CN102680593B - 一种行气活血、化瘀通脉的药物组合物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了乐脉颗粒的质量检测方法。该质量检测方法简便、易行、重复性好，且同时以多个成分为检测目标，更利于对乐脉颗粒质量的控制，有助于提高该药物临床使用的安全性和稳定性。

Description

一种行气活血、化瘀通脉的药物组合物的检测方法

技术领域

本发明涉及一种行气活血、化瘀通脉的药物组合物的检测方法 ，属于药物领域。 

背景技术

乐脉颗粒，是由丹参、川芎、红花、赤芍、香附、木香、山楂七味药按8∶4∶4∶4∶2∶2∶1的比例精制而成，功能行气活血、化瘀通脉，临床上常用于气滞血瘀证所致的头痛、眩晕、胸痛、心悸；冠心病心绞痛、多发性脑梗塞见上述证候者。为《中华人民共和国药典》(一部)》收载品种，国家医保目录(2009年)乙类品种，山西省新型农村合作医疗基本用药目录品种，为四川川大华西药业股份有限公司独家生产。 

关于乐脉颗粒的质量标准的报道较多。其中，2010版《中华人民共和国药典(一部)》定性检测了乐脉颗粒中的丹参酮IIA，定量检测了芍药苷。陈恒冲等在《RP-HPLC同时测定乐脉颗粒中阿魏酸和丹酚酸B的含量》一文中定量检测了阿魏酸、丹酚酸B。马彬峡等在《RP-HPLC法同时测定乐脉颗粒中丹参素、原儿茶醛、芍药苷和阿魏酸的含量》一文中检测了丹参素、原儿茶醛、芍药苷和阿魏酸的含量。孟珺等在《HPLC法测定乐脉颗粒中羟基红花黄色素A的含量》一文中检测了羟基红花黄色素A。方鲁严等在《RP-HPLC法测定乐脉颗粒中去氢木香内酯的含量》一文中检测了去氢木香内酯。 

然而，乐脉颗粒是一个7味药组成的大复方，如果能够尽量多地控制已知成分的含量，展现其特征性图谱，对于保证乐脉颗粒的质量大有裨益。目前，还未见同时以丹参中丹酚酸B、川芎中阿魏酸、赤芍中芍药苷、木香中的木香烃内酯和去氢木香内酯这5种成分进行质量检测的相关报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种行气活血、化瘀通脉的药物组合物的检测方法 。 

本发明提供了一种行气活血、化瘀通脉的药物组合物的检测方法 ，该药物组合物是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：丹参5.6-10.4份、川芎2.8-5.2份、红花2.8-5.2份、赤芍2.8-5.2份、木香1.4-2.6份、香附1.4-2.6份、山楂0.7-1.3份； 

该方法是采用HPLC指纹图谱进行检测，其操作步骤如下： 

a、取上述制剂，加甲醇或乙醇提取后，制备供试品溶液； 

b、取丹酚酸B，阿魏酸，芍药苷、木香烃内酯、去氢木香内酯，制备参 照物溶液； 

c、分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，以乙腈-磷酸水溶液为流动相进行洗脱，在紫外下进行检测，其液相条件如下： 

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测波长为230-240nm，流动相为乙腈-0.4％磷酸，进行梯度洗脱，洗脱条件为： 

进一步地，检测波长为235nm。 

进一步地，检测温度为25℃；色谱柱为LP-C₁₈，4.6×250mm，5μm。 

进一步地，步骤(2)中，以甲醇为溶剂制备参照物溶液。 

进一步地，所述药物组合物是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂： 

丹参8份、川芎4份、红花4份、赤芍4份、木香2份、香附2份、山楂1份。 

更进一步地，步骤(1)中制备供试品溶液的具体操作步骤如下： 

精密称取所述制剂，加甲醇，超声提取20-40min后，滤过，滤液即为供试品溶液，该溶液1ml中含有0.04g原制剂。 

其中，所述HPLC指纹图谱中，各参照物特征峰分别为：芍药苷保留时间为35±1min，阿魏酸保留时间为43±1min，丹酚酸B保留时间为74±1min，木香烃内酯保留时间为114±2min，去氢木香内酯保留时间为116±2min。 

