CN117554512A - 一种简便的β-烟酰胺单核苷酸差向α-异构体及其他有关物质检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析检测技术领域，公开了一种同时测定β‑烟酰胺单核苷酸(β‑NMN)中α‑异构体和其他有关物质的方法。无需利用昂贵的液相色谱质谱联用仪、样品衍生处理复杂操作等，仅采用一种HPLC方法，即可实现同时对α‑异构体和多种有关物质如烟酰胺、ATP、ADP、AMP、烟酰胺氧化物等的定量检测，对于活性成分β‑NMN的绝对含量测定意义重大，色谱柱采用：Ultimate Amino Acid色谱柱，流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液，流动相B为乙腈，流速为0.6ml/min，柱温30℃，采用梯度洗脱方式，经研究证明本方法准确度高、重复性、线性等良好，结果准确可靠，是一种高效、低成本的检测方法，满足生产企业和监管机构日常检验需要。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，特别涉及一种同时测定β-烟酰胺单核苷酸中α-异构体和其他有关物质的方法。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(NMN)，是维生素B3(烟酰胺)的衍生物，含α和β两种构型，研究表明仅β构型具有生物活性，是人体中主要能量物质、长寿蛋白辅因子NAD+的前体。且随着人类年龄的增大，身体中NAD+持续减少，导致人体中细胞功能下降，从而导致人体衰老，新陈代谢失调等。目前NMN在抗衰老领域取得广泛的关注，同时在医药治疗领域和化工合成方面具有广泛的应用前景。
NMN制备方法，目前主流有化学合成和酶法，不管是化学合成方法还是酶法，均涉及到产生差向异构体α-异构体的问题，如何定量鉴定β-烟酰胺单核苷酸中α-异构体，对于β-烟酰胺单核苷酸的绝对活性成分含量表征很重要，目前公开α-异构体检测方法的资料很少。
专利CN115876932A公开了一种同时测定食品中烟酰胺单核苷酸α、β异构体的方法，但是其采用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)，仪器昂贵，且需要对样品进行衍生化前处理，检验需要采用标准曲线方法，操作繁琐，并不适合企业常规检验。
专利CN113358776 B公布了一种同时检测NMN中多种有关物质的HPLC方法，但是并不适合检测α-异构体。
目前迫切需要开发一种简单快速、能同时检测β-烟酰胺单核苷酸中差向异构体即α-异构体和其他有关物质的方法来更好地满足生产企业过程控制检测、产品检验以及和监管机构检验需求。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种能够简便快速测定β-烟酰胺单核苷酸中α-异构体的检测方法，以便更好地表征生物活性成分：β-烟酰胺单核苷酸的绝对含量，另一方面，本发明的检验方法，也可以同时测定β-烟酰胺单核苷酸中其他多个有关物质(杂质)，如烟酰胺氧化物、三磷酸腺苷ATP、二磷酸腺苷ADP、单磷酸腺苷AMP和烟酰胺，实现采用一个方法，同时检测α-异构体和多个有关物质的目的，成本低、效率高，极大地便利了生产企业日常检验以及监管机构监督检验需要，
本发明的目的通过下述方案实现：
一种同时测定β-烟酰胺单核苷酸α-异构体、多个有关物质含量的方法，采用Ultimate Amino Acid色谱柱(4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)，按照HPLC方法进行分离检测，包括以下步骤：
1.色谱分离条件：流动相A：0.01mol/L的磷酸二氢钾缓冲液溶液，调节pH值至6.0；流动相B：乙腈，流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长为260nm；进样体积10μL，按照下表进行梯度洗脱：
表1梯度洗脱
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 10 | 100 | 0 |
| 15 | 40 | 60 |
| 20 | 40 | 60 |
| 20.1 | 100 | 0 |
| 35 | 100 | 0 |
2.系统适用性溶液配制：精密称取β-烟酰胺单核苷酸α-异构体、烟酰胺氧化物、三磷酸腺苷ATP、二磷酸腺苷ADP、单磷酸腺苷AMP、烟酰胺与β-烟酰胺单核苷酸对照品各适量，加水溶解并稀释制成每1ml约含α-异构体、烟酰胺氧化物、ATP、ADP、AMP、烟酰胺各3.0μg与β-烟酰胺单核苷酸1.5mg的混合溶液。
