CN107179370B - 一种采用高效液相色谱法检测维生素c二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法 - Google Patents

一种采用高效液相色谱法检测维生素c二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法 Download PDF

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Abstract

一种采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法，采用如下色谱条件：氨基色谱柱，紫外检测器，流动相为体积比为40:60～60:40的磷酸盐缓冲溶液与乙腈混合液，其中磷酸盐缓冲溶液浓度为1～4‰，流速0.5～1.5ml/min，柱温20～40℃，检测波长205～215nm，进样量20μl。具有重现性强、灵敏度高、准确度高等优点，可快速、准确地测定维生素C发酵液中葡萄糖酸的含量，为提高“二步发酵法”维生素C生产工艺发酵收率的研究提供指导。

Description

一种采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液 中葡萄糖酸含量的方法
技术领域
本发明涉及一种检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法，特别是一种采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法。
背景技术
维生素C又称L-抗坏血酸，是人体必需的维生素，生理作用广泛，在医药和食品工业中均占有重要地位。目前国内普遍采用我国自主研发的“二步发酵法”生产，“二步发酵法”的第一步是单菌发酵，将D-山梨醇转化成L-山梨糖；第二步是混合菌发酵，通过普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)和巨大芽孢杆菌(俗称大菌)的共同作用将L-山梨糖转化成2-酮基 -L-古龙酸(2-KGA)。2-酮基-L-古龙酸再经过提取和转化生成维生素C。
为改善“二步发酵法”维生素C生产工艺第一、二步发酵效果，研究人员在培养基中加入葡萄糖，但葡萄糖有可能在发酵过程中转化成葡萄糖酸，从而对发酵带来一系列影响，为此需要迅速、准确地测定发酵液中葡萄糖酸的含量，以便采取针对性措施提高改善发酵效果，而“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液中含有山梨醇和山梨糖，第二步混合菌发酵发酵液中含有山梨糖和古龙酸，这些物质与葡萄糖、葡萄糖酸性质相近，分离十分困难，常规的化学分析方法很难快速进行分析测定，因此需要建立一种新的专用检测方法，以快速、准确、方便地测定维生素 C发酵液中葡萄糖酸的含量。
经检索，未见有专用的、检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种专用的、采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法，以快速、准确、方便地测定维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸的含量。
本发明的目的可以通过这样的技术方案来实现：
一种采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法，它采用如下色谱条件：
色谱柱：氨基色谱柱
检测器：紫外检测器
流动相：体积比为40:60～60:40的磷酸盐缓冲溶液与乙腈混合液，其中磷酸盐缓冲溶液浓度为1～4‰
流速：0.5～1.5ml/min
柱温：20～40℃
检测波长：205～215nm
进样量：20μl
是按下列步骤测定维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的：
一、制备供检发酵液溶液：精密量取维生素C二步发酵法的发酵液M ml，注入容量瓶中，加流动相稀释至10倍体积，摇匀，过滤，制成供检发酵液溶液；
二、制备对照品溶液：精密称取葡萄糖酸标准品N mg，加入容量瓶中，加流动相，溶解摇匀，过滤，制成1mg/ml的液体，作为对照品溶液；
三、取供检发酵液溶液注入液相色谱仪，和对照品溶液按照本方法的色谱条件进样，按外标法计算供检发酵液中葡萄糖酸的含量，即得维生素 C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸的含量。
本发明所提供的这种检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法，优选色谱条件：流动相的磷酸盐缓冲溶液浓度为2‰，磷酸盐缓冲溶液与乙腈的体积比为50:50，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为210nm。
本发明所提供的这种检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法，程序简单，易操作，由于山梨醇和葡萄糖在本方法中没有响应，不会产生干扰，而山梨糖、古龙酸与葡萄糖酸在本方法中可以得到有效分离，因此具有重现性强、灵敏度高、准确度高等优点，可以快速、准确地测定维生素C发酵液中葡萄糖酸的含量，为提高“二步发酵法”维生素C 生产工艺发酵收率的研究提供指导。
附图说明
图1为在本发明实施例的方法色谱条件下，山梨糖、古龙酸与葡萄糖酸的混合液的液相色谱图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，举出以下实施例和验证例，但本发明的保护范围并不仅仅局限于此，其要求保护的范围记载于权利要求的权项中。
实施例
本发明实施例提供一种采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法，它采用如下色谱条件：