进一步优选地，所述HPLC指纹图谱如图2所示。 

其中，所述药物组合物中，丹酚酸B的含量不少于4mg/g，阿魏酸含量不少于0.1mg/g，芍药苷含量不少于5mg/g，木香烃内酯含量不少于0.1mg/g，去氢木香内酯含量不少于0.1mg/g。 

进一步地，所述药物组合物中，丹酚酸B的含量为5-10mg/g，阿魏酸含量为0.1-0.2mg/g，芍药苷含量为7.5-13.5mg/g，木香烃内酯含量为0.1-0.2mg/g，去氢木香内酯含量为0.1-0.2mg/g。 

更进一步地，所述药物组合物中，丹酚酸B的含量为7.5-8.5mg/g，阿魏酸含量为0.15-0.20mg/g，芍药苷含量为10-11mg/g，木香烃内酯含量为 0.12-0.16mg/g，去氢木香内酯含量为0.16-0.20mg/g。 

本发明质量检测方法中，通过对不同流动相条件下色谱峰的分离度、分离时间、基线、分离得到的峰数量以及峰形的考察，最终得出了本发明最佳的流动相系统以及梯度洗脱条件，在该条件下，能够分离出较多的特征峰，基线平稳，分离度、峰形良好，并且，该方法具有良好的重复性、稳定性，能够更为准确地检测出乐脉颗粒中多种成分的含量，适用于对乐脉颗粒质量的控制。 

附图说明

图1参照物HPLC色谱图，其中，S1芍药苷；S2阿魏酸；S3丹酚酸B；S4木香烃内酯；S5去氢木香内酯； 

图2：乐脉颗粒的HPLC色谱图； 

图3：表2所述流动相下的HPLC色谱图； 

图4：表3所述流动相下的HPLC色谱图； 

图5：表4所述流动相下的HPLC色谱图。 

具体实施方式

实施例1  乐脉颗粒的质量检测 

(1)供试品溶液的制备： 

精密称取乐脉颗粒1g于25mL容量瓶中，加甲醇定容，密闭，超声处理30min，滤过，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液； 

(2)参照物溶液的制备： 

丹酚酸B对照品：称取丹酚酸B对照品(批号：D-012-110812，成都瑞芬思生物科技有限公司)适量，加甲醇(色谱纯)，超声、定容，配制成1mg/mL的浓度，过0.22μm微孔滤膜，即得。 

阿魏酸对照品：称取阿魏酸对照品(批号：110773-201012，中国药品生物制品鉴定所)适量，加甲醇(色谱纯)，超声、定容，配制成500μg/mL的浓度，过0.22μm微孔滤膜，即得。 

芍药苷对照品：称取芍药苷对照品(批号：0736-200934，中国药品生物制品鉴定所)适量，加甲醇(色谱纯)，超声、定容，配制成1mg/mL的浓度，过0.22μm微孔滤膜，即得。 

去氢木香内酯对照品：称取去氢木香内酯对照品(批号：11525-201008，中国食品药品检定研究院)适量，加甲醇(色谱纯)，超声、定容，配制成198μg/mL的浓度，过0.22μm微孔滤膜，即得。 

木香烃内酯对照品：称取木香烃内酯对照品对照品(批号：11524-201107，中国食品药品检定研究院)适量，加甲醇(色谱纯)，超声、定容，配制成218μg/mL的浓度，过0.22μm微孔滤膜，即得。 

混合对照品的配制：分别加入芍药苷对照品溶液12mL，阿魏酸对照品溶液0.4mL，丹酚酸B对照品溶液10mL，去氢木香内酯对照品溶液1mL，木香烃内酯对照品溶液0.8mL于25mL棕色容量瓶中，甲醇定容，过0.22μm微孔滤膜，即得。 

(3)乐脉颗粒的质量检测 

色谱柱：LP-C₁₈(4.6*250mm，5μm，Global Chromatography Co.，Ltd.)； 

分析仪器：高效液相色谱仪(Agilent Technologies 1200series)； 

流动相：乙腈-0.4％磷酸梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1； 

检测波长：235nm； 

柱温：25℃； 

流速：0.8mL/min； 

表1 

取供试品溶液进样5μL，按上述条件进行洗脱，乐脉颗粒的指纹图谱参见图2。 

实施例2  本发明质量检测方法的方法学考察 

本实施例中若未提供供试品溶液、参照物溶液的制备方法，则所述溶液是按照实施例1制备。 

1、检测波长的考察 

分别选择235、250、280、320nm为检测波长，同时打开四个检测通道，取供试品进样，观察峰的数目与高低，发现在235nm左右峰的数目最多，峰高适宜，故选择235nm为检测波长。 

