CN104374835B - 一种二倍半萜内酯类化合物的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物的含量测定方法，该方法包括将待测样品提取后用高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为268nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为反相柱，流动相为水与极性有机溶剂的混合液，所述极性有机溶剂选自甲醇、乙腈、甲酸、三乙胺、乙酸中的一种或多种，所述反相柱的柱温为30℃，理论塔板数按式Ⅰ化合物峰计应不低于2000。本发明的测定方法具有线性关系好、精密度高、重现性好、回收率高等特点，是一种快速、简便、准确、可靠的方法。

Description

一种二倍半萜内酯类化合物的含量测定方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种二倍半萜内酯类化合物的含量测定方法。

背景技术

缬草为败酱科植物缬草(ValerianaoffcinalisL.)的根及根茎，具有解痉、止痛与镇静、安神的功效；对跌打损伤、心神不安、心悸失眠、痛经、经闭、风湿痹痛等症也能起到一定的治疗作用。缬草主要含环烯醚萜类、倍半萜类、生物碱类、木脂素类、黄酮类活性成分，是优良的天然药物资源。它广泛收载于各国药典，我国早期药典及地方药品标准也曾收载。

我们对缬草化学成分进行了深入研究，从缬草中提取分离出一种新的二倍半萜内酯类化合物，该化合物系首次从缬草中分离得到，它的化学结构如式Ⅰ所示。

研究表明，该化合物具有解痉作用，可用于消化道、呼吸道以及血管、泌尿、生殖等系统平滑肌痉挛所致疾病的治疗。因此有必要建立一种该化合物的含量测定方法，用于控制含有该化合物的药材或制剂的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种能准确地检测出结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物含量的方法。

一种结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物的含量测定方法，该方法包括将待测样品提取后用高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为268nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为反相柱，流动相为水与极性有机溶剂的混合液，所述极性有机溶剂选自甲醇、乙腈、甲酸、三乙胺、乙酸中的一种或多种，所述反相柱的柱温为30℃，理论塔板数按式Ⅰ化合物峰计应不低于2000。

所述极性有机溶剂为甲醇或乙腈，所述甲醇或乙腈与水的体积比为70-90∶10-30。

所述极性有机溶剂为三乙胺或乙酸与乙腈，所述三乙胺与乙腈与水的体积比或乙酸与乙腈与水的体积比为0.01-0.5∶70-90∶10-30。

所述极性有机溶剂为三乙胺或乙酸与甲醇，所述三乙胺与甲醇与水的体积比或乙酸与甲醇与水的体积比为0.01-0.5∶70-90∶10-30。

所述极性有机溶剂为甲醇与乙酸与三乙胺，所述水与甲醇与乙酸与三乙胺的体积比为10-30∶70-90∶0.1-0.5∶0.01-0.05。

优选地，所述色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

优选地，所述待测样品提取是将待测样品用二氯甲烷振摇提取，提取液水浴挥干后用甲醇溶解。

本发明提供的一种最佳的测定方法，其步骤如下：

⑴对照品溶液的制备：取结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含200μg的溶液，即得；

⑵供试品溶液的制备：取待测样品约3g，精密称定，加二氯甲烷30ml，充分振摇提取，过滤，残渣继续加二氯甲烷提取2次，每次30ml，合并滤液于70℃水浴挥干，残渣用甲醇分次溶解定容至10ml量瓶中，精密量取2ml，置5ml量瓶中，定容，摇匀，即得；

⑶色谱条件与系统适应性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；水与极性有机溶剂的混合液为流动相；检测波长268nm；柱温30℃；理论塔板数按结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物峰计应不低于2000；

⑷测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明的有益效果是：本发明的测定方法具有线性关系好、精密度和灵敏度高、重现性好、回收率高等特点，是一种快速、简便、准确、可靠的方法，能广泛用于测定药材或制剂中含有的结构如式Ⅰ所示的二倍半萜类化合物的含量。

附图说明

图1是对照品的高效液相图谱。

图2是乙腈:水＝70:30为流动相的高效液相图谱。

图3是甲醇:水＝75:25为流动相的高效液相图谱。

图4是乙腈:水:三乙胺＝75:25:0.25为流动相的高效液相图谱。

图5是乙腈:水:乙酸＝75:25:0.25为流动相的高效液相图谱。

图6是甲醇:水:三乙胺＝75:25:0.25为流动相的高效液相图谱。

图7是甲醇:水:乙酸＝75:25:0.25为流动相的高效液相图谱。

图8是甲醇:水:乙酸:三乙胺＝75:25:0.25:0.025为流动相的高效液相图谱。

图9是采用对照品制备的浓度与峰面积标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细地说明。

实施例1.检测流动相的选择

⑴色谱条件与系统适用性

仪器Agilent1260型高效液相色谱仪系列(美国安捷伦科技公司，包括四元泵、手动进样器、柱温箱、紫外检测器、M8301AA色谱工作站)

