CN102928523B - 一种野菊花指纹图谱的测定方法和野菊花的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种野菊花药材的质量检测方法，包括野菊花药材指纹图谱的测定和野菊花有效成分的含量测定。野菊花药材指纹图谱测定的主要步骤为：供试品溶液制备、参照物溶液制备、测定、记录图谱、计算相似度。野菊花药材有效成分的含量测定的主要步骤为：对照品溶液制备、供试品溶液制备、测定、记录图谱、用外标一点法计算含量。野菊花的质量检测方法可用于野菊花药材的质量评价和质量控制中，以指纹图谱相似度不小于0.95、蒙花苷含量不小于0.8%为综合评价指标。本发明野菊花药材的指纹图谱及其有效成分绿原酸、木犀草苷、蒙花苷的含量测定，具有专属性强、准确度高和稳定性、精密度、重复性良好等优点，是野菊花药材质量控制的有效手段。
Description
技术领域
本发明涉及中药材质量检测领域，尤其是一种野菊花药材指纹图谱的测定方法及其在野菊花质量检测中的应用和野菊花的质量检测方法。
背景技术
野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序。秋、冬二季花初开放时采摘，晒干，或蒸后晒干。野菊花为野生药材，资源丰富，全国大部分地区均产，湖北、河南两省为商品药材主要产地，全年产量约3000吨左右，安徽、江苏、山东、陕西等省也有少量商品。由于受原植物品种、生长环境、采收期气候、产地加工方法等诸多因素的影响，不同来源的药材质量差异较大，成为药材采购和生产环节的质量控制的一大难题。长期以来，野菊花产地采收时均以性状、气味等传统经验鉴别方法控制质量，一般以花形小、颗粒状、香气浓郁者为佳，简便快捷，但缺乏定量指标，不能对药材内在质量进行科学合理的判定。工业生产中一般按照《中国药典》2010年版一部野菊花项下方法控制蒙花苷含量，但由于指标单一，在整体质量控制方面和检测方面存在缺陷。
发明内容
本发明的目的在于建立一种野菊花药材的指纹图谱测定方法，通过指纹图谱相似度评价野菊花药材的质量。本发明的另一个目的是建立一种野菊花药材中有效成分绿原酸、木犀草苷、蒙花苷的含量测定方法，通过有效成份的含量评价野菊花药材的质量。本发明针对现有技术的缺陷，建立野菊花药材的指纹图谱测定方法和有效成分绿原酸、木犀草苷、蒙花苷的含量测定方法，将指纹图谱相似度、有效成份含量等定量指标与传统经验鉴别方法的定性指标有机结合，相互印证，用于野菊花药材的整体质量检测中，为野菊花的质量控制提供了有效方法，极大的方便了药材采收、采购、工业生产中的质量控制。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案来实现：
本发明的野菊花药材指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称定野菊花药材粉末，精密加入体积百分比浓度为30％～100％的甲醇水溶液，提取，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
较佳的，精密称定的野菊花药材粉末为0.05g～2.5g，精密加入的体积百分比浓度为30％～100％甲醇水溶液的量为10～500mL。
最佳的，精密称定的野菊花药材粉末为0.25g，精密加入的体积百分比浓度为30％～100％甲醇水溶液的量为50mL。
(2)参照物溶液的制备：取蒙花苷对照品适量，用体积百分比浓度为30％～100％的甲醇水溶液溶解，制成蒙花苷浓度为12.7～202.9μg/mL的参照物溶液。
(3)测定：采用高效液相色谱法HPLC对参照物溶液和供试品溶液分别进行检测，并记录供试品溶液的指纹图谱和作为对照色谱峰的参照物溶液的指纹图谱；其中，采用HPLC进行测试包括如下色谱条件：
a，色谱柱的填料采用十八烷基硅烷键合硅胶；
b，采用有机相和水相的混合液作为流动相进行梯度洗脱，所述流动相中有机相的体积百分比为5％～90％，水相的体积百分比为95％～10％，其中，流动相中的有机相选自乙睛、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种的混合溶剂，流动相中的水相选自酸的水溶液或缓冲盐的水溶液；
c，柱温为25～40℃；检测波长为220～360nm；
较佳的，所述流动相的流速为1.0mL/min；
本发明将供试品溶液的指纹图谱与野菊花标准指纹图谱进行比较，并计算相似度；本发明的野菊花药材标准指纹图谱包括18个共有指纹峰，以蒙花苷色谱峰12#峰(S峰)为内参比峰，可计算出其他17个共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。
本发明将测得的野菊花的指纹图谱与野菊花的标准指纹图谱进行相似度的比较时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版软件进行比较。
本发明的野菊花的指纹图谱与野菊花标准指纹图谱的相似度≥0.95，是优质野菊花药材的判定标准之一。
本发明的野菊花药材指纹图谱的测定方法可用于野菊花药材的质量检测。
本发明的野菊花药材的质量检测方法，包括采用野菊花指纹图谱的测定方法得到野菊花的指纹图谱，采用与野菊花指纹图谱的测定方法相同的条件得到野菊花的标准指纹图谱，将得到的野菊花的指纹图谱与野菊花的标准指纹图谱进行相似度比较；还包括野菊花中有效成分的含量测定。
所述野菊花药材中的有效成分是指绿原酸、木犀草苷和蒙花苷等有效成分。
本发明的野菊花药材中有效成分的含量测定，包括有效成分中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷中的一种或多种成分的含量测定，具体包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称定野菊花药材粉末，精密加入体积百分比浓度为30％～100％甲醇水溶液，提取，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
较佳的，精密称定的野菊花药材粉末为0.05g～2.5g，精密加入的体积百分比浓度为30％～100％甲醇水溶液的量为10～500mL。
最佳的，精密称定的野菊花药材粉末为0.25g，精密加入的体积百分比浓度为30％～100％甲醇水溶液的量为50mL。
(2)对照品溶液的制备：选取绿原酸对照品、木犀草苷对照品和蒙花苷对照品中的一种或多种对照品适量，用体积百分比浓度为30％～100％的甲醇水溶液溶解，制成单一对照品溶液或者混合对照品溶液。
较佳的，所述单一对照品溶液为蒙花苷的单一对照品溶液、木犀草苷的单一对照品溶液或绿原酸的单一对照品溶液；
更佳的，所述蒙花苷的单一对照品溶液中蒙花苷的浓度为12.7～202.9μg/mL；所述绿原酸的单一对照品溶液中绿原酸的浓度为2.0～32.4μg/mL；所述木犀草苷单一对照品溶液中木犀草苷的浓度为1.0～15.6μg/mL。
较佳的，所述混合对照品溶液为包含蒙花苷的混合对照品溶液；所述包含蒙花苷的混合对照品溶液还包含绿原酸和木犀草苷中的一种或两种物质。
更佳的，所述混合对照品溶液中，绿原酸的浓度为2.0～32.4μg/mL、木犀草苷的浓度为1.0～15.6μg/mL、蒙花苷的浓度为12.7～202.9μg/mL。
(3)测定：采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和对照品溶液分别进行检测，并分别记录供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图；其中，采用HPLC进行测试包括如下色谱条件：
a，色谱柱的填料采用十八烷基硅烷键合硅胶；
b，采用有机相和水相的混合液作为流动相进行梯度洗脱；其中，所述流动相中有机相的体积百分比为5％～90％，水相的体积百分比为95％～10％；流动相中的有机相选自乙睛、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种的混合溶剂，流动相中的水相选自酸的水溶液或缓冲盐的水溶液；
c，柱温为25～40℃；检测波长为220～360nm；
