法、液质联用法等。HPLC/UV法样品杂质峰较多，干扰较大，对样品的净化要求较高，而且紫外检测器的灵敏度较低。HPLC-MS法虽然灵敏度很高，但是其价格昂贵，很难在实际生产中普及。HPLC/FLD 法灵敏度高，样品杂质峰较少，对样品的净化要求较低。但到目前为止，鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林残留的高效液相色谱荧光检测方法的研究国内外尚未见报道。

发明内容

为了使待测组分峰与杂质峰完全分开，且均为基线分离峰，使检测限低于0.1个MRL_S, 使定量限低于0.2个MRL_S，本发明提供了一种高效液相色谱荧光检测法，能同时检测鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林的残留。

本发明所采用的技术方案是：一种同时检测鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林残留的方法，是将鸡蛋样品经过提取、净化、衍生后，以乙腈-磷酸二氢钾溶液(0.01 mol/L)为流动相, 采用C₁₈柱（5μm，250mm×4.6mm ），在激发波长354 nm、发射波长为445 nm处用荧光检测器检测。

HPLC检测条件：色谱柱为C₁₈,5μm，250mm×4.6mm；流动相为: A为0.01 mol·L^-1的磷酸二氢钾溶液，用2M盐酸调pH至5.5；B是色谱纯级乙腈溶液；荧光检测器，激发波长354 nm，发射波长445 nm；柱温：35~40℃；其梯度洗脱程序见表1:

表1梯度洗脱程序

序号	时间(min)	流速(mL·min^-1)	A液(%)	B液(%)	梯度曲线形状
						1	0	1.0	65	35	线性梯度曲线
2	10	1.0	65	35	线性梯度曲线
						3	11	1.0	40	60	线性梯度曲线
4	18	1.0	40	60	线性梯度曲线
						5	19	1.0	65	35	线性梯度曲线
6	22	1.0	65	35	线性梯度曲线

本发明中鸡蛋样品中阿莫西林和氨苄西林的提取、萃取和净化推荐使用乙腈提取，用二氯甲烷萃取净化。具体操作是：将鸡蛋制成匀浆后，加入乙腈溶液中混匀，离心，将上清液移出，再用经超纯水饱和的二氯甲烷萃取，离心，将上层水相转移至玻璃离心管中，向其分别加入三氯乙酸溶液、水杨醛，放入沸水浴中，衍生化反应后取出样品，冷却至室温，将样品转移到离心管中，经离心，过滤，得滤液，即可用于HPLC检测。

附图说明

图1是衍生试剂色谱图；

图2是鸡蛋空白对照样品色谱图；

图3 是AMO（20ng·mL^-1）和AMP（20ng·mL^-1）标准溶液色谱图（100μL进样）；

图4是AMO（25ng·g^-1）和AMP（25ng·g^-1）空白鸡蛋添加色谱图（200μL进样）；

图5是口服给药样品色谱图。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

本发明中所涉及到的溶液百分浓度，除特别说明外均为质量百分浓度。

1. 实验鸡的饲养、给药和样品采集

1.1 实验鸡选择及分组

选取28周龄京海黄鸡产蛋鸡120只，体重1.75±0.20kg，随机分成4组，分别为阿莫西林试验组、氨苄西林试验组、阿莫西林和氨苄西林混合试验组、空白对照组，每组30只产蛋鸡。产蛋鸡均单笼饲养，给药前分别称重、编号。试验前预饲1周，饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料，自由饮水。

给药剂量、途径及样品采集

将阿莫西林原粉和氨苄西林原粉用无菌超纯水配成50 mg·mL^-1、90 mg·mL^-1的水溶液，然后将药液分别用带有细乳胶管的注射器直接注入到鸡嗉囊中。各试验组产蛋鸡给药剂量见表2。