⑵对照品溶液的制备

取对照品18.5mg，加甲醇制成每1ml含185μg的溶液，即得。

⑶供试品溶液的制备

取缬草药材粉末0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过、取续滤液，即得。

⑷流动相的选择

采用以下7种流动相分别进行检测：

a.乙腈:水＝70:30(V/V)(图2)

b.甲醇:水＝75:25(V/V)(图3)

c.乙腈:水:三乙胺＝75:25:0.25(V/V)(图4)

d.乙腈:水:乙酸＝75:25:0.25(V/V)(图5)

e.甲醇:水:三乙胺＝75:25:0.25(V/V)(图6)

f.甲醇:水:乙酸＝75:25:0.25(V/V)(图7)

g.甲醇:水:乙酸:三乙胺＝75:25:0.25:0.025(V/V)(图8)

取对照品溶液20ul注入高效液相色谱仪，采用流动相a进行分析(图1)。

取供试品溶液各20ul注入高效液相色谱仪，分别采用流动相：a、b、c、d、e、f、g进行对比分析，结果见图2-8。结果表明：f和g流动相的分离效果优于其它各组，杂质干扰少，检测灵敏度高，g流动相的分离效果最好，检测灵敏度最高。

实施例2.含量测定的方法学研究

(1)测定条件

仪器：美国Waters公司208型高效液相色谱分析仪。510泵，UOK进样阀，991PDA检测器，991专用色谱工作站，SpherisobC18200×4.0mml，10ul色谱柱。

经高效液相色谱分析，在含量测定条件下没有任何杂质峰出现。

(2)供试品溶液制备方法的考察

提取溶剂取供试品约3.0g，共3份，精密称定，分别以(1)二氯甲烷(2)三氯甲烷(3)乙酸乙酯，各30ml，振摇提取三次，合并滤液于70℃水浴挥干，残渣用甲醇分次定容至10ml量瓶中，精密量取2ml，置5ml量瓶中，定容。各取20ul注入液相色谱仪测定，记录峰面积，即：

结果表明，二氯甲烷提取率较高，同时考察到三氯甲烷有较大毒性，故选择二氯甲烷作为提取溶剂。

溶剂用量取供试品约3.0g，共3份，精密称定，分别以二氯甲烷(1)30ml(2)60ml(3)90ml，振摇提取三次，合并滤液于70℃水浴挥干，残渣用甲醇分次定容至10ml量瓶中，精密量取2ml，置5ml量瓶中定容，各取20ul注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，即：

结果表明，用二氯甲烷30ml提取即可获得较高提取率，故选择二氯甲烷用量为30ml。

提取次数取供试品约3.0g，共3份，精密称定，分别用30ml二氯甲烷振摇提取(1)2次(2)3次(3)4次，合并滤液，于70℃水浴挥干，残渣用甲醇分次定容至10ml量瓶中，精密量取2ml，置5ml量瓶中定容，各取20ul注入液相色谱仪测定，记录峰面积，即：

结果表明，二氯甲烷提取3次即可提取完全，故选用提取次数为3次。

⑶系统适应性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-1％乙酸溶液(75:25)为流动相，检测波长268nm；柱温30℃，理论板数按缬草萜内酯A峰计应不低于2000。在该系统条件下各成分分离良好，灵敏度高，检测限为2nm。

⑷标准曲线的绘制

取结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，再用甲醇将上述溶液分别稀释成10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml作为对照品溶液。分别吸取20ul，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，量取峰面积，为方便计算，以化合物的峰面积为纵坐标(Y)，化合物的浓度为横坐标(X)进行线性回归，即：

实验号	化合物浓度(ug/ml)	峰面积
			1	10	0.001033
2	50	0.005188
			3	100	0.010391
4	150	0.015514
			5	200	0.020655

得回归方程：Y＝0.00010X+0.00001相关系数R²＝0.9999

绘制标准曲线(如图9所示)，结果表明浓度在10-200ug/ml范围内时，浓度与峰面积呈良好的线性关系，并通过原点。

⑸供试品测定取供试品约3.0g，精密称定，加二氯甲烷30ml，充分振摇提取，过滤。残渣继续加二氯甲烷提取2次，每次30ml。合并滤液于70℃水浴挥干，残渣用甲醇分次溶解定容至10ml量瓶中，精密量取2ml，置5ml量瓶中，定容，摇匀，即得。分别取对照品溶液和供试品溶液各20ul注入高效液相色谱仪，计算含量为1.48mg/g。

⑹重现性试验

取供试品约3.0g，精密称定，加二氯甲烷30ml，充分振摇提取，过滤。残渣继续加二氯甲烷提取二次，每次30ml。合并滤液于70℃水浴挥干，残渣用甲醇分次溶解定容至10ml量瓶中，精密量取2ml，置5ml量瓶中，定容，摇匀，即得。各取20ul，重复进样6次，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，即：

结果表明：相对偏差为0.74％，说明本方法测定结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物含量的重现性较好。