色谱柱：LC-NH2 250mm×4.6mm色谱柱(氨基色谱柱)
检测器：紫外检测器
流动相：体积比为50:50的磷酸盐缓冲溶液与乙腈混合液，其中磷酸盐缓冲溶液浓度为2‰
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
检测波长：210nm
进样量：20μl
是按下列步骤测定维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的：
一、制备供检发酵液溶液：精密量取三批“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液各1份，各5.0ml；三批“二步发酵法”维生素C生产工艺第二步混合菌发酵发酵液各1份，各5.0ml，注入不同的 50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度(50ml)，摇匀，过滤，制成6份供检发酵液溶液；
二、制备对照品溶液：精密称取葡萄糖酸标准品50mg，加入50ml容量瓶中，加流动相至刻度(50ml)，溶解摇匀，过滤，制成1mg/ml的液体，作为对照品溶液；
三、分别取各供检发酵液溶液注入液相色谱仪，和对照品溶液按照本方法的色谱条件进样，按外标法计算供检发酵液中葡萄糖酸的含量，即得维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸的含量，结果见表1。
表1：维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的测定结果
批号 含量(mg/ml)
第一批“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液 10.18
第二批“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液 10.43
第三批“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液 10.21
第一批“二步发酵法”维生素C生产工艺第二步混合菌发酵发酵液 5.12
第二批“二步发酵法”维生素C生产工艺第二步混合菌发酵发酵液 5.03
第三批“二步发酵法”维生素C生产工艺第二步混合菌发酵发酵液 5.23
验证例
1、分离度
色谱条件：同实施例
实验方法：精密称取山梨糖、古龙酸、葡萄糖酸标准品各50mg，加入 50ml容量瓶中，加流动相至刻度(50ml)，溶解摇匀，过滤，制成山梨糖、古龙酸和葡萄糖酸含量各为1mg/ml的混合液，然后将上述混合液注入液相色谱仪，按照本方法实施例的色谱条件进样，记录色谱图，见附图1，山梨糖色谱峰保留时间为2.72分钟，古龙酸色谱峰保留时间为17.5分钟，葡萄糖酸色谱峰保留时间为19.4分钟，三种物质分离度良好，均在2以上。
实验结果表明：在本方法的实施过程中，山梨糖、古龙酸、葡萄糖酸三种物质能够得到有效分离。
2、线性试验
色谱条件：同实施例
实验方法：精密称取葡萄糖酸标准品200mg，加入100ml容量瓶中，加流动相至刻度(100ml)，溶解摇匀，过滤，作为储备液。再向上述储备液中加流动相，按1倍、1.25倍、2倍、4倍、8倍、16倍稀释，分别制成1、2、3、4、5、6号葡萄糖酸标准品溶液，然后分别取各葡萄糖酸标准品溶液注入液相色谱仪，按照本方法实施例的色谱条件进样，以峰面积及浓度作图，进行线性回归，得标准曲线方程，峰面积A＝0.424*C-10.95，相关系数r＝0.9995。
实验结果表明：葡萄糖酸在120～2000ug/ml的范围内，峰面积与进样量有良好的线性关系。
3、回收率
色谱条件：同实施例
一、精密量取已知葡萄糖酸含量的“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液6份，各5.0ml，注入不同的50ml容量瓶中，然后再精密称取葡萄糖酸标准品6份，各30mg，分别加入上述的50ml容量瓶中，加流动相至各50ml容量瓶刻度(50ml)，溶解摇匀，过滤，制成1、2、 3、4、5、6号供检发酵液溶液；
二、精密称取葡萄糖酸标准品50mg，加入50ml容量瓶中，加流动相至刻度(50ml)，溶解摇匀，过滤，制成1mg/ml的液体，作为对照品溶液；
三、分别取各供检发酵液溶液注入液相色谱仪，和对照品溶液按照本方法实施例的色谱条件进样，按外标法计算葡萄糖酸的回收率，结果如表 2所示。
表2：回收率测定结果
Figure GDA0002217754930000051
回收率：98.1～101.9％，平均回收率为99.6％，RSD为1.3％。
实验结果表明：本方法的回收率良好，准确度高。
4、重复性
色谱条件：同实施例
一、精密量取同一批“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液6份，各5.0ml，注入不同的50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度(50ml)，摇匀，过滤，制成7、8、9、10、11、12号供检发酵液溶液；
二、精密称取葡萄糖酸标准品50mg，加入50ml容量瓶中，加流动相至刻度(50ml)，溶解摇匀，过滤，制成1mg/ml的液体，作为对照品溶液；
三、分别取各供检发酵液溶液注入液相色谱仪，和对照品溶液按照本方法实施例的色谱条件进样，按外标法计算供检发酵液中葡萄糖酸的含量，结果见表3。
表3：供检发酵液重复性的检测结果
组别 7 8 9 10 11 12 RSD(％)
含量(mg/ml) 10.18 10.24 10.32 10.46 10.27 10.39 0.99
重复性试验RSD值为0.99％，小于2.0％。
实验结果表明：本方法的重复性好。
结论：本发明所提供的采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法专属性强、灵敏度高、精密度好，能够快速、准确地测定维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸的含量。

Claims (3)

1.一种采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法，其特征在于它采用如下色谱条件：
色谱柱：氨基色谱柱
检测器：紫外检测器
流动相：体积比为40:60～60:40的磷酸盐缓冲溶液与乙腈混合液，其中磷酸盐缓冲溶液浓度为1～4‰
流速：0.5～1.5ml/min
柱温：20～40℃
检测波长：205～215nm
进样量：20μl
是按下列步骤测定维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的：
一、制备供检发酵液溶液：精密量取维生素C二步发酵法的发酵液M ml，注入容量瓶中，加流动相稀释至10倍体积，摇匀，过滤，制成供检发酵液溶液；
二、制备对照品溶液：精密称取葡萄糖酸标准品N mg，加入容量瓶中，加流动相，溶解摇匀，过滤，制成1mg/ml的液体，作为对照品溶液；
三、取供检发酵液溶液注入液相色谱仪，和对照品溶液按照本方法的色谱条件进样，按外标法计算供检发酵液中葡萄糖酸的含量，即得维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸的含量。
2.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法，其特征在于它采用如下色谱条件：
流动相的磷酸盐缓冲溶液浓度为2‰，磷酸盐缓冲溶液与乙腈的体积比为50:50，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为210nm。
3.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法，其特征在于它采用如下色谱条件：
色谱柱：LC-NH2 250mm×4.6mm色谱柱
检测器：紫外检测器
流动相：体积比为50:50的磷酸盐缓冲溶液与乙腈混合液，其中磷酸盐缓冲溶液浓度为2‰
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
检测波长：210nm
进样量：20μl
是按下列步骤测定维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的：
一、制备供检发酵液溶液：精密量取维生素C二步发酵法的发酵液5.0ml，注入50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，制成供检发酵液溶液；
二、制备对照品溶液：精密称取葡萄糖酸标准品50mg，加入50ml容量瓶中，加流动相至刻度，溶解摇匀，过滤，制成1mg/ml的液体，作为对照品溶液；
三、取供检发酵液溶液注入液相色谱仪，和对照品溶液按照本方法的色谱条件进样，按外标法计算供检发酵液中葡萄糖酸的含量，即得维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸的含量。
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