CN116593606B - 一种分离检测拉考沙胺中间体有关物质的方法 - Google Patents

一种分离检测拉考沙胺中间体有关物质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种分离检测拉考沙胺中间体有关物质的方法。本发明采用低吸收的流动相体系，提高了紫外吸收较弱的物质及其杂质在末端波长的灵敏度，建立洗脱梯度，实现拉考沙胺中间体与多种杂质包括潜在杂质地有效分离与检测，可应用于拉考沙胺制备中，严格控制拉考沙胺中间体的纯度及各杂质的含量，提高药品质量。

Description

一种分离检测拉考沙胺中间体有关物质的方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种高效分离检测拉考沙胺中间体有关物质的方法。
背景技术
拉考沙胺是一种新型N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体甘氨酸位点拮抗剂，由于其快速吸收、生物利用度高、药物相互作用少等优点,被批准用于成人和青少年局灶性癫痫患者的辅助治疗和单药治疗。
在拉考沙胺中间体合成的过程中，不可避免的出现反应物料、工艺杂质、副产物等各种杂质，如杂质INT2、杂质INT3-1、杂质INT3-3、杂质INT3-4、杂质INT3-5、杂质INT3-6、杂质INT3-7、杂质I、杂质苯甲醛、杂质苯甲醇、杂质苄胺、杂质二苄胺等，可直接影响后续反应，进而影响成品纯度，因此，需严格监控中间体的纯度及各杂质的含量。
目前拉考沙胺中间体有关物质的液相检测方法，色谱峰峰形欠佳，有色谱峰重合发生，不能将拉考沙胺中间体与杂质有效的分离，从而无法准确反映出拉考沙胺中间体中有关物质的含量。且目前的检测方法只能检测一种或少数几种杂质，无法实现一次性分离检测中间体和多种杂质，检测效率较低。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种分离检测拉考沙胺中间体有关物质的方法。本发明提供的检测方法，可实现拉考沙胺中间体与多个有关物质有效分离与检测，包括杂质INT2、INT3-1、INT3-3、INT3-7等，专属性及灵敏度好，能满足该物质的纯度检测及各杂质定量检测要求。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种分离检测拉考沙胺中间体有关物质的方法，所述方法为反相液相色谱法，色谱条件包括：色谱柱固定相为C18色谱柱，流动相A为pH1.9-5.0的0.0002％-0.3％磷酸水溶液(v/v)，流动相B为乙腈，线性梯度洗脱，流动相A与流动相B初始比例为67-87:33-13，流动相流速为0.5-1.5mL/min，检测波长为190-220nm。
本发明采用低吸收的流动相体系，提高了紫外吸收较弱的物质及其杂质在末端波长的灵敏度，结合线性洗脱梯度，实现了在末端检测波长下主成分与多个潜在杂质的有效分离，能够满足拉考沙胺中间体该物质的纯度检测及各杂质定量检测要求。
优选的，所述C18色谱柱为C18 4.6mm×150mm，5μm色谱柱或效能相当的色谱柱。
优选的，所述色谱条件还包括柱温10-40℃，进样体积5-50μL。
优选的，所述流动相A和流动相B初始比例为77:23。
优选的，所述所述流速为0.9-1.1mL/min，所述线性梯度洗脱的顺序为：
0～3min，流动相为77％流动相A+23％流动相B；
3～7min，流动相B的比例由23％线性增加至33％；
7～20min，流动相为67％流动相A+33％流动相B；
20～30min，流动相B的比例由33％线性增加至90％；
30～35min，流动相为10％流动相A+90％流动相B；
35.1～40min，流动相为77％流动相A+23％流动相B。
优选的，所述检测波长为200-210nm。
优选的，所述有关物质包括：杂质INT2、杂质INT3-1、杂质INT3-3、杂质INT3-4、杂质INT3-5、杂质INT3-6、杂质INT3-7、杂质I、杂质苯甲醛、杂质苯甲醇、杂质苄胺、杂质二苄胺的至少一种。
另一方面，本发明还提供所述的方法在分离检测拉考沙胺中间体有关物质中的应用。
优选的，应用时包括如下步骤：
S1、以流动相为溶剂，配制待测样品溶液；
S2、用上述的反相液相色谱法对待测样品溶液进行有关物质检测。
待测样品溶液包括供试品溶液和标准品混合溶液，其制备可按以下方法进行：
供试品溶液：取供试品适量，精密称定，用溶剂(流动相)溶解并稀释制成每1mL中约含1mg的溶液；
标准品混合溶液：取拉考沙胺中间体、杂质对照品适量，精密称定，用溶剂(流动相)溶解并定量稀释制成每1mL中约含拉考沙胺中间体1mg与各杂质均约0.2％～0.7％的混合溶液。
与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：本发明提供的液相色谱法首次实现了拉考沙胺中间体多个有关物质的分离与检测，主成分与各杂质及各杂质间的分离度均符合要求，方法专属性良好，并具有灵敏度高、重现性好、准确度高等优点，可用于药品(如拉考沙胺)的质量检测，进而有助于提高拉考沙胺的质量、保证用药安全。
附图说明
图1为本发明实验例中空白溶剂色谱图；
图2为本发明实验例中混合溶液的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
液相色谱仪：Waters高效液相色谱仪；
色谱柱：C18 4.6mm×150mm 5μm(资生堂MGII)；
柱温：30℃；
流动相：流动相A(pH3.6的磷酸水溶液，0.02％v/v)：乙腈(77:23)；
流速：1.0mL/min；
紫外检测器检测波长：205nm；
进样体积：20μL；
空白溶剂：流动相A：乙腈(77:23)；
供试品溶液：取供试品适量，精密称定，用乙腈-流动相A(23:77)溶解并稀释制成每1mL中约含1mg的溶液。
标准品混合溶液：取拉考沙胺中间体、各杂质对照品(杂质INT2、杂质INT3-1、杂质INT3-3、杂质INT3-4、杂质INT3-5、杂质INT3-6、杂质INT3-7、杂质I、杂质苯甲醛、杂质苯甲醇、杂质苄胺、杂质二苄胺)适量，精密称定，用乙腈-流动相A(23:77)溶剂溶解并定量稀释制成每1mL中分别约含拉考沙胺中间体1mg与各杂质均约为200μg的混合溶液。
按照上述色谱条件，精密量取空白溶液和混合溶液各20μL，将其注入液相色谱仪，进行线性梯度洗脱，洗脱时间见表1，记录色谱图。
表1线性梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 77 23
3 77 23
7 67 33
20 67 33
30 10 90
35 10 90
35.1 77 23
40 77 23
标准品混合溶液色谱图见图1、图2。实验数据见表2。
结论：空白溶剂不干扰有关物质的检测，主成分与相邻杂质的分离度均大于1.5，各杂质与相邻杂质分离度均大于1.2，均符合要求，方法专属性良好。
表2标准品混合溶液各成分分离度检测结果
实施例2
本实施例提供了拉考沙胺中间体及有关物质的反相液相色谱分离检测定量限试验。
拉考沙胺中间体对照品贮备液：取拉考沙胺中间体对照品适量，精密称定，用乙腈-pH3.6磷酸水溶液(23:77)溶解并稀释制成每1mL中约含100μg的溶液，摇匀。
拉考沙胺中间体各杂质对照品贮备液：取杂质I、INT3-3、INT3-4、INT3-5、INT3-6、苄胺、二苄胺、苯甲醛和苯甲醇对照品适量，精密称定，分别用乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中约含40μg的溶液，摇匀。取INT2、INT3-1和INT3-7对照品适量，精密称定，分别用乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中约含500μg、100μg和500μg的溶液，摇匀。
定量限溶液：精密量取上述拉考沙胺中间体对照品储备液1mL、拉考沙胺中间体各杂质对照品贮备液：杂质I 0.8mL、INT2 6mL、INT3-1 0.6mL、INT3-31.6mL、INT3-4 0.6mL、INT3-5 1.6mL、INT3-6 3.6mL、INT3-7 1mL、苄胺1.5mL、二苄胺3mL、苯甲醇0.8mL和苯甲醛0.4mL，置同一100mL量瓶中，用乙腈-流动相A(23:77)稀释至刻度，摇匀。精密量取1mL置100mL量瓶中，用乙腈-流动相A(23:77)稀释至刻度，即得。
色谱条件同实施例1，峰高为基线噪音的10倍时为定量限，峰高为基线噪音的3倍时为检测限。检测限、定量限结果见表3、表4。
试验结论：主成分及各杂质灵敏度均满足检测要求；定量限溶液重复配制6次，信噪比均大于10，峰面积的RSD均小于10.0％，表明方法的定量限重复性良好。
表3定量限和检测限试验结果
表4定量限重复性检测结果
实施例3
本实施例提供了拉考沙胺中间体及有关物质的反相液相色谱分离检测线性试验。
拉考沙胺中间体对照品贮备液：取拉考沙胺中间体对照品适量，精密称定，用乙腈-流动相A(23:77)溶解并稀释制成每1mL中约含100μg的溶液，摇匀。
拉考沙胺中间体各杂质对照品贮备液：取杂质I、INT3-3、INT3-4、INT3-5、INT3-6、苄胺、二苄胺、苯甲醛和苯甲醇对照品适量，精密称定，分别用乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中约含40μg的溶液，摇匀。取INT2、INT3-1和INT3-7对照品适量，精密称定，分别用乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中约含500μg、100μg和500μg的溶液，摇匀。
系列对照品溶液：取拉考沙胺中间体以及其各杂质对照品贮备液，用乙腈-流动相A(23:77)进行梯度稀释，分别配制成主成分及各杂质浓度约为供试品浓度(1mg/mL)的10％、7.5％、5％、4％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.2％至定量限浓度范围内的系列对照品混合溶液。
照实施例1色谱条件进行检测：精密量取各对照品溶液各20μL，将其注入液相色谱仪，记录色谱图。线性结果见表5。
试验结论：主成分和各杂质线性方程相关系数r均大于0.990，表明本方案提供的方法，各组分浓度与峰面积线性关系良好。
表5线性试验结果
实施例4
本实施例提供了拉考沙胺中间体及有关物质的反相液相色谱分离检测准确度试验。
拉考沙胺中间体各杂质对照品贮备溶液：
取杂质INT3-1、INT2对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1mL中均约含100μg的对照品溶液，作为对照品贮备液①。
取杂质INT3-7对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1mL中约含100μg的对照品溶液，作为对照品贮备液②。
取杂质INT3-3、INT3-4、INT3-5、INT3-6、杂质I、苯甲醇、苯甲醛、苄胺、二苄胺对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1mL均约含50μg的对照品混合溶液，作为对照品贮备液③。
精密称取拉考沙胺中间体约25mg，置25mL量瓶中，平行称取9份，分别加入适量乙腈-流动相A(23:77)溶解，然后加入杂质对照品贮备液①0.25mL、1.2mL、1.8mL，杂质对照品贮备液②0.25mL、10mL、15mL，杂质对照品贮备液③0.25mL、1.2mL、1.8mL，分别加上述溶剂稀释至刻度，每个浓度平行配制3份，作为回收率供试品溶液。
按照实施例1色谱条件，精密量取各回收率供试品溶液20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表6。
试验结论：各杂质回收率均在90％～110％范围，RSD均小于10％，表明本方案提供的方法准确度良好。
表6回收率检测结果
实施例5
本实施例提供了拉考沙胺中间体及有关物质的反相液相色谱分离检测重复性试验。
供试品溶液的配制同实施例1。按照实施例1的色谱条件对供试品溶液重复检测6次。重复性结果见下表。
试验结论：重复检测6次供试品溶液，各杂质检出量基本一致，表明该方法重复性良好。
表7重复性结果
实施例6
本实施例提供了拉考沙胺中间体及有关物质的反相液相色谱法耐用性试验。
在实施例1色谱条件的基础上，改变部分色谱条件。
混合溶液的配制同实施例1。分离度结果见表8。
试验结论：微调实施例1的色谱条件，拉考沙胺中间体与相邻杂质峰间分离度均大于1.5，各杂质间分离度均大于1.2，均符合要求，本发明提供的方法耐用性良好。
表8不同色谱条件分离度结果
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，不是全部的实施例，以上实施例只适用于帮助理解本发明实施例的原理，不应理解为对本发明的限制。同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明技术方案以及实施例，还可以做出变形和改进，所有未超出权利要求所述的变形或改进均应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种分离检测拉考沙胺中间体有关物质的方法，其特征在于，所述方法为反相液相色谱法，色谱条件包括：色谱柱固定相为C18色谱柱，流动相A为pH1.9-5.0的0.0002％-0.3％v/v磷酸水溶液，流动相B为乙腈，线性梯度洗脱，流动相流速为0.5-1.5mL/min，检测波长为190-220nm；
所述有关物质包括：杂质INT2、杂质INT3-6、杂质I、杂质苯甲醛、杂质苯甲醇、杂质苄胺和杂质二苄胺；
所述线性梯度洗脱的顺序为：
0～3min，流动相为77％流动相A+23％流动相B；
3～7min，流动相B的比例由23％线性增加至33％；
7～20min，流动相为67％流动相A+33％流动相B；
20～30min，流动相B的比例由33％线性增加至90％；
30～35min，流动相为10％流动相A+90％流动相B；
35.1～40min，流动相为77％流动相A+23％流动相B。
2.根据权利要求1所述的分离检测拉考沙胺中间体有关物质的方法，其特征在于，所述C18色谱柱为C18 4.6mm×150mm，5μm色谱柱。
3.根据权利要求1所述的分离检测拉考沙胺中间体有关物质的方法，其特征在于，色谱条件还包括柱温10-40℃，进样体积5-50μL。
4.根据权利要求1所述的分离检测拉考沙胺中间体有关物质的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.9-1.1mL/min。
5.根据权利要求1所述的分离检测拉考沙胺中间体有关物质的方法，其特征在于，所述检测波长为200-210nm。
6.权利要求1-5任一项所述的方法在分离检测拉考沙胺中间体有关物质中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、以流动相为溶剂，配制待测样品溶液；
S2、用权利要求1-5任一项所述的反相液相色谱法对待测样品溶液进行有关物质检测。
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