⑺精密度试验

取供试品约3.0g，精密称定，加二氯甲烷30ml，充分振摇提取，过滤。残渣继续加二氯甲烷提取二次，每次30ml。合并滤液于70℃水浴挥干，残渣用甲醇分次溶解定容至10ml量瓶中，精密量取2ml，置5ml量瓶中，定容，摇匀，即得。

另取对照品(170ug/ml)，以上对照品溶液及供试品溶液各取20ul，注入高效液相色谱仪中，连续进样8次，量取峰面积，计算结果：

实验号	对照品峰面积	供试品峰面积
			1	0.017553	0.017768
2	0.017632	0.017864
			3	0.017574	0.018024
4	0.017691	0.017570
			5	0.017412	0.017546
6	0.017714	0.0176556
			7	0.017572	0.017798
8	0.017386	0.017797
			平均峰面积	0.017567	0.017753
δn	0.000111	0.000148
			RSD％	0.67％	0.89％

结果表明：本方法测定结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物含量的精密度良好。

⑻稳定性试验

取供试品约3.0g，精密称定，加二氯甲烷30ml，充分振摇提取，过滤。残渣继续加二氯甲烷提取二次，每次30ml。合并滤液于70℃水浴挥干，残渣用甲醇分次溶解定容至10ml量瓶中，精密量取2ml，置5ml量瓶中，定容，摇匀，即得。分别于0，60，120，180，240，300min取样20ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定化合物在溶剂中的稳定性，即：

结果表明：化合物溶液，在6小时内测定其含量，RSD＝0.78％，说明其在6小时内是稳定的。

⑼回收率试验

取已知含量的制剂供试品(含量为：1.48mg/g)混匀，取6份，每份约1.0g，精密称定，分别加入对照品0.48mg、0.96mg、1.44mg、1.92mg、2.40mg，分别加入二氯甲烷30ml，充分振摇提取，过滤。残渣继续加二氯甲烷提取二次，每次30ml。合并滤液于70℃水浴挥干，残渣用甲醇分次溶解定容至10ml量瓶中，精密量取2ml，置5ml量瓶中，定容，摇匀，即得。各取20ul注入高效液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积，计算回收率，即：

以上试验结果表明：用高效液相色谱法测定本制剂中的结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物的含量，具有线性关系好、精密度高、重现性好、回收率高等特点，是一种快速、简便、准确、可靠的方法。

实施例3.缬草制剂的含量测定

⑴对照品溶液的制备：取结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含200μg的溶液，即得。

⑵供试品溶液的制备：取缬草制剂内容物约3.0g，精密称定，加二氯甲烷30ml，充分振摇提取，过滤。残渣继续加二氯甲烷提取2次，每次30ml。合并滤液于70℃水浴挥干，残渣用甲醇分次溶解定容至10ml量瓶中，精密量取2ml，置5ml量瓶中，定容，摇匀，即得。

⑶色谱条件与系统适应性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇:水:乙酸:三乙胺＝75:25:0.25:0.025为流动相；检测波长268nm；柱温30℃。理论塔板数按结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物峰计应不低于2000。

⑷测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得。

采用以上方法进行检测，本制剂每粒中含结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物不得少于0.38mg。

Claims (3)

1.一种结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物的含量测定方法，该方法包括将待测样品提取后用高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为268nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相柱，流动相为水与极性有机溶剂的混合液，所述极性有机溶剂选自甲醇、乙腈、甲酸、三乙胺、乙酸中的一种或多种，所述反相柱的柱温为30℃，理论塔板数按式Ⅰ化合物峰计应不低于2000，

所述极性有机溶剂为甲醇或乙腈，所述甲醇或乙腈与水的体积比为70-90∶10-30，或

所述极性有机溶剂为三乙胺或乙酸与乙腈，所述三乙胺或乙酸与乙腈与水的体积比为0.01-0.5∶70-90∶10-30，或

所述极性有机溶剂为三乙胺或乙酸与甲醇，所述三乙胺或乙酸与甲醇与水的体积比为0.01-0.5∶70-90∶10-30，或

所述极性有机溶剂为甲醇与乙酸与三乙胺，所述水与甲醇与乙酸与三乙胺的体积比为10-30∶70-90∶0.1-0.5∶0.01-0.05。

2.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于：所述待测样品提取是将待测样品用二氯甲烷振摇提取，提取液水浴挥干后用甲醇溶解。

3.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于包括以下步骤：

⑴对照品溶液的制备：取结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含200μg的溶液，即得；

⑵供试品溶液的制备：取待测样品3g，精密称定，加二氯甲烷30ml，充分振摇提取，过滤，残渣继续加二氯甲烷提取2次，每次30ml，合并滤液于70℃水浴挥干，残渣用甲醇分次溶解定容至10ml量瓶中，精密量取2ml，置5ml量瓶中，定容，摇匀，即得；

⑶色谱条件与系统适应性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；水与极性有机溶剂的混合液为流动相；检测波长268nm；柱温30℃；理论塔板数按结构如式Ⅰ所示的二倍半萜内酯类化合物峰计应不低于2000；

⑷测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得。