2、流动相的选择 

在235nm下，分别考察了4种流动相对乐脉颗粒中有效成分的洗脱效果。 

(1)乙腈-0.4％磷酸梯度洗脱，柱温25℃。 

表2 

色谱图参见图3。 

(2)0.2％甲酸与乙腈梯度洗脱 

表3 

色谱图参见图4。 

(3)色谱条件：0.2％磷酸与乙腈梯度洗脱 

表4 

色谱图参见图5。 

(4)色谱条件：0.4％磷酸与乙腈梯度洗脱 

表5 

色谱图参见图2。 

通过上述实验发现，甲酸会引起基线严重下飘，影响含量测定的准确性与图谱的美观性；磷酸含量为0.2％时分离度与峰形不好，有拖尾，多处未分开。而表2中流动相分离的特征峰数量少，不能较好地检测乐脉颗粒中的各有效成分。当使用表5流动相洗脱时，出峰数量多，各峰分离较好，基线平稳，分析时间适中，因此本发明中选择表5所述的流动相。 

3、参照物精密度考察 

取混合参照物溶液4μL，连续进6针，计算各成分的变异系数。精密度数据如下： 

表6 

由上表可知，各对照品的RSD％均小于2％，说明仪器的精密度良好。 

4、线性范围考察 

精密称取芍药苷对照品10.60mg和丹酚酸B对照品7.65mg于25mL棕色容量瓶中，加入阿魏酸(500μg/mL)和木香烃内酯(218μg/mL)各1mL，去氢木香烃内酯(198μg/mL)2mL，甲醇定容到25mL，超声溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，分别进2、4、6、8、10μL，计算峰面积与进样量的关系，数据如下： 

(1)芍药苷的标准曲线 

表7 

芍药苷的标准曲线为y＝1.379x+93.30，R²＝0.999，在进样量0.848-4.240μg范围内线性关系良好。 

(2)阿魏酸的标准曲线 

表8 

阿魏酸的标准曲线为y＝2.764x+20.02，R²＝0.999，在进样量0.04-0.20μg范围内线性关系良好。 

(3)丹酚酸B的标准曲线 

表9 

丹酚酸B的标准曲线为y＝1204.x+137.5，R²＝0.999，在进样量0.6048-3.024μg范围内线性关系良好。 

(4)去氢木香内酯的标准曲线 

表10 

去氢木香内酯的标准曲线为y＝1673.x-3.427，R²＝0.999，在进样量0.01744-0.0872μg范围内线性关系良好。 

(5)木香烃内酯的标准曲线 

表11 

去氢木香内酯的标准曲线为y＝1673.x-3.427，R²＝0.999，在进样量0.01744-0.0872μg范围内线性关系良好。 

5、重复性考察 

精密称取乐脉颗粒1g于25mL容量瓶中，加入甲醇定容，超声溶解，过0.22μm微孔滤膜，每次进5μL，连续进6针，计算样品中5成分的峰面积变异系数。重复性数据如下： 

表12 

由上表可知，供试品中5待测成分峰面积的RSD％均小于2％，说明该方法重复性良好。 

6、稳定性考察 

精密称取乐脉颗粒1g于25mL容量瓶中，加入甲醇定容，超声溶解，过0.22μm微孔滤膜，每次进5μL，分别于第0、6、12、18、24h进样，计算样品中5成分的峰面积变异系数，稳定性数据如下： 

表13 

由上表可知，供试品在24h内基本稳定，稳定性良好。 

7、加样回收考察 

精密称取乐脉颗粒约0.5g共六份，分别加入芍药苷(1mg/mL)5mL，阿魏 酸(500μg/mL)0.16mL，丹酚酸(1mg/mL)4mL，去氧木香内脂(198μg/mL)0.35mL，木香烃内脂(218μg/mL)0.4mL，超声后甲醇定容到25mL，0.22μm微孔滤膜过滤，5μL进样，计算加样回收率。 