表2 各试验组产蛋鸡给药剂量

组别	阿莫西林（AMO）组	氨苄西林（AMP）组	混合组	对照组
					剂量（mg/kg.b.w）	25	60	AMO 25+AMP 60	0.0

试验组每天给药1次，给药时间均在上午8:00～9:00，连续5d，自给药日起至停药后20d内，于每天17:30～18:00收集各试验组鸡蛋，分别做好标记，记录各试验组每天的产蛋数，每组每天可采集13～16个鸡蛋，鸡蛋样品保存在低温蛋库中。

样品处理

提取、萃取、净化及衍生化步骤：

① 用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；

② 准确称取5.0-6.0 g鸡蛋匀浆样品，放于30-50mL具塞离心管中；

③ 加入20-25mL乙腈溶液置漩涡混合器上混匀；

④ 旋涡振荡混匀2-3min, 8000-10000×g离心10-15min，温度设置为10-15℃；

⑤ 上清液转移至另一50mL具塞离心管中；

⑥ 加入20-25mL用纯水饱和的二氯甲烷溶液置漩涡混合器上混匀（使药物溶于上层水相、乙腈溶于二氯甲烷溶液中）；

⑦ 旋涡振荡混匀2-3min, 6500-8000×g离心10-15min，温度设置为20-25℃；

⑧ 取1.0-1.5mL上层水相至10-15mL有刻度具塞的玻璃离心管中；

⑨ 向上述的玻璃离心管中分别加入200 μL25%的三氯乙酸溶液、25μL水杨醛（见图1），漩涡振荡混匀1-2min，将其放入沸水浴中，衍生反应持续60min；

⑩ 反应后取出样品，冷却至室温，将样品转移到2mL离心管中，分别用200-400μL 50%乙腈溶液洗涤10mL玻璃离心管1-2次，并合并到2mL离心管中，最后用50%乙腈溶液定容至2mL刻度；

⑪ 上机前以18000-20000×g离心15min，过0.22μm 滤膜，滤液供HPLC检测（见图2、图3、图5）。

回收率的测定准确称取5.0g匀浆后的空白鸡蛋匀浆液，置于50mL聚丙烯离心管中，同时添加低、中、高三种浓度的标准工作液，使得空白蛋液中同时分别含有阿莫西林5.0、25、125 ng·g^-1和氨苄西林5.0、25、125 ng·g^-1；每个添加量设6个平行，经上述样品的提取、净化和衍生化后，进样200μL作HPLC检测（见图4）。HPLC检测条件：色谱柱为C₁₈,5μm，250mm×4.6mm；流动相为: A为0.01 mol·L^-1的磷酸二氢钾溶液，用2M盐酸调pH至5.5；B是色谱纯级乙腈溶液；荧光检测器，激发波长354 nm，发射波长445 nm；柱温：35~40℃；梯度洗脱程序见表1。根据峰面积计算添加回收率。本发明方法提取鸡蛋中AMO和AMP的添加回收率及变异系数的结果见表3:

表3 鸡蛋中AMO和AMP的添加回收率及变异系数(n=6)

。

4、色谱方法

色谱柱:C18，5μm，250mm×4.6mm i.d；

流动相：A为0.01 mol·L^-1的磷酸二氢钾溶液，用2M盐酸调pH至5.5；B是色谱纯级乙腈溶液。

检测器：荧光检测器，激发波长354nm，发射波长445nm。

柱温：35~40℃

进样量：200μL

梯度洗脱程序：如表1所示。

5.定量方法

标准曲线的绘制用超纯水分别将阿莫西林、氨苄西林储备液稀释成质量浓度为5.0、25、50、100、200、400、800ng·mL^-1的系列标准工作液，进行HPLC色谱分析。每个浓度点重复测定3次，取平均值绘制浓度(C)-色谱峰面积(A)标准曲线。

检测限及定量限的确定

（1）向空白鸡蛋中加入定量的药物标准品混匀，配置成药物浓度在标准曲线末端并逐渐降低的一组样品，然后对每种浓度样品测定3～5次，以测定结果的精密度（RSD）达到≤20%和准确度（平均浓度偏离配置浓度）达到≤±20%时，样品中药物的最低浓度为定量限（LOQ）。