较佳的，所述流动相的流速为1.0mL/min；
(4)根据所记录的供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量。
本发明的野菊花中蒙花苷的质量百分含量不小于0.8％，作为优质野菊花的判定标准之
本发明用于测定野菊花中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷的含量和野菊花的指纹图谱时，可以采用相同的供试品制备方法和相同的色谱条件。
本发明的供试品溶液的制备中：野菊花药材粉末取用量为0.05g～2.5g，提取溶剂可以是体积百分比浓度为30％～100％的甲醇水溶液，提取溶剂的用量根据药材取用量的不同可以是10～500mL；最佳的药材取用量与提取溶剂的用量之比为1∶200(例如：野菊花药材粉末0.25g，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL)；提取溶剂中甲醇浓度不超过50％时，可以取滤液直接进样；若提取溶剂中甲醇浓度超过50％时，直接进样容易出现强溶剂效应导致的峰变形，可通过水稀释使甲醇浓度降至50％以下后进样可以消除强溶剂效应影响。也可以用不同浓度的乙醇溶液作为提取溶剂，但乙醇溶液提取效果相比甲醇溶液要差。
本发明的供试品溶液的制备中：野菊花药材粉末提取方法可以是回流提取、超声提取、索式提取。
本发明供试品溶液的制备中：野菊花药材粉末提取方法采用回流提取时，一般采用烧瓶作为提取容器，提取溶剂采用移液管等精密量器定量加入，提取前需称定重量，提取后需用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进行测定；回流提取的温度和时间对提取效果有明显影响，提取温度可以是60～100℃，最佳提取温度为80℃，提取时间可以是0.5～4.0小时，最佳提取时间是2.0小时。
本发明采用回流提取最佳的供试液制备方法为：取野菊花药材粉末0.25g，精密称定，置于烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL，称定重量，80℃回流提取2.0小时，冷至室温，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
本发明的供试液的制备中：野菊花药材粉末提取方法采用超声提取时，可以采用烧瓶作为提取容器，提取溶剂采用移液管等精密量器定量加入，提取前需称定重量，提取后需用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进行测定；也可以采用容量瓶作为提取容器，提取后定容，摇匀，滤过，取续滤液进行测定；超声提取的时间对提取效果有明显影响，提取时间可以是5～60分钟，最佳提取时间是30分钟。
本发明采用超声提取最佳的供试液制备方法为：取野菊花药材粉末0.25g，精密称定，置于烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL，称定重量，超声提取30分钟，冷至室温，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
本发明测定野菊花指纹图谱时，其参照物溶液可以用绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素等制成一定浓度的单一对照溶液或混合对照品溶液，分别对各指标成分进行归属定位；为方便指纹图谱比较并节约检测成本，可以用单一的蒙花苷对照品溶液作为参照物溶液，浓度可以是12.7～202.9μg/mL，参照物溶液的制备一般采用与供试品相同的溶剂，较佳的参照物制备方法为：取蒙花苷对照品，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液溶解，制成含蒙花苷为12.7～202.9μg/mL的参照物溶液。
本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，所指的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，不同品牌和型号的色谱柱分离性能有较明显的差异，在做指纹图谱测定时以Kromasil C18色谱柱分离效果最好。
本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，所指的流动相有机相可以是乙睛、甲醇、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合溶剂；所述流动相水相中的酸水溶液选自磷酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液和三氟乙酸水溶液，但不局限于上述酸水溶液；所述流动相水相中的缓冲盐水溶液选自磷酸盐水溶液和醋酸盐水溶液，缓冲盐水溶液的pH值不大于7.0，但不局限于上述缓冲盐水溶液。
本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，所述流动相中有机相为乙睛，水相为磷酸水溶液，并采用梯度洗脱，且流动相中有机相体积百分比占5％～90％，水相体积百分比占95％～10％，可以得到理想的分离效果；水相中的酸水溶液的浓度可以在较宽的范围内调整，磷酸水溶液中酸的体积百分比浓度为0.025％～0.1％的范围内变动不会对分离效果造成明显影响。
本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，最佳的流动相为：以乙睛为流动相中的有机相，以体积百分比浓度为0.05％磷酸水溶液为流动相中的水相；采用梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90％线性改变至85％，5～25min，水相体积百分比从85％线性改变至80％，25～40min，水相体积百分比从80％线性改变至70％，40～50min，水相体积百分比从70％线性改变至30％，50～60min，水相体积百分比从30％线性改变至30％。
本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，所述色谱柱的温度为 25～40℃，最佳的色谱柱柱温为30℃。
本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，所述检测波长为220～360nm，最佳的检测波长为334nm。
本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，最佳的色谱条件为：取参照物溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；以乙睛为流动相的有机相，以体积百分比浓度为0.05％磷酸水溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90％线性改变至85％，5～25min，水相体积百分比从85％线性改变至80％，25～40min，水相体积百分比从80％线性改变至70％，40～50min，水相体积百分比从70％线性改变至30％，50～60min，水相体积百分比从30％线性改变至30％，流速1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：334nm。采用上述最佳色谱条件进行测定并记录供试品指纹图谱；将供试品指纹图谱与标准指纹图谱进行相似度计算。
采用上述最佳条件所建立的野菊花的标准指纹图谱，包括18个共有指纹峰，以蒙花苷色谱峰12#峰(S峰)为内参比峰，其他17个共有指纹峰的相对保留时间依次为1#峰(0.162±0.005)、2#峰(0.216±0.005)、3#峰(0.543±0.005)、4#峰(0.570±0.005)、5#峰(0.650±0.005)、6#峰(0.693±0.005)、7#峰(0.733±0.005)、8#峰(0.793±0.005)、9#峰(0.804±0.005)、10#峰(0.842±0.005)、11#峰(0.984±0.005)、13#峰(1.031±0.005)、14#峰(1.078±0.005)、15#峰(1.136±0.005)、16#峰(1.148±0.005)、17#峰(1.155±0.005)、18#峰(1.159±0.005)。