(1)芍药苷的加样回收结果 

表14 

(2)阿魏酸的加样回收结果 

表15 

(3)丹酚酸B的加样回收结果 

表16 

(4)木香烃内酯的加样回收结果 

表17 

(5)去氢木香内酯的加样回收结果 

表18 

试验结果表明，上述5种对照品的回收率在95％-105％之间，加样回收良好，方法准确。 

8、含量测定 

精密称取乐脉颗粒1g，平行称取三份，于25mL容量瓶中，加入甲醇定容，超声溶解，过0.22μm微孔滤膜，进样量为5μL，将测定峰面积带入标准曲线中计算出样品中上述5种成分的含量。测定结果如下： 

表19 

综上，考虑到药材的产地、加工、储藏以及制剂工艺波动的影响，将5种成分的含量限度规定为乐脉颗粒中丹酚酸B的含量不少于4mg/g，阿魏酸含量不少于0.1mg/g，芍药苷含量不少于5mg/g，木香烃内酯含量不少于0.1mg/g，去氢木香内酯含量不少于0.1mg/g。 

本发明质量检测方法中，通过对不同流动相条件下色谱峰的分离度、分离时间、基线、分离得到的峰数量以及峰形的考察，最终得出了本发明最佳的流动相系统以及梯度洗脱条件，在该条件下，能够分离出较多的特征峰，基线平稳，分离度、峰形良好，并且，该方法具有良好的重复性、稳定性，能够更为准确地检测出乐脉颗粒中多种成分的含量，适用于对乐脉颗粒质量的控制。 

综上所述，本发明质量检测方法简便、易行、重复性好，且同时以多个成分为检测目标，更利于对乐脉颗粒质量的控制，有助于提高该药物临床使用的安全性和稳定性。 

Claims (1)

1.一种行气活血、化瘀通脉的药物组合物的检测方法，其特征在于：该药物组合物是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：丹参5.6-10.4份、川芎2.8-5.2份、红花2.8-5.2份、赤芍2.8-5.2份、木香1.4-2.6份、香附1.4-2.6份、山楂0.7-1.3份；

该方法是采用HPLC指纹图谱进行检测，其操作步骤如下：

a、取上述制剂，加甲醇或乙醇提取后，制备供试品溶液；

b、取丹酚酸B，阿魏酸，芍药苷、木香烃内酯、去氢木香内酯，制备参照物溶液；

c、分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，以乙腈-磷酸水溶液为流动相进行洗脱，在紫外下进行检测，其液相条件如下：

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测波长为230-240nm，流动相为乙腈-0.4%磷酸，进行梯度洗脱，洗脱条件为：

时间/min 乙腈/% 0.4%磷酸水/% 0 10 90 15 10 90 15~35 10~18 90~82 35~45 18 82 45~65 18~25 82~75 65~75 25~30 75~70 75~110 30~60 70~40 110~120 60 40 120~150 60~10 40~90

。

2、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：检测波长为235nm。

3、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：检测温度为25℃；色谱柱为LP-C₁₈，4.6×250mm，5μm。

4、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤b中，以甲醇为溶剂制备参照物溶液。

5、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述药物组合物是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

丹参8份、川芎4份、红花4份、赤芍4份、木香2份、香附2份、山楂1份。

6、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a中制备供试品溶液的具体操作步骤如下：

精密称取所述制剂，加甲醇，超声提取20-40min后，滤过，滤液即为供试品溶液，该溶液1ml中含有0.04g原制剂。

7、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述HPLC指纹图谱中，各参照物特征峰分别为：芍药苷保留时间为35±1min，阿魏酸保留时间为43±1min，丹酚酸B保留时间为74±1min，木香烃内酯保留时间为114±2min，去氢木香内酯保留时间为116±2min。

8、根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述HPLC指纹图谱如图2所示。

9、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述药物组合物中，丹酚酸B的含量不少于4mg/g，阿魏酸含量不少于0.1mg/g，芍药苷含量不少于5mg/g，木香烃内酯含量不少于0.1mg/g，去氢木香内酯含量不少于0.1mg/g。

10、根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述药物组合物中，丹酚酸B的含量为5-10mg/g，阿魏酸含量为0.1-0.2mg/g，芍药苷含量为7.5-13.5mg/g，木香烃内酯含量为0.1-0.2mg/g，去氢木香内酯含量为0.1-0.2mg/g。

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