（2）测定时记录各浓度样品每次测定得到的药物信号强度S与噪音（或背景信号）强度N，然后取S和N的平均值，以能达到其平均值之比等于3时样品最低药浓为检测限（LOD）；平均值之比等于10（S/N=10）时样品最低药物浓度为定量限（LOD）。

6 .精密度的测定

日内精密度测定：将检测回收率剩余的样品按药物浓度高低分别混合成3份，得到量较多的含低、中、高3种药物浓度的样品。在同日内不同时间用同一条标准曲线及同一台HPLC 6次重复测定低、中、高3种药物浓度的样品，求得日内（批内）精密度。

日间精密度测定：将检测回收率剩余的样品按药物浓度高低分别混合成3份，得到量较多的含低、中、高3种药物浓度的样品。在一周内不同日用不同的标准曲线及同一台HPLC 6次重复测定低、中、高3种药物浓度的样品，求得日间（批间）精密度。

由于阿莫西林和氨苄西林药物没有专一的紫外发色基团，其最大吸收一般在200 nm～235 nm。在这段波长范围内，选择性一般都很差。当分析组织提取液中痕量阿莫西林和氨苄西林时，背景的干扰往往很严重。因此，用HPLC/UV法很难检测出阿莫西林和氨苄西林，同时HPLC/UV法的灵敏度低于HPLC/FLD法的灵敏度，故本发明选用荧光检测器检测鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林的残留。

关于鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林在鸡蛋中残留的HPLC-MS方法国内外尚未见报道，故此方法还有待进一步研究。

本发明采用荧光检测器检测（激发波长354nm，发射波长445nm），与紫外检测器检测(λ=229nm)相比，样品杂质峰少，干扰少，可将阿莫西林和氨苄西林与鸡蛋样品中其它组份完全分开，阿莫西林和氨苄西林保留时间分别为8.20和17.18min左右，色谱峰峰形较佳，且均为基线分离峰，空白鸡蛋样品提取液在上述保留时间无干扰峰出现，见图1-5。筛选出的高效液相色谱荧光检测 (HPLC/FLD)方法，阿莫西林和氨苄西林灵敏度高、检测限分别为1.2、0.4 ng·g^-1、定量限分别为3.9、1.5 ng·g^-1。阿莫西林和氨苄西林在5～800 ng·mL^-1范围内均呈良好的线性关系（r＝0.9997，r=0.9994），可满足鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林残留检测的要求。其结果见表4:

。

Claims

1.一种同时检测鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林残留的方法，是将鸡蛋样品经过提取、净化、衍生后，以0.01 mol/L的乙腈-磷酸二氢钾溶液为流动相, 采用5μm，250mm×4.6mm 的C₁₈柱，在激发波长354 nm、发射波长为445 nm处用荧光检测器检测。

2.根据权利要求1所述的同时检测鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林残留的方法，其特征在于，HPLC检测条件：色谱柱为C₁₈,5μm，250mm×4.6mm；流动相为: A液为0.01 mol·L^-1的磷酸二氢钾溶液，用2M盐酸调pH至5.5；B液是色谱纯级乙腈溶液；荧光检测器，激发波长354 nm，发射波长445 nm；柱温：35~40℃；其梯度洗脱程序如下：

序号时间(min) 流速(mL·min^-1) A液(%) B液(%)

1 0 1.0 65 35

2 10 1.0 65 35

3 11 1.0 40 60

4 18 1.0 40 60

5 19 1.0 65 35

6 22 1.0 65 35。

3.根据权利要求1所述的同时检测鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林残留的方法，其特征在于，所述的鸡蛋样品的提取、净化、衍生步骤是：将鸡蛋制成匀浆后，加入乙腈溶液中混匀，离心，将上清液移出，再用经超纯水饱和的二氯甲烷萃取，离心，将上层水相转移至玻璃离心管中，向其分别加入三氯乙酸溶液、水杨醛，放入沸水浴中，衍生化反应后取出样品。