本发明测定野菊花中有效成分的含量时，按进样量20μL计算，各指标成分浓度的线性范围分别为绿原酸2.0～32.4μg/mL、木犀草苷1.0～15.6μg/mL、蒙花苷12.7～202.9μg/mL，因此可以制成相应浓度的单一对照品溶液或混合对照品溶液作为含量测定的对照品；对照品制备可以采用不同浓度的甲醇溶液配制成储备液再进一步稀释成需要的浓度，也可以直接配制成需要的浓度；木犀草苷、蒙花苷在甲醇和甲醇水溶液中稳定性均较好，可长期存放使用；绿原酸在甲醇中稳定，可长期存放使用，在甲醇水溶液中不稳定，易降解转化，需要现用现配。
本发明的野菊花的质量检测方法中，所测定的野菊花的指纹图谱与野菊花标准指纹图谱的相似度不低于0.95；所测定的野菊花中，以野菊花干药材计，蒙花苷的质量百分含量不低于0.8％；同时满足上述两个条件的野菊花为优质野菊花。
本发明的野菊花的质量检测方法可用于野菊花的质量评价和野菊花药材的质量控制。
野菊花药材以花形大小来看，花形的平均直径小于4毫米的为小花，花形的平均直径大于等于4毫米的为大花，传统经验认为花形小、色泽鲜艳、香气浓郁者质量为佳。产地和品种可能是决定野菊花质量的主要因素。本发明用于评价野菊花药材的质量，采用综合评价的方法，优质药材的判定标准为：以干药材计，蒙花苷的质量百分含量不低于0.8％；与标准指纹图谱的相似度不低于0.95。该评价方法可以区别不同产地药材、不同品种药材，并可以与经验鉴别标准相互印证，可以用于指导生产、采购环节的药材质量控制，具有很强的实用价值。
附图说明
图1色谱柱选择色谱图
图2流动相酸种类选择色谱图
图3流动相酸浓度考察色谱图
图4柱温考察色谱图
图5-1野菊花中活性成分绿原酸的紫外光谱
图5-2野菊花中活性成分木犀草苷的紫外光谱
图5-3野菊花中活性成分蒙花苷的紫外光谱
图6不同检测波长下的野菊花色谱图
图7野菊花供试品溶液DAD三维图谱
图8野菊花药材HPLC标准指纹图谱
图9不同产地22批野菊花药材HPLC指纹图谱
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
具体试验方法：
供试品溶液的制备：取野菊花药材粉末0.25g，精密称定，置于烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL，称定重量，80℃回流提取2.0小时，冷至室温，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
或者，取野菊花药材粉末0.25g，精密称定，置于容量瓶中，精密加入体积百分比浓度 为50％的甲醇水溶液50mL，称定重量，超声提取30分钟，冷至室温，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液补足减失重量，并定容，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
参照物溶液的制备：取蒙花苷对照品适量，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液溶解，制成蒙花苷浓度为12.7～202.9μg/mL的参照物溶液。
对照品溶液的制备：取绿原酸对照品、木犀草苷对照品和蒙花苷对照品中的一种或多种适量，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液溶解，制成单一对照品溶液或者混合对照品溶液。其中，所得的蒙花苷的单一对照品溶液中蒙花苷的浓度为12.7～202.9μg/mL；所得的绿原酸的单一对照品溶液中绿原酸的浓度为2.0～32.4μg/mL；所得的木犀草苷单一对照品溶液中木犀草苷的浓度为1.0～15.6μg/mL。所得的混合对照品溶液中，绿原酸的浓度为2.0～32.4μg/mL、木犀草苷的浓度为1.0～15.6μg/mL、蒙花苷的浓度为12.7～202.9μg/mL。
采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和参照物溶液别进行测试，并记录供试品溶液的指纹图谱和作为对照色谱峰的参照物溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与标准指纹图谱进行比较，并计算相似度；采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和对照品溶液分别进行测试，并分别记录供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图，根据所记录的供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量。
其中，采用高效液相色谱法HPLC对各种待测溶液分别进行测试时，色谱条件如下：
取待测溶液20μL注入高效液相色谱仪，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙睛为流动相的有机相，以体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90％线性改变至85％，5～25min，水相体积百分比从85％线性改变至80％，25～40min，水相体积百分比从80％线性改变至70％，40～50min，水相体积百分比从70％线性改变至30％，50～60min，水相体积百分比从30％线性改变至30％，流速1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：334nm。
实施例1：色谱柱选择在具体试验方法中其他条件相同的情况下，比较Agilent SB-C18(4.6×250mm，5μm)、Agilent TC-C18(2)(4.6×250mm，5μm)、Agilent XDB-C18(4.6×250mm，5μm)以及Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)等4款色谱柱的分离效果，结果表明，各色谱柱的出峰数目、峰分离度存在显著差异，其中Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)各项性能指标最优，因此选用Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)作为进行指纹图谱测定柱。见图1。
实施例2：流动相酸种类选择野菊花中主要含黄酮类和有机酸类成分，在酸性流动相中分离较好。以乙腈为有机相，在具体试验方法中其他条件相同的情况下，比较磷酸、冰乙酸、甲酸、三氟乙酸的水溶液作水相时的分离效果，结果表明，磷酸水溶液做水相时色谱峰形和分离度最好，因此选用磷酸溶液水相进一步考察酸浓度。见图2。
实施例3：流动相酸浓度考察在具体试验方法中其他条件相同的情况下，比较体积百分比浓度为0.025％、0.05％、0.1％三种浓度的磷酸水溶液作水相时的分离效果，结果表明，该方法对酸浓度变化的耐受性较好，三种酸浓度下色谱峰形和分离度无明显差异，因此选择0.05％磷酸溶液作为流动相水相。见图3。
实施例4：柱温考察在具体试验方法中其他条件相同的情况下，比较25℃、30℃、35℃、40℃等四种不同的色谱柱温度下的分离效果，结果表明，柱温对分离效果有明显影响，25℃、30℃时各色谱峰分离较好，30℃时分离效果最佳，因此确定柱温为30℃。见图4。
实施例5：检测波长选择绿原酸、木犀草苷、蒙花苷为野菊花中的三种活性成分，其分子结构、极性和光谱特征均存在明显差异，作为指控指标成分具有较好的代表性。根据三种成分紫外光谱的特征吸收，从野菊花供试品DAD三维图谱中提取不同波长下的色谱图进行比较，结果表明，334nm下得到的色谱图基线平稳，并可兼顾各成分检测灵敏度，因此选为指纹图谱测定波长。见图5-1、图5-2、图5-3、图6。