进一步地，系统适用性溶液色谱图(见附图3)中，出峰顺序依次为α-异构体、β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺氧化物、ATP、ADP、AMP与烟酰胺，其中α-异构体峰与β-烟酰胺单核苷酸峰之间的分离度应不小于2.0。
3.β-烟酰胺单核苷酸储备液：取β-烟酰胺单核苷酸对照品12mg，精密称定，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为β-烟酰胺单核苷酸储备液，
4.杂质储备液：精密称取α-异构体、烟酰胺氧化物、ATP、ADP、AMP与烟酰胺各约10mg，各置于20ml容量瓶中，加入一定纯化水，溶解、稀释至刻度，作为各杂质储备液。
5.对照品溶液：精密称取上述(3)和(4)各储备液约3ml，置于100ml容量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，摇匀。
6.β-烟酰胺单核苷酸供试品溶液：精密称取β-烟酰胺单核苷酸样品适量约75mg，置于50ml容量瓶，加入纯化水溶解、稀释至刻度，加水溶解并稀释制成每1ml中约含1.5mg的溶液。
7.加标供试品溶液：精密称取烟酰胺单核苷酸约75mg，置于50ml容量瓶中，然后加入精密量取的上述(4)对照品溶液3ml，加入纯化水稀释至刻度。
8.测量记录：精密量取空白溶液，加标供试品溶液、对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入HPLC色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算。
本发明采用的HPLC方法，经过方法学验证，线性良好、准确度高、精密度良好等，符合分析检测方法技术指南要求，满足日常检验需求。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种简便的HPLC方法，可以检测β-烟酰胺单核苷酸中α-异构体，较现有技术采用昂贵的LC-MS仪器、复杂的样品处理和检测程序，更加快速、高效、低成本，适合生产企业日常检验需求。
本发明提供一种简便的HPLC方法，可以同时检测β-烟酰胺单核苷酸中α-异构体和其他多个有关物质含量，如烟酰胺氧化物、ATP、ADP、AMP与烟酰胺，具有一个检测方法，多种杂质检测能力的优势，尤其适合生产中快速过程控制检测和成品检测的需求。
附图说明
图1为α-烟酰胺单核苷酸结构式；
图2为β-烟酰胺单核苷酸结构式；
图3为系统适用性图谱。
具体实施方式：
下述实施例中使用的物质对照品为市售采购获得，纯度符合要求(＞99.5％)，试剂、溶剂等均符合色谱级，β-烟酰胺单核苷酸样品为自制产品和采购市售获得。以下实施例主要是为了更好地理解本发明的分析方法，并未穷尽所有操作方式。
方法学验证-线性和范围
分别精密移取β-烟酰胺单核苷酸储备液1ml和各杂质储备液各1.8ml，置25ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，作为混合储备液。再精密量取混合储备液0.2ml、0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml分别置20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为20％、50％、80％、100％、120％的线性溶液。精密量取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作线性方程，结果分别为：
α-异构体线性回归方程为y＝0.2401x+0.0002，相关系数R2为0.9998；
烟酰胺氧化物线性回归方程为y＝0.2884x-0.0001，相关系数R2为0.9998；
ATP线性回归方程为y＝0.2630x+0.0004，相关系数R2为0.9997；
ADP线性回归方程为y＝0.2993x+0.0002，相关系数R2为0.9998；
AMP线性回归方程为y＝0.2644x+0.0006，相关系数R2为0.9995；
烟酰胺线性回归方程为y＝0.2713x-0.0003相关系数R2为0.9996；
β-烟酰胺单核苷酸线性回归方程为y＝0.2875x+0.0020，相关系数R2为0.9998；
上述结果表明以该方法测试α-异构体及各有关物质含量，在0.055～1.423μg/ml浓度范围内，线性关系良好。
方法学验证-检出限和定量限
根据“线性和范围”项下线性溶液所得色谱图的信噪比，配制一定浓度的溶液进行梯度稀释，定量限以信噪比10～15计，检测限以信噪比2～5计，分别进样确定α-异构体及各有关物质的检测限和定量限，结果如下表2。
表2检出限和定量限结果
方法学验证-准确度
