CN103424476B - 同时测定丹参多酚酸中4种水溶性成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种HPLC法同时测定丹参多酚酸中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B含量的方法，采用C18色谱柱，二元梯度洗脱，检测波长280nm，柱温30℃，流速为1mL·min‑1。其中两个流动相采用比例相同的磷酸。

Description

同时测定丹参多酚酸中4种水溶性成分的方法
技术领域
本发明涉及一种中药领域的分析方法，特别涉及一种同时测定丹参多酚酸中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B含量的方法。
背景技术
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge）的干燥根及根茎，属于活血化瘀药中的活血调经药，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的传统功效。丹参化学成分主要包括水溶性成分和脂溶性成分，主要的水溶性成分是酚酸类成分，包括丹参素、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸等。实验证明，丹参水溶性成分具有改善血液循环、减少脑梗死面积、抑制肾素血管紧张素系统、清除自由基、保护缺血脑组织神经元等多种药理作用。
注射用丹参多酚酸（冻干）就是以丹参中提取的水溶性有效部位丹参多酚酸为活性成分制成的冻干粉针剂，具有活血通络功能，用于治疗轻中度脑梗死引起的半身不遂，口舌歪斜，舌强言謇，偏身麻木等症状。
为检测丹参多酚酸中水溶性有效成分，本发明经过反复研究，最终得出一种采用高效液相色谱方法，可以对丹参多酚酸中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B中的1~4种同时进行含量测定，该方法对丹参多酚酸的质量控制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于建立一种能够同时检测丹参多酚酸中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B含量的方法。
具体来说，本发明为采用HPLC法，采用C18色谱柱，二元梯度洗脱，同时测定任意1~4种上述化合物，即丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量。
其中所述二元梯度洗脱为磷酸水-磷酸乙腈水体系。
为了保证丹参多酚酸中酚酸类物质的酚羟基和羧基的电离被有效抑制，而不会受到流动相梯度变化的影响，所以在两个流动相中均加入相同比例的磷酸，均为0.02%。
具体来说，所述的流动相梯度洗脱条件为：
本发明所述的测定方法，其中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的混合对照品在200-400nm范围内扫描，四种物质在280nm处均有较强吸收，灵敏度高，重复性好，因此选择280nm作为检测波长，柱温30℃，流动相流速为1mL·min-1。
本发明所述的检测方法，包括以下步骤：
步骤1：丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品混合溶液的制备；
步骤2：丹参多酚酸或其相关产品供试品溶液的制备；
步骤3：将对照品混合溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
步骤4：根据色谱图计算供试品溶液中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量。
其中所述：
步骤1：对照品溶液的制备，是制备一种混合溶液，该混合溶液中含有一定浓度的丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B四种对照品，所述对照品是纯度极高的用于做对比实验用的产品，这些产品均属于现有技术，可以从市场上购买得到，本发明对照品溶液的制备方法可以采用以下方法：
分别称取丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品，混合后加醇溶解得到混合对照品溶液。如采用以下方法：称取丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品，混合后加入甲醇溶解，得丹酚酸D质量浓度为21.10ug·mL-1、迷迭香酸质量浓度为39.4ug·mL-1、紫草酸质量浓度为41.4ug·mL-1、丹酚酸B质量浓度为539.00ug·mL-1。
步骤2：供试品溶液的制备，是制备丹参多酚酸或其相关产品的溶液，所述丹参多酚酸或其相关产品是指以丹参多酚酸作为活性成分的产品，如含有丹参多酚酸的药品、保健品等，具体如注射用丹参多酚酸制剂。
本发明所述丹参多酚酸或其相关产品的供试品溶液制备方法为：称取丹参多酚酸或其相关产品，用醇溶解得到溶液，如果有不溶解的物质，过滤除去。
所述溶液优选甲醇溶液，如称取丹参多酚酸或其相关产品加入甲醇使溶解，得到丹参多酚酸或其相关产品的甲醇溶液，溶液浓度可以是10-20mg丹参多酚酸用甲醇溶解并定容到20-30ml，优选25ml中含有丹参多酚酸15mg。如果是含有丹参多酚酸的相关产品，其称量时可以按照丹参多酚酸的含量来确定称量量，使溶液中含有丹参多酚酸的量为10-20mg。
步骤4：根据色谱图计算供试品溶液中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量。
所述计算是采用色谱图中的峰面积作为含量指标，通过标准曲线法计算待测样品中各成分的含量，该计算方法属于现有技术。
本发明在于，通过筛选获得良好的色谱条件，将性质相似的丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B四种成分通过一次实验即可测得其含量，极大的方便了产品的检测。
本发明所述的测定方法，是通过筛选并经过验证获得的，实验内容如下：
1.仪器和材料
Waters 2695型高效液相色谱单元，配Waters 2489型紫外检测器（美国WATERS公司）；XS 105型十万分之一电子分析天平（瑞士METTLER公司）。
6批丹参多酚酸（天津天士力之骄药业有限公司提供）；丹酚酸D对照品（天津一方科技有限公司，纯度大于98%，批号：11031610）；迷迭香酸对照品（中国药品生物制品检定所，纯度大于98.8%，批号：111871-201001）；紫草酸对照品（天津一方科技有限公司，纯度大于98%，批号：10092603）；丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院，纯度大于98%，批号：111562-201110）；甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；超纯水。
2.实验方法
2.1色谱条件
色谱柱：Venusil XBP C18柱（4.6mm×250mm,5um）；流动相：0.02%磷酸水-0.02%磷酸80%乙腈水梯度洗脱（梯度洗脱程序见下表1）；流速：1mL·min-1；检测波长280nm；柱温30℃；进样量20ul；外标法。在本色谱条件下，丹参多酚酸中的丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的色谱峰与其他组分峰均得到较好的分离。结果见图1。
表1梯度洗脱程序
2.2供试品溶液的制备
取注射用丹参多酚酸15mg，精密称定，加甲醇溶解并定容到25ml，摇匀，即得。
2.3混合对照品储备液的制备
分别精密称取丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品适量，加甲醇制成混合对照品溶液，得丹酚酸D质量浓度为21.10ug·mL-1、迷迭香酸质量浓度为39.4ug·mL-1、紫草酸质量浓度为41.4ug·mL-1、丹酚酸B质量浓度为539.00ug·mL-1的混合对照品溶液。
3.方法学研究
3.1线性关系的考察
分别精密量取混合对照品溶液1、2、4、6、8、10ml置10ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，得到系列标准溶液。分别进样20ul，记录峰面积A，以峰面积A对质量浓度C（ug·mL-1）进行线性回归，绘制标准曲线，得到各成分的回归方程及线性范围见表2，结果表明这四种成分在表2所示范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表2各成分的回归方程及线性范围
3.2精密度实验
精密吸取供试品溶液按上述色谱条件连续进样6次，进样量20ul，测定丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的峰面积。测得丹酚酸D峰面积的RSD1.34%；迷迭香酸峰面积的RSD0.39%；紫草酸峰面积的RSD0.68%；丹酚酸B峰面积的RSD0.42%。结果表明仪器的精密度良好。
3.3稳定性实验
取新配制的供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，12h，按上述色谱条件进行色谱分析。测得丹酚酸D峰面积的RSD2.03%；迷迭香酸峰面积的RSD0.66%；紫草酸峰面积的RSD1.07%；丹酚酸B峰面积的RSD2.25%。结果表明样品在12h内稳定性良好。
3.4重复性实验
分别精密称取样品6份，分别按给定供试品制备方法和色谱条件进行测定，记录峰面积，分别计算各测定成分含量。测得丹酚酸D含量的RSD1.51%；迷迭香酸含量的RSD1.12%；紫草酸含量的RSD1.89%；丹酚酸B含量的RSD2.25%。
3.5加样回收率实验
精密称取6份已知含量的丹参多酚酸，每份5mg，分别精密加入4种对照品溶液适量，然后用甲醇定容至25ml，在上述色谱条件下进行测定，计算回收率和RSD值。结果丹酚酸D的平均回收率为1.00，RSD为1.52%；迷迭香酸的平均回收率为1.01，RSD为1.83%；紫草酸的平均回收率为1.02，RSD为1.53%；丹酚酸B的平均回收率为1.05，RSD为2.00%。
用本发明的方法测得的丹参多酚酸样品中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量都比较稳定，说明相关工艺已经很成熟。本文采用HPLC法同时测定丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量，方法简便易行，适用于控制和评价丹参多酚酸的质量。
附图说明
图1对照品与丹参多酚酸样品HPLC色谱图（1.丹酚酸D；2.迷迭香酸；3.紫草酸；4.丹酚酸B）
图2 6批丹参多酚酸HPLC叠加图
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1
1.仪器和材料
Waters 2695型高效液相色谱单元，配Waters 2489型紫外检测器（美国WATERS公司）；XS 105型十万分之一电子分析天平（瑞士METTLER公司）。
6批丹参多酚酸（天津天士力之骄药业有限公司提供）；丹酚酸D对照品（天津一方科技有限公司，纯度大于98%，批号：11031610）；迷迭香酸对照品（中国药品生物制品检定所，纯度大于98.8%，批号：111871-201001）；紫草酸对照品（天津一方科技有限公司，纯度大于98%，批号：10092603）；丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院，纯度大于98%，批号：111562-201110）；甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；超纯水。
2.实验方法
2.1色谱条件
色谱柱：Venusil XBP C18柱（4.6mm×250mm,5um）；流动相：0.02%磷酸水-0.02%磷酸80%乙腈水梯度洗脱（梯度洗脱程序见下表）；流速：1mL·min-1；检测波长280nm；柱温30℃；进样量20ul；外标法。
2.2供试品溶液的制备
取注射用丹参多酚酸15mg，精密称定，加甲醇溶解并定容到25ml，摇匀，即得。
2.3混合对照品储备液的制备
分别精密称取丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品适量，加甲醇制成混合对照品溶液，得丹酚酸D质量浓度为21.10ug·mL-1、迷迭香酸质量浓度为39.4ug·mL-1、紫草酸质量浓度为41.4ug·mL-1、丹酚酸B质量浓度为539.00ug·mL-1的混合对照品溶液。
3.实验结果
测定结果见表3。HPLC叠加图见图2。从表3结果可知，此6个批号的丹参多酚酸样品中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量都比较稳定，说明相关工艺已经很成熟。
表36批丹参多酚酸中各成分含量
实施例2
1.仪器和材料
Waters 2695型高效液相色谱单元，配Waters 2489型紫外检测器（美国WATERS公司）；XS 105型十万分之一电子分析天平（瑞士METTLER公司）。
6批丹参多酚酸（天津天士力之骄药业有限公司提供）；丹酚酸D对照品（天津一方科技有限公司，纯度大于98%，批号：11031610）；迷迭香酸对照品（中国药品生物制品检定所，纯度大于98.8%，批号：111871-201001）；紫草酸对照品（天津一方科技有限公司，纯度大于98%，批号：10092603）；丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院，纯度大于98%，批号：111562-201110）；甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；超纯水。
2.实验方法
2.1色谱条件
色谱柱：Venusil XBP C18柱（4.6mm×250mm,5um）；流动相：0.02%磷酸水-0.02%磷酸80%乙腈水梯度洗脱（梯度洗脱程序见下表）；流速：1mL·min-1；检测波长280nm；柱温30℃；进样量20ul；外标法。
2.2供试品溶液的制备
取注射用丹参多酚酸15mg，精密称定，加甲醇溶解并定容到25ml，摇匀，即得。
2.3混合对照品储备液的制备
分别精密称取丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品适量，加甲醇制成混合对照品溶液，得丹酚酸D质量浓度为21.10ug·mL-1、迷迭香酸质量浓度为39.4ug·mL-1、紫草酸质量浓度为41.4ug·mL-1、丹酚酸B质量浓度为539.00ug·mL-1的混合对照品溶液。
3.实验结果
测定结果见表4。从表4结果可知，此6个批号的丹参多酚酸样品中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量都比较稳定，说明相关工艺已经很成熟。
表46批丹参多酚酸中各成分含量
实施例3
1.仪器和材料
Waters 2695型高效液相色谱单元，配Waters 2489型紫外检测器（美国WATERS公司）；XS 105型十万分之一电子分析天平（瑞士METTLER公司）。
8批注射用丹参多酚酸盐（购自上海绿谷制药有限公司）；丹酚酸D对照品（天津一方科技有限公司，纯度大于98%，批号：11031610）；迷迭香酸对照品（中国药品生物制品检定所，纯度大于98.8%，批号：111871-201001）；紫草酸对照品（天津一方科技有限公司，纯度大于98%，批号：10092603）；丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院，纯度大于98%，批号：111562-201110）；甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；超纯水。
2.实验方法
2.1色谱条件
色谱柱：Venusil XBP C18柱（4.6mm×250mm,5um）；流动相：0.02%磷酸水-0.02%磷酸80%乙腈水梯度洗脱（梯度洗脱程序见下表）；流速：1mL·min-1；检测波长280nm；柱温30℃；进样量20ul；外标法。
2.2供试品溶液的制备
取注射用丹参多酚酸盐15mg，精密称定，加甲醇溶解并定容到25ml，摇匀，即得。
2.3混合对照品储备液的制备
分别精密称取丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品适量，加甲醇制成混合对照品溶液，得丹酚酸D质量浓度为21.10ug·mL-1、迷迭香酸质量浓度为39.4ug·mL-1、紫草酸质量浓度为41.4ug·mL-1、丹酚酸B质量浓度为539.00ug·mL-1的混合对照品溶液。
3.实验结果
测定结果见表5。从表5结果可知，此8个批号的丹参多酚酸盐样品中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量都比较稳定，说明相关工艺已经很成熟。
表58批丹参多酚酸盐中各成分含量

Claims (7)

1.一种HPLC法测定丹参多酚酸中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B含量的方法，采用C18色谱柱，二元梯度洗脱，测定方法为同时测定丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B中任意1～4种化合物，其中所述二元梯度洗脱为磷酸水-磷酸乙腈水体系，两个流动相中磷酸比例相同，均为0.02％，流动相梯度洗脱条件为：
。
2.如权利要求1所述的方法，其中检测波长280nm，柱温30℃，流动相流速为1mL·min-1。
3.如权利要求1所述的方法，包括以下步骤：
步骤1：丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品混合溶液的制备；
步骤2：丹参多酚酸或其相关产品供试品溶液的制备；
步骤3：将对照品混合溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
步骤4：根据色谱图计算供试品溶液中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，步骤1所述对照品混合溶液的制备方法为：称取丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品，混合后加入甲醇溶解，得丹酚酸D质量浓度为21.10ug·mL-1、迷迭香酸质量浓度为39.4ug·mL-1、紫草酸质量浓度为41.4ug·mL-1、丹酚酸B质量浓度为539.00ug·mL-1。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，步骤2所述丹参多酚酸或其相关产品是指以丹参多酚酸作为活性成分的药品、保健品。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，步骤2所述供试品溶液制备方法为：称取丹参多酚酸或其相关产品，用醇溶解得到溶液，如果有不溶解的物质，过滤除去。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，步骤4所述根据色谱图计算供试品溶液中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量，所述计算是采用色谱图中的峰面积作为含量指标，通过标准曲线法计算待测样品中各成分的含量。
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