实施例6：提取溶剂选择以各指标成分峰面积为评价标准，比较了甲醇、乙醇两种溶剂在超声提取30min时的提取效果，野菊花取样量为0.25g，溶剂用量为50mL，结果表明，甲醇提取效率明显优于乙醇，因此选用甲醇作溶剂进一步优选提取溶剂浓度。相关数据见表1。
表1提取溶剂选择结果
实施例7：甲醇浓度考察以各指标成分峰面积为评价标准，比较了不同浓度甲醇水溶液80℃回流2h的提取效果，野菊花取样量为0.25g，溶剂用量为50mL，结果表明，体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液提取效率最佳，因此选用体积百分比浓度为50％的甲醇水 溶液为溶剂。相关数据见表2。
表2甲醇浓度考察结果
实施例8：提取方法考察以各指标成分峰面积为评价标准，比较了体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液超声30min和80℃回流2h的提取效果，野菊花取样量为0.25g，溶剂用量为50mL，结果表明，回流提取效率明显优于超声提取，因此选用回流提取进一步优化提取参数。相关数据见表3。
表3提取方法考察结果
实施例9：提取温度考察以各指标成分峰面积为评价标准，比较了体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液在不同温度下回流2h的提取效果，野菊花取样量为0.25g，溶剂用量为50mL，结果表明，各温度下提取效率差异不明显，相比之下80℃综合提取效率较高，因此确定提取温度为80℃。相关数据见表4。
表4提取温度考察结果
实施例10：提取时间考察以各指标成分峰面积为评价标准，比较了体积百分比浓度 为50％的甲醇水溶液在80℃水浴下不同回流时间的提取效果，野菊花取样量为0.25g，溶剂用量为50mL，结果表明，回流2h已能将目标成分提取完全，确定提取时间为2h。相关数据见表5。
表5提取时间考察结果
根据上述研究结果，确定最终的样品前处理方法为：以体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液为提取溶剂，80℃回流提取2h。
实施例11：专属性考察分别取混合对照品溶液(含绿原酸8.088μg/mL、木犀草苷3.899μg/mL、蒙花苷50.723μg/mL)、各单个对照品溶液(浓度分别为：绿原酸8.088μg/mL、木犀草苷3.899μg/mL、蒙花苷50.723μg/mL)以及野菊花供试品溶液(取野菊花0.25g，溶剂为体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL，按具体实验方法中回流提取法制备供试品溶液)进样，采集DAD三维图谱，对供试品色谱中各对照品对应色谱峰进行归属，并计算理论塔板数、分离度和峰纯度，结果表明，各供试品色谱中对照品对应的色谱峰理论塔板数均大于20000、分离度均大于2.0、峰纯度均大于995，该方法专属性符合指纹图谱测定要求。见图7。
实施例12：精密度取野菊花0.25g，溶剂为体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL，按具体实验方法中回流提取法制备一份供试品溶液，连续进样6次，与第1次比较，其余5次的色谱图相似度均大于0.999，各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD值均小于2％，表明该方法精密度良好，符合指纹图谱测定要求。
实施例13：重复性取同一批野菊花药材，制备6份供试品溶液，每份取野菊花0.25g，溶剂为体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL，按具体实验方法中回流提取法制备供试品溶液，依次进样，与第1份比较，其余5份的色谱图相似度均大于0.999，各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD值均小于2％，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱测定要求。
实施例14：样品溶液稳定性取实施例12中所得的野菊花供试品溶液分别于制备后0h、4h、8h、12h、24h、48h、72h后测定，与0h比较，各时间点的色谱图相似度均大于0.999，各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD值均小于2％，表明供试液至少在72小时内稳定。
实施例15：标准指纹图谱的建立
供试品溶液的制备：取野菊花药材粉末0.25g，精密称定，置于烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL，称定重量，80℃回流提取2.0小时，冷至室温，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。参照物溶液的制备：取蒙花苷对照品适量，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液溶解，制成蒙花苷浓度为50.723μg/mL的参照物溶液。
采用高效液相色谱法HPLC对各样品溶液分别进行测试时，色谱条件为：取待测溶液20μL注入高效液相色谱仪，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙睛为流动相的有机相，以体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90％线性改变至85％，5～25min，水相体积百分比从85％线性改变至80％，25～40min，水相体积百分比从80％线性改变至70％，40～50min，水相体积百分比从70％线性改变至30％，50～60min，水相体积百分比从30％线性改变至30％，流速1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：334nm。
选取蒙花苷含量大于0.8％的10批野菊花药材，分别制备供试品溶液，并测定指纹图谱，将测得的10批野菊花药材的指纹图谱采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004 A版软件生成野菊花药材HPLC标准指纹图谱(见图8)，标定18个共有指纹峰。以蒙花苷色谱峰(12号峰，S峰)为内参比峰，其他17个共有指纹峰相对保留时间依次为0.162、0.216、0.543、0.570、0.650、0.693、0.733、0.793、0.804、0.842、0.984、1.031、1.078、1.136、1.148、1.155、1.159，其中2号、3号、5号、6号、7号、8号、11号、12号为8个强峰，其峰面积和占总峰面积的85％。除S峰外，6号峰峰面积超过总峰面积10％，规定其相对峰面积为0.283～0.471。
实施例16：不同产地22批野菊花药材的指纹图谱测定
取野菊花药材粉末0.25g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL，称定重量，80℃水浴回流提取2h，冷至室温，加体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。取供试品20μL注入高效液相色谱仪，采用Kromasil C18(5μm，4.6×250mm)分析柱，以 乙睛为A相，以体积百分比浓度为0.05％磷酸水溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90％线性改变至85％，5～25min，水相体积百分比从85％线性改变至80％，25～40min，水相体积百分比从80％线性改变至70％，40～50min，水相体积百分比从70％线性改变至30％，50～60min，水相体积百分比从30％线性改变至30％，流速1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：334nm。对22批不同来源野菊花药材进行测定，将所得指纹图谱与实施例15所得的野菊花的标准指纹图谱比较，计算相似度，结果见表6。