(1)供试品储备液：取β-烟酰胺单核苷酸供试品约120mg，精密称定，置20ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
(2)杂质混合储备液：精密量取各杂质储备液1ml于25ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，即得。
(3)浓度选择：按照各杂质限度(按照不超过0.2％控制)的80％、100％、120％三个点配制。
80％供试溶液：精密量取供试品储备液1ml和杂质混合储备液0.4ml，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀；配制3份。
100％供试溶液：精密量取供试品储备液1ml和杂质混合储备液0.5ml，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀；配制3份。
120％供试溶液：精密量取供试品储备液1ml和杂质混合储备液0.6ml，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀；配制3份。
(4)供试品基质溶液：精密量取供试品储备液1ml，置10ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀。
精密量取上述各溶液10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率，结果显示，α-异构体及各有关物质三个浓度点的平均回收率均在92％～105％范围内，RSD均小于2％，证明该方法准确度良好，见下表3。
表3回收率结果
方法学验证-重复性
精密称取β-烟酰胺单核苷酸样品适量约10mg，置于20ml容量瓶，加入纯化水溶解，再加入上述实施例3(2)杂质混合储备液1ml，加纯化水稀释至刻度，摇匀，配制6份，测定6份样品中α-异构体及各有关物质，6次测定结果的RSD均小于3％，符合验证要求，证明该方法重复性良好，结果见下表4。
表4重复性结果
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | AVE | RSD |
| α-异构体 | 0.200％ | 0.201％ | 0.203％ | 0.200％ | 0.202％ | 0.200％ | 0.201％ | 0.63％ |
| 烟酰胺氧化物 | 0.209％ | 0.211％ | 0.205％ | 0.203％ | 0.211％ | 0.211％ | 0.208％ | 1.7％ |
| ATP | 0.231％ | 0.230％ | 0.235％ | 0.237％ | 0.232％ | 0.239％ | 0.234％ | 1.5％ |
| ADP | 0.200％ | 0.204％ | 0.198％ | 0.197％ | 0.202％ | 0.207％ | 0.201％ | 1.9％ |
| AMP | 0.215％ | 0.207％ | 0.199％ | 0.208％ | 0.203％ | 0.210％ | 0.207％ | 2.7％ |
| 烟酰胺 | 0.251％ | 0.248％ | 0.252％ | 0.247％ | 0.260％ | 0.25％ | 0.252％ | 1.8％ |
样品检验
各供试品，按照上述方法配制对应的供试品溶液和加标溶液，精密量取空白溶液、加标供试品溶液、对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入HPLC色谱仪，记录色谱图，流动相A：0.01mol/L的磷酸二氢钾缓冲液溶液，调节pH值至6.0；流动相B：乙腈，流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长为260nm；进样体积10μL，按照上表1进行梯度洗脱，结果汇总见下表5。
表5样品检验结果
| 项目 | 自制 | 厂家A | 厂家B | 厂家C | 厂家D |
| α-异构体 | 未检出 | 0.02％ | 0.08％ | 0.05％ | 0.04％ |
| 烟酰胺氧化物 | 0.01％ | 0.03％ | 0.20％ | 0.03％ | 0.33％ |
| ATP | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 0.19％ |
| ADP | 未检出 | 未检出 | 0.18％ | 0.06％ | 0.20％ |
| AMP | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 0.36％ |
| 烟酰胺 | 0.05％ | 0.24％ | 0.22％ | 0.11％ | