CN112379007A

CN112379007A - 一种dl-泛解酸内酯含量的检测方法

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Publication number: CN112379007A
Application number: CN202011033182.4A
Authority: CN
Inventors: 王栋; 范亚东; 段小瑞; 赵毅; 汪洪湖
Original assignee: Anhui Tiger Biotechnology Co ltd
Current assignee: Anhui Tiger Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2021-02-19

Abstract

本发明提供了一种DL‑泛解酸内酯含量的检测方法，所述检测方法为高效液相色谱法；在所述液相色谱法中，流动相为磷酸盐缓冲液与乙腈的混合溶液，色谱柱选自亲水性色谱柱。本发明提供的检测方法可以检测反应过程中以及反应结束后的反应液中的DL‑泛解酸内酯的含量，可以实现DL‑泛解酸内酯和各杂质很好地分离，即DL‑泛解酸内酯的色谱峰和各杂质峰之间能够实现很好地分离；本发明提供的检测方法适用于检测利用氰化钠制备DL‑泛解酸内酯的反应液中DL‑泛解酸内酯的含量，可以实现准确定量化，检测灵敏度高，检测限较低。

Description

一种DL-泛解酸内酯含量的检测方法

技术领域

本发明属于色谱柱检测技术领域，涉及一种DL-泛解酸内酯含量的检测方法。

背景技术

DL-泛解酸内酯是维生素B5泛酸及其盐的主要原料之一，同时也是化妆品中保湿剂泛醇的主要原料。在DL-泛解酸内酯的实际生产中需要对其中间产品、成品进行取样检验，以了解杂质情况。

在现有技术中，DL-泛解酸内酯的制备方法有以下几种，(1)采用异丁醛、甲醛和氰化钠为原料经过化学合成获得DL-泛解酸内酯；(2)异丁醛-甲醛-氢氰酸法，以异丁醛和甲醛经羟甲基化制得α,α-二甲基-β-羟基丙醛，再与氢氰酸发生氰醇化反应生成α,γ-二甲基-β,β-二甲基丁腈，经酸水解得到α,γ-二甲基-β,β-二甲基丁酸(泛解酸)，然后将其脱水内酯化即得DL-泛解酸内酯；(3)异丁醛-乙醛酸法有两种不同工艺，缩合-歧化工艺由异丁醛和乙醛酸进行羟醛缩合，再与另一分子乙醛酸歧化、脱水环化生成泛解酸内酯，缩合-加氢工艺则是将羟醛缩合产物在250bar的高压下进行催化加氢制备DL-泛解酸内酯。

在目前的对制备DL-泛解酸内酯的反应液的检测方法中，由于氰化钠反应的反应液中副反应较多，杂质较多，杂质谱过于复杂而导致对其的检测方法较少，难以对主成分进行定量分析；但其下游产物在投料时对原料投入比例有比较精确的要求，基于此，希望提供一种可以精确检测利用氰化钠合成的反应液中DL-泛解酸内酯含量的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DL-泛解酸内酯含量的检测方法；本发明提供的检测方法可以检测反应过程中以及反应结束后的反应液中的DL-泛解酸内酯的含量，可以实现DL-泛解酸内酯和各杂质很好地分离，即DL-泛解酸内酯的色谱峰和各杂质峰之间能够实现很好地分离；本发明提供的检测方法适用于检测利用氰化钠制备DL-泛解酸内酯的反应液中DL-泛解酸内酯的含量，可以实现准确定量化，检测灵敏度高，检测限较低。

为达到此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种DL-泛解酸内酯含量的检测方法，所述检测方法为高效液相色谱法。

在所述液相色谱法中，流动相为磷酸盐缓冲液与乙腈的混合溶液，色谱柱选自亲水性色谱柱。

本发明所述磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为92:8～94:6，例如92.5:7.5、93:7、93.5:6.5等。

合成DL-泛解酸内酯的主要反应副产物和降解杂质，是DL-泛解酸内酯成品中影响成品含量的关键杂质，对其进行准确检测能够有助于控制成品中的杂质含量，从而提高成品质量。

在本发明提供的检测方法中，所选用的高效液相色谱法中的流动相能使DL-泛解酸内酯色谱峰以及各杂质峰之间均实现很好的分离，能够同时准确测出待测样品中多种杂质的含量，检测灵敏度高、检测限低，便于在DL-泛解酸内酯的生产过程对中间产品以及成品进行多种杂质检测。并且本发明所采用的高效液相色谱法检测时间短，能够显著提高检测的工作效率。

为了得到更完善的峰形以及DL-泛解酸内酯和杂质具有更好的分离度，所述磷酸盐缓冲液和所述乙腈的体积比为92:8。

作为本发明的一种优选技术方案，以所述混合溶液的总体积为100％计，所述磷酸盐缓冲液的含量为92-94％，例如92.5％、93％、93.5％等，优选92％。

作为本发明的一种优选技术方案，所述磷酸盐缓冲液的pH值为2.9～3.1，优选3。

作为本发明的一种优选技术方案，所述磷酸盐缓冲液为0.02mol/L的硫酸二氢钾缓冲液。

将0.02mol/L的硫酸二氢钾缓冲液与乙腈混合用做流动相，可以使检测基线平稳，DL-泛解酸内酯色谱峰及杂质色谱峰能够有效分离、峰形良好，在同等洗脱能力下峰形优于甲醇与磷酸二氢钾的混合流动相。

为了确保得到的DL-泛解酸内酯和杂质的色谱峰分别具有60％以上的吸收强度，所述高效液相色谱法的检测波长为210～230nm。

所述高效液相色谱法的检测波长为230nm，在该波长下，主峰附近的杂质峰响应值很低，且主峰能保持210nm下60％以上的吸收强度。

所述高效液相色谱法的杂质检测波长为210nm，在该波长下，杂质响应值较高，且主峰能保持和杂质有较好的分离度。

为了进一步增加DL-泛解酸内酯和杂质的分离度，所述高效液相色谱法的柱温为30～40℃，例如32℃、34℃、35℃、38℃等。

上述柱温范围相较于室温可增加高效液相色谱中杂质和DL-泛解酸内酯的分离度，且呈现反常规的温度越高，杂质和主峰的分离度越高的现象。

作为本发明的一种优选技术方案，所述流动相的流速为0.9-1.1mL/min，例如1.0mL/min。

作为本发明的一种优选技术方案，所述高效液相色谱法的色谱柱选自亲水性十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，例如安捷伦SB-aq柱。

作为本发明的一种优选技术方案，所述高效液相色谱法的进样量为10μL。

本发明提供的测试方法可以测试的待测样品为含有DL-泛解酸内酯的反应液，进一步优选为利用氰化钠合成DL-泛解酸内酯的反应液。

本发明的检测方法既可以检测反应过程中的反应液中各成分的含量，又可以测试反应结束后的反应液中的各组分的含量，具有实时监测反应进行效果的作用，能够显著提高检测的工作效率。

作为本发明的一种具体实施方式，所述检测方法包括如下步骤：

(1)配置对照液样品；

(2)利用高效液相色谱法对所述对照液样品和待测样品进行检测，根据测试得到的峰面积带入外标法计算公式，计算所述待测样品中DL-泛解酸内酯的含量。

为了更好地实现对于DL-泛解酸内酯含量的检测，所述对照液样品和待测样品的浓度各自独立的选自0.5-1.5mg/mL，例如0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL等。

本发明所述对照液样品和待测样品的溶剂各自独立的选自超纯水或所述流动相。

作为本发明的另一种具体实施方式，所述检测方法包括如下步骤：

(1)配置对照液样品，利用高效液相色谱法对所述对照液样品进行检测，记录色谱图；

(2)以对照液样品中DL-泛解酸内酯的浓度(mg/mL)为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到一次线性回归方程；

(3)利用高效液相色谱法对待测样品进行检测，根据得到的峰面积带入一次线性回归方程，计算所述待测样品中DL-泛解酸内酯的含量。

在优选的浓度范围内可以确保所述DL-泛解酸内酯的对照品充分溶解，并且以水作为溶剂时不会对基线产生影响，主峰也不会出现溶剂效应，使检测过程中基线平稳，检测结果准确度高。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的检测方法采用高效液相色谱法，样品的处理方法简单，操作便捷，工作效率高；

(2)本发明提供的检测方法可以检测反应过程中以及反应结束后的反应液中的DL-泛解酸内酯的含量，可以实现DL-泛解酸内酯和各杂质很好地分离；

(3)本发明提供的检测方法适用于检测利用氰化钠制备DL-泛解酸内酯的反应液中DL-泛解酸内酯的含量，对DL-泛解酸内酯的含量要求极低，无需经过前处理提纯等，可以直接检测反应液中各成分的含量，可以实现准确定量化，检测灵敏度高，检测限较低。

附图说明

图1是实施例1和实施例2中的待测样品的高效液相色谱检测图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

一种DL-泛解酸内酯含量的检测方法如下：

(1)取DL-泛解酸内酯对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成1mL含10.53mg对照品的溶液作为标准储备液；精密量取标准储备液0.5mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.5mL分别置于5个10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，分别进样20μL，记录色谱图；

(2)以DL-泛解酸内酯(c,mg/mL)为横坐标，对应峰面积(mAU·s)为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程为y＝367.32x，R＝0.9995(n＝5)；

(3)取DL-泛解酸内酯反应液适量，加流动相稀释制成1.0mg/mL左右的溶液，利用高效液相色谱法对其进行检测，记录色谱图，将峰面积带入一次线性回归方程y＝367.32x中，即可计算得到待测样品中DL-泛解酸内酯的含量，其中，高效液相色谱法参数如下：

流动相：0.02mol/L的磷酸二氢钾缓冲液(pH＝3.0):乙腈＝92:8(体积比)；

流动相流速：1mL/min；

检测波长：230nm；

色谱柱：安捷伦SB-aq色谱柱(亲水十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱)；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

实施例2

与实施例1的区别在于，本实施例的检测波长为210nm。

结果与讨论1

图1为实施例1和实施例2中的待测样品的高效液相色谱检测图，由图可知，检测波长为210-230nm时，杂质峰和主峰均具有较好的分离度，且在230nm的检测波长下，主要降解杂质的峰面积均有明显减少，而主峰面积仅降低约30％左右，因此优选在230nm的检测波长下检测DL-泛解酸内酯的含量。

实施例3

对于待测样品，同一人连续取样6次分别取样，配制成浓度范围在0.5-1.5mg/mL浓度的样品，利用实施例1的检测方法进行检测，检测结果见表1：

表1

样品	1	2	3	4	5	6
							外表含量/％	59.6	59.8	59.5	59.7	59.6	59.7

由表1可知，本申请提供的检测方法重复性好，RSD＝0.5％。

实施例4

对于待测样品，两个人分三次称取同一样品3次，配制成浓度范围在0.5-1.5mg/mL浓度的样品，利用实施例1的检测方法进行检测，检测结果见表2：

表2

检测结果/％	1	2	3
				实验员A	59.6	59.8	59.5
实验员B	59.6	59.7	59.8

由表2可知，本申请提供的检测方法中间精密度良好，RSD＝0.6％。

实施例5

精密称取已知含量的DL-泛解酸内酯样品约0.2g(六份)，分别置6个100mL量瓶中，按外标法计算出含量。再分别精密量取6个供试品溶液各50mL，分别至100mL容量瓶中，再分别加入约50mg DL-泛解酸内酯标准品，用流动相定容至100mL，分别进样、测定，计算回收率，见表3：

表3

由表3可知利用本发明的检测方法平均回收率为99.4％，RSD＝0.5％，说明准确度良好。

实施例6

取供试溶液2份，分别在放置4h、8h、16h、24h后进行测试，记录峰面积见表4：

表4

由表4可知，DL-泛解酸内酯的流动相溶液稳定性较好，日内误差较小。水溶液的稳定性RSD＝0.7％，流动相溶液稳定性RSD＝0.7％。

分析例1

取DL-泛解酸内酯反应液适量，加流动相稀释制成1.0mg/mL溶液，进行DAD扫描，参数如下：

流动相流速：1mL/min；

检测波长：210-230nm；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

分析例2-3

与实施例1的区别在于，在本实施例中，柱温为25℃(分析例2)、35℃(分析例3)。

分析例4-5

与分析例1的区别在于，在本分析例中，磷酸二氢钾缓冲液:乙腈＝95:5(分析例4)、90:10(分析例5)。

分析例6-7

与分析例1的区别在于，在本分析例中，磷酸二氢钾缓冲液的pH值为2.8(分析例6)、3.2(分析例7)

对比分析例1

与分析例1的区别在于，在本对比分析例中，色谱柱为普通十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(安捷伦SB-C₁₈)。

对比分析例2

与分析例1的区别在于，在本对比分析例中，将流动相中的乙腈替换为甲醇。

结果与讨论2

对分析例1-7和对比分析例1-2扫描得到的DAD扫描图进行分析，记录杂质和主峰(DL-泛解酸内酯)的分离度见表5：

表5

样品	前杂与主峰分离度	后杂与主峰分离度
			分析例1	2.4	2.4
分析例2	2.2	2.2
			分析例3	2.5	2.5
分析例4	2.3	2.2
			分析例5	2.2	2.2
分析例6	2.4	2.4
			分析例7	2.5	2.5
对比分析例1	1.5	2.2
			对比分析例2	2.0	1.9

注：前杂指的是保留时间比主峰小的杂质峰，后杂指的是保留时间比主峰大的杂质峰。

由分析例和结果可知，本发明提供的检测方法中可以使反应液中的杂质与DL-泛解酸内酯很好地分离，在高效液相色谱法中，主峰与杂质峰均具有较优异的分离度。

由分析例1和分析例2-3的对比可知，杂质和DL-泛解酸内酯的分离度随温度升高而增大，由于30℃相对较低，且为温度范围中点，满足温度波动稳定性，且杂质分离较好，优选30℃为最佳柱温。

由分析例1和分析例4-5的对比可知，在流动相所选用的混合溶液中，乙腈含量为8％具有较好的分离度。

由分析例1和分析例6-7的对比可知，pH为3.0和pH为3.2时主峰和杂质峰的分离效果都较好，但在实验过程中发现pH的变化会造成部分杂质出现较大程度的保留时间变化，故优选pH为2.9～3.1范围内以保证检测的稳定性。

由分析例1和对比分析例1的对比可知，本发明选用的亲水性十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱在杂质分离度上远远高于普通十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

在分析例1和分析对比例2的对比中发现，在相同洗脱能力下，乙腈的峰形要明显好于甲醇，理论塔板数更高，且杂质和主峰的分离度更好。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的DL-泛解酸内酯含量的检测方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种DL-泛解酸内酯含量的检测方法，其特征在于，所述检测方法为高效液相色谱法；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液和乙腈的体积比为92:8～94:6，优选92:8。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，以所述混合溶液的总体积为100％计，所述磷酸盐缓冲液的含量为92-94％，优选92％。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液为0.02mol/L的硫酸二氢钾缓冲液；

和/或，所述磷酸盐缓冲液的pH值为2.9～3.1，优选3。

5.根据权利要求1-4中的任一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的检测波长为210～230nm；

和/或，所述高效液相色谱法的柱温为30～40℃。

6.根据权利要求1-5中的任一项所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.9-1.1mL/min；

和/或，所述高效液相色谱法的进样量为10μL。

7.根据权利要求1-6中的任一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱柱选自亲水性十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

8.根据权利要求1-7中的任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的待测样品为含有DL-泛解酸内酯的反应液，进一步优选为利用氰化钠合成DL-泛解酸内酯的反应液。

9.根据权利要求1-8中的任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

(1)配置对照液样品；

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述对照液样品和待测样品的浓度各自独立的选自0.5-1.5mg/mL；

优选地，所述对照液样品和待测样品的溶剂各自独立的选自超纯水或所述流动相。