表6 22批野菊花药材来源及HPLC指纹图谱相似度
| 样品批号 | 样品来源 | 相似度 | 花形 |
| 20101101 | 安徽省岳西县 | 0.630 | 小花 |
| 20101102 | 安徽省全椒县 | 0.960 | 大花 |
| 20101103* | 湖北省罗田县* | 0.969* | 小花* |
| 20101104* | 湖北省罗田县* | 0.974* | 小花* |
| 20101105 | 湖北省老河口市 | 0.650 | 大花 |
| 20101106* | 湖北省枣阳市* | 0.963* | 小花* |
| 20101107* | 湖北省广水市* | 0.838* | 小花* |
| 20101108 | 湖北省随州市随县淮河镇 | 0.915 | 大花 |
| 20101109* | 湖北省随州市曾都区何店镇* | 0.828* | 小花* |
| 20101110* | 湖北省随州市随县环潭镇* | 0.992* | 小花* |
| 20101111* | 湖北省随州市曾都区均川镇* | 0.979* | 小花* |
| 20101112 | 湖北省随州市随县殷店镇 | 0.929 | 大花 |
| 20101113* | 湖北省孝感市* | 0.970* | 小花* |
| 20101114 | 河南省桐柏县 | 0.954 | 大花 |
| 20101115* | 河南省桐柏县毛集镇* | 0.998* | 小花* |
| 20101116 | 河南省西峡县 | 0.886 | 大花 |
| 20101117* | 河南省信阳市* | 0.968* | 小花* |
| 20101118 | 河南省罗山县 | 0.777 | 大花 |
| 20101119 | 河南省南阳市武岗乡 | 0.333 | 大花 |
| 20101120 | 河南省商城县 | 0.920 | 大花 |
| 20101121* | 湖北省随州市曾都区府河镇* | 0.966* | 小花* |
| 20101123* | 湖北省麻城市* | 0.972* | 小花* |
表6中的*代表的野菊花为小花，花的平均直径小于4毫米。
实施例17：对照品溶液制备取绿原酸、木犀草苷、蒙花苷对照品置于五氧化二磷干燥器中真空干燥24小时；取绿原酸对照品10mg，精密称定，置50mL的容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为绿原酸储备液。取木犀草苷对照品10mg，精密称定，置100mL的容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为木犀草苷储备液。取蒙花苷对照品10mg，精密称定，置250mL的容量瓶中，精密加入绿原酸储备液、木犀草苷储备液各25mL，再加适量甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液(含绿原酸21.74μg/mL、木犀草苷10.27μg/mL、蒙花苷42.94μg/mL)。精密量取5.0mL混合对照品储备液，置10mL容量瓶中，加水至近刻度，冷至室温，重新定容，摇匀，作为对照品溶液(含绿原酸10.87μg/mL、木犀草苷5.13μg/mL、蒙花苷21.47μg/mL)。
实施例18：线性关系考察分别精密量取混合对照品溶液(含绿原酸8.088μg/mL、木犀草苷3.899μg/mL、蒙花苷50.723μg/mL)5μL、10μL、20μL、40μL、80μL注入液相色谱仪，按具体试验方法中HPLC色谱法进行测定。以各指标成分进样量(μg)为横坐标，峰面积(mAU*S)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程、相关系数以及线性范围。相关测定数据见表7。
表7野菊花含量测定线性关系考察结果
绿原酸回归方程为：y＝4.0456x+2.1376，R2＝1，在40.44～647.04ng范围内线性关心良好。木犀草苷回归方程为：y＝2.5179x-1.1706，R2＝1，在19.50～311.92ng范围内线性关心良好。蒙花苷回归方程为：y＝2.3279x+5.3347，R2＝1，在253.62～4057.82ng范围内线性关心良好。
实施例19：仪器精密度取对照品溶液(含绿原酸8.088μg/mL、木犀草苷3.899μg/mL、蒙花苷50.723μg/mL)，采用Kromasil C18(5um，4.6×250mm)为分析柱，按具体试验方法中的HPLC方法进行测定，重复测定6次，进样量20μL，以各指标成分色谱峰的峰面积计算RSD值。结果表明，各指标成分RSD值均小于2.0％，仪器精密度符合规定。相关数据见表8。
表8仪器精密度实验结果
实施例20：重复性取同一批野菊花药材粉末，平行制备6份供试品溶液，每份取野菊花0.25g，溶剂为体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL，按具体试验方法中回流提取法制备供试品溶液，采用Kromasil C18(5um，4.6×250mm)为分析柱，按具体试验方法中的HPLC色谱方法进行测定，并按外标一点法计算药材中各指标成分含量及其RSD值。结果表明，各指标成分含量的RSD值均小于2.0％，方法的重复性良好。相关数据见表9。
表9重复性实验结果
实施例21：中间精密度取同一批野菊花药材粉末，制备供试品溶液(取野菊花0.25g，溶剂为体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL，按具体实验方法中回流提取法制备供试品溶液)，采用Kromasil C18(5um，4.6×250mm)为分析柱，按具体实验方法中的HPLC方法进行测定，并按外标一点法计算药材中各指标成分含量，考察不同人员、不同时间、不同仪器测定结果的精密度，计算RSD值。结果表明，不同时间、不同人员、不同仪器下所得各指标成分含量测定结果的RSD值均小于2.0％，该方法的中间精密度符合规定。相关数据见表10～表12。
表10中间精密度不同时间实验结果
| 指标成分 | 时间1 | 时间2 | 时间3 | 平均值 | RSD(％) |
| 绿原酸 | 0.3213 | 0.3248 | 0.3279 | 0.3247 | 1.02 |
| 木犀草苷 | 0.1736 | 0.1757 | 0.1731 | 0.1741 | 0.79 |
| 蒙花苷 | 0.8196 | 0.8262 | 0.8254 | 0.8237 | 0.44 |
表11中间精密度不同人员实验结果
| 指标成分 | 人员1 | 人员2 | 人员3 | 平均值 | RSD(％) |
| 绿原酸 | 0.3213 | 0.3284 | 0.3192 | 0.3230 | 1.49 |
| 木犀草苷 | 0.1736 | 0.1761 | 0.1736 | 0.1744 | 0.83 |
| 蒙花苷 | 0.8196 | 0.8270 | 0.8225 | 0.8230 | 0.45 |
表12中间精密度不同仪器实验结果
| 指标成分 | 仪器1 | 仪器2 | 仪器3 | 平均值 | RSD(％) |
| 绿原酸 | 0.3213 | 0.3214 | 0.3297 | 0.3241 | 1.49 |
| 木犀草苷 | 0.1736 | 0.1714 | 0.1782 | 0.1744 | 1.99 |
| 蒙花苷 | 0.8196 | 0.8070 | 0.8176 | 0.8147 | 0.83 |
实施例22：回收率取野菊花药材粉末0.125g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入混合对照品储备液(含绿原酸21.74μg/mL、木犀草苷10.27μg/mL、蒙花苷42.94μg/mL)25mL，再精密加入水25mL、体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液1.7mL(甲醇和水混合 后的体积补偿)，称定重量，80℃水浴回流提取2h，冷至室温，加体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。平行制备6份供试品溶液，采用Kromasil C18(5um，4.6×250mm)为分析柱，按具体实验方法中的HPLC方法测定，按外标一点法计算各指标成分回收率及其RSD值。结果表明，各指标成分回收率RSD值均小于2.0％，该方法的准确度符合规定。相关数据见表13～表15。
表13绿原酸回收率实验结果
表14木犀草苷回收率实验结果
表15蒙花苷回收率实验结果
实施例23：不同产地22批野菊花药材的含量测定
取野菊花药材粉末0.25g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL，称定重量，80℃水浴回流提取2h，冷至室温，加体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。取供试品溶液和对照品溶液(含绿原酸8.088μg/mL、木犀草苷3.899μg/mL、蒙花苷50.723μg/mL)各20μL，注入高效液相色谱仪，采用Kromasil C18(5μm，4.6×250mm)分析柱，以乙睛为流动相的有机相，以体积百分比浓度为0.05％磷酸水溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90％线性改变至85％，5～25min，水相体积百分比从85％线性改变至80％，25～40min，水相体积百分比从80％线性改变至70％，40～50min，水相体积百分比从70％线性改变至30％，50～60min，水相体积百分比从30％线性改变至30％，流速1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：334nm。取22批不同来源野菊花药材，每批药材平行制备两份，每份进两针按外标一点法计算药材中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷等指标成分的含量(取平均值)，测定结果见表16。
表16不同来源22批野菊花药材含量测定结果
表16中*代表的野菊花为小花，花的平均直径小于4毫米。
实施例24：野菊花药材的质量评价
野菊花药材以花形大小来看，花形的平均直径小于4毫米的为小花，花形的平均直径大于等于4毫米的为大花，传统经验认为花形小、色泽鲜艳、香气浓郁者质量为佳。由表6、表16结果可见，以相似度大于0.95，且蒙花苷含量大于0.8％为优质药材的判定标准，则湖北产野菊花药材质量普遍优于河南、安徽产药材；小花质量普遍优于大花；产地和品种可能是决定野菊花质量的主要因素。
以下实施例25-30中的野菊花样品均选用批号为20101106、来源地为湖北枣阳市、花型为小花的野菊花样品。
实施例25
供试品溶液的制备：取野菊花药材粉末1.0g，精密称定，置于烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为30％的甲醇水溶液200mL，称定重量，100℃回流提取4.0小时，冷至室温，用30％甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
参照物溶液的制备：取蒙花苷对照品适量，用体积百分比浓度为30％的甲醇水溶液溶解，制成蒙花苷浓度为12.7μg/mL的参照物溶液。
对照品溶液的制备：取绿原酸对照品、木犀草苷对照品和蒙花苷对照品各适量，用体积百分比浓度为30％的甲醇水溶液溶解，制成混合对照品溶液。其中，所得的混合对照品溶液中，绿原酸的浓度为2.0μg/mL、木犀草苷的浓度为1.0μg/mL、蒙花苷的浓度为12.7 μg/mL。
采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和参照物溶液别进行测试，并记录供试品溶液的指纹图谱和参照物溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与采用本实施例色谱条件所建立的野菊花标准指纹图谱进行比较，并计算相似度；采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和对照品溶液分别进行测试，并分别记录供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图，根据所记录的供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量。
其中，HPLC测试的色谱条件均如下：分别取各待测溶液20μL注入高效液相色谱仪，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙睛为流动相的有机相，以体积百分比浓度为0.025％的磷酸水溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90％线性改变至85％，5～25min，水相体积百分比从85％线性改变至80％，25～40min，水相体积百分比从80％线性改变至70％，40～50min，水相体积百分比从70％线性改变至30％，50～60min，水相体积百分比从30％线性改变至30％，流速1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：360nm。
本实施例的野菊花样品的测试结果如表17所示，可见，野菊花样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度大于0.95，且蒙花苷含量大于0.8％，为优质野菊花药材，且其花形经测量，花形的平均直径小于4毫米。
表17野菊花指纹图谱的相似度、有效成分的含量和花形
实施例26
供试品溶液的制备：取野菊花药材粉末0.05g，精密称定，置于烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为90％的甲醇水溶液10mL，称定重量，60℃回流提取0.5小时，冷至室温，用90％甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
参照物溶液的制备：取蒙花苷对照品适量，用体积百分比浓度为90％的甲醇水溶液溶解，制成蒙花苷浓度为202.9μg/mL的参照物溶液。
对照品溶液的制备：取绿原酸对照品、木犀草苷对照品和蒙花苷对照品各适量，用体积百分比浓度为90％的甲醇水溶液溶解，制成混合对照品溶液，其中绿原酸的浓度为32.4μg/mL、木犀草苷的浓度为15.6μg/mL、蒙花苷的浓度为202.9μg/mL。
采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和参照物溶液别进行测试，并记录供试品溶液的指纹图谱和参照物溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与采用本实施例色谱条件所建立的野菊花标准指纹图谱进行比较，并计算相似度；采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和对照品溶液分别进行测试，并分别记录供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图，根据所记录的供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量。
其中，HPLC测试的色谱条件均如下：分别取待测溶液20μL注入高效液相色谱仪，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙睛为流动相的有机相，以体积百分比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90％线性改变至85％，5～25min，水相体积百分比从85％线性改变至80％，25～40min，水相体积百分比从80％线性改变至70％，40～50min，水相体积百分比从70％线性改变至30％，50～60min，水相体积百分比从30％线性改变至30％，流速1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：334nm。
本实施例的野菊花样品的测试结果如表18所示，可见，野菊花样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度大于0.95，且蒙花苷含量大于0.8％，为优质野菊花药材，且其花形经测量，花形的平均直径小于4毫米：
表18野菊花指纹图谱的相似度、有效成分的含量和花形
实施例27
供试品溶液的制备：取野菊花药材粉末2.5g，精密称定，置于烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液500mL，称定重量，超声提取60分钟，冷至室温，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。参照物溶液的制备：取蒙花苷对照品适量，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液溶解，制成蒙花苷浓度为50.0μg/mL的参照物溶液。
对照品溶液的制备：取绿原酸对照品、木犀草苷对照品和蒙花苷对照品中的一种或多种适量，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液溶解，制成单一对照品溶液或者混合对照品溶液。其中所得的混合对照品溶液中，绿原酸的浓度为10.0μg/mL、木犀草苷的浓度为10.0μg/mL、蒙花苷的浓度为50.0μg/mL。
采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和参照物溶液别进行测试，并记录供试品溶液的指纹图谱和参照物溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与采用本实施例色谱条件所建立的野菊花标准指纹图谱进行比较，并计算相似度；采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和对照品溶液分别进行测试，并分别记录供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图，根据所记录的供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量。
其中，HPLC测试的色谱条件均如下：分别取待测溶液20μL注入高效液相色谱仪，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙睛为流动相的有机相，以体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90％线性改变至85％，5～25min，水相体积百分比从85％线性改变至80％，25～40min，水相体积百分比从80％线性改变至70％，40～50min，水相体积百分比从70％线性改变至30％，50～60min，水相体积百分比从30％线性改变至30％，流速1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：220nm。
本实施例的野菊花样品的测试结果如表19所示，可见，野菊花样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度大于0.95，且蒙花苷含量大于0.8％，为优质野菊花药材，且其花形经测量，花形的平均直径小于4毫米：
表19野菊花指纹图谱的相似度、有效成分的含量和花形
实施例28
供试品溶液的制备：取野菊花药材粉末0.25g，精密称定，置于烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为100％的甲醇50mL，称定重量，超声提取5分钟，冷至室温，用甲醇(相当于体积百分比浓度为100％的甲醇水溶液)补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。参照物溶液的制备：取蒙花苷对照品适量，用甲醇溶解，制成蒙花苷浓度为50.0μg/mL的参照物溶液。
对照品溶液的制备：取蒙花苷对照品适量，用体积百分比浓度为100％的甲醇溶解，制成蒙花苷浓度为12.7～202.9μg/mL的单一对照品溶液。
采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和参照物溶液别进行测试，并记录供试品溶液的指纹图谱和参照物溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与采用本实施例色谱条件 所建立的野菊花标准指纹图谱进行比较，并计算相似度；采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和对照品溶液分别进行测试，并分别记录供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图，根据所记录的供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量。
其中，HPLC测试的色谱条件均如下：分别取待测溶液20μL注入高效液相色谱仪，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙睛为流动相的有机相，以体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90％线性改变至85％，5～25min，水相体积百分比从85％线性改变至80％，25～40min，水相体积百分比从80％线性改变至70％，40～50min，水相体积百分比从70％线性改变至30％，50～60min，水相体积百分比从30％线性改变至30％，流速1.0mL/min；柱温：40℃；检测波长：334nm。
本实施例的野菊花样品的测试结果如表20所示，可见，野菊花样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度大于0.95，且蒙花苷含量大于0.8％，为优质野菊花药材，且其花形经测量，花形的平均直径小于4毫米：
表20野菊花指纹图谱的相似度、有效成分的含量和花形
实施例29
供试品溶液的制备：取野菊花药材粉末0.25g，精密称定，置于烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液50mL，称定重量，80℃回流提取2.0小时，冷至室温，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。参照物溶液的制备：取蒙花苷对照品适量，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液溶解，制成蒙花苷浓度为42.94μg/mL的参照物溶液。
对照品溶液的制备：取绿原酸对照品、木犀草苷对照品和蒙花苷对照品各适量，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液溶解，制成混合对照品溶液。其中，所得的混合对照品溶液中，绿原酸的浓度为21.74μg/mL、木犀草苷的浓度为10.27μg/mL、蒙花苷的浓度为42.94μg/mL。
采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和参照物溶液别进行测试，并记录供试品溶液的指纹图谱和参照物溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与采用本实施例色谱条件 所建立的野菊花标准指纹图谱进行比较，并计算相似度；采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和对照品溶液分别进行测试，并分别记录供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图，根据所记录的供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量。
其中，HPLC测试的色谱条件均如下：分别取各待测溶液20μL注入高效液相色谱仪，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为20∶20∶60的甲醇、四氢呋喃和乙腈的混合液为流动相的有机相，以磷酸钠缓冲水溶液为流动相的水相(pH＝6.0)，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90％线性改变至85％，5～25min，水相体积百分比从85％线性改变至80％，25～40min，水相体积百分比从80％线性改变至70％，40～50min，水相体积百分比从70％线性改变至30％，50～60min，水相体积百分比从30％线性改变至30％，流速1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：334nm。
本实施例的野菊花样品的测试结果如表21所示，可见，野菊花样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度大于0.95，且蒙花苷含量大于0.8％，为优质野菊花药材，且其花形经测量，花形的平均直径小于4毫米。
表21野菊花指纹图谱的相似度、有效成分的含量和花形
实施例30
本实施例中除HPLC测试的色谱条件中流动相的有机相为乙腈，水相为醋酸钠缓冲液(pH＝5.0)外，其余条件与实施例29相同。
本实施例的野菊花样品的测试结果如表22所示，可见，野菊花样品指纹图谱与采用本实施例色谱条件所建立的野菊花标准指纹图谱的相似度大于0.95，且蒙花苷含量大于0.8％，为优质野菊花药材，且其花形经测量，花形的平均直径小于4毫米。
表22野菊花指纹图谱的相似度、有效成分的含量和花形
Claims (8)
1.一种野菊花指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：精密称定野菊花药材粉末，精密加入体积百分比浓度为30%～100%的甲醇水溶液，提取，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
（2）参照物溶液的制备：取蒙花苷对照品适量，用体积百分比浓度为30%～100%的甲醇水溶液溶解，制成蒙花苷浓度为12.7～202.9μg/mL的参照物溶液；
（3）测定：采用高效液相色谱法HPLC对参照物溶液和供试品溶液分别进行检测，并记录供试品溶液的指纹图谱和参照物溶液的指纹图谱；其中，采用HPLC进行测试包括如下色谱条件：
a，色谱柱的填料采用十八烷基硅烷键合硅胶；
b，采用有机相和水相的混合液作为流动相进行梯度洗脱，其中，以乙腈为流动相的有机相，以磷酸水溶液为流动相的水相，且梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90%线性改变至85%，5～25min，水相体积百分比从85%线性改变至80%，25～40min，水相体积百分比从80%线性改变至70%，40～50min，水相体积百分比从70%线性改变至30%，50～60min，水相体积百分比从30%线性改变至30%；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长为334nm；所述磷酸水溶液中酸的体积百分比浓度为0.025%～0.1%。
2.如权利要求1所述的野菊花指纹图谱的测定方法，其特征在于，步骤（1）中，所述精密称定的野菊花药材粉末为0.05g～2.5g，精密加入的体积百分比浓度为30%～100%的甲醇水溶液的量为10～500mL；所述提取选自回流提取、超声提取和索式提取。
3.如权利要求2所述的野菊花指纹图谱的测定方法，其特征在于，所述回流提取的条件为：60～100℃回流提取0.5～4.0小时，冷至室温，并用体积百分比浓度为30～100%的甲醇水溶液补足减失的重量；所述超声提取的条件为：超声提取5～60分钟，冷至室温，并用体积百分比浓度为30～100%的甲醇水溶液补足减失的重量或者定容。
4.一种野菊花的检测方法，包括采用权利要求1-3任一所述的野菊花指纹图谱的测定方法得到野菊花的指纹图谱，采用与野菊花指纹图谱的测定方法相同的条件得到野菊花的标准指纹图谱，将得到的野菊花的指纹图谱与野菊花的标准指纹图谱进行相似度比较；还包括野菊花中有效成分的含量测定。
5.如权利要求4所述的野菊花的检测方法，其特征在于，采用与权利要求1所述的野菊花指纹图谱的测定方法相同的条件得到野菊花的标准指纹图谱，所述野菊花的标准指纹图谱包括18个共有指纹峰，以蒙花苷色谱峰12#峰（S峰）为内参比峰，其他17个共有指纹峰的相对保留时间依次为1#峰（0.162±0.005）、2#峰（0.216±0.005）、3#峰（0.543±0.005）、4#峰（0.570±0.005）、5#峰（0.650±0.005）、6#峰（0.693±0.005）、7#峰（0.733±0.005）、8#峰（0.793±0.005）、9#峰（0.804±0.005）、10#峰（0.842±0.005）、11#峰（0.984±0.005）、13#峰（1.031±0.005）、14#峰（1.078±0.005）、15#峰（1.136±0.005）、16#峰（1.148±0.005）、17#峰（1.155±0.005）、18#峰（1.159±0.005）。
6.如权利要求4所述的野菊花的检测方法，其特征在于，所述有效成分为绿原酸、木犀草苷和蒙花苷中的一种或多种成分。
7.如权利要求4所述的野菊花的检测方法，其特征在于，所述野菊花中有效成分的含量测定具体包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：精密称定野菊花药材粉末0.05g～2.5g，精密加入体积百分比浓度为30%～100%甲醇水溶液10～500mL，提取，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：选取绿原酸对照品、木犀草苷对照品和蒙花苷对照品中的一种或多种对照品适量，用体积百分比浓度为30%～100%的甲醇水溶液溶解，制成单一对照品溶液或者混合对照品溶液；
（3）测定：采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和对照品溶液分别进行检测，并分别记录供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图；其中，采用HPLC进行测试包括如下色谱条件：
a，色谱柱的填料采用十八烷基硅烷键合硅胶；
b，采用有机相和水相的混合液作为流动相进行梯度洗脱；其中，以乙腈为流动相的有机相，以磷酸水溶液为流动相的水相，且梯度洗脱的条件为：0～5min，水相体积百分比从90%线性改变至85%，5～25min，水相体积百分比从85%线性改变至80%，25～40min，水相体积百分比从80%线性改变至70%，40～50min，水相体积百分比从70%线性改变至30%，50～60min，水相体积百分比从30%线性改变至30%；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长为334nm；所述磷酸水溶液中酸的体积百分比浓度为0.025%～0.1%；
（4）根据所记录的供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量。
8.如权利要求7所述的野菊花的检测方法，其特征在于，
所述单一对照品溶液为蒙花苷的单一对照品溶液、绿原酸的单一对照品溶液或木犀草苷的单一对照品溶液；所述蒙花苷的单一对照品溶液中蒙花苷的浓度为12.7～202.9μg/mL；所述绿原酸的单一对照品溶液中绿原酸的浓度为2.0～32.4μg/mL；所述木犀草苷单一对照品溶液中木犀草苷的浓度为1.0～15.6μg/mL；
所述混合对照品溶液为包含蒙花苷的混合对照品溶液，其中，绿原酸的浓度为2.0～32.4μg/mL、木犀草苷的浓度为1.0～15.6μg/mL、蒙花苷的浓度为12.7～202.9μg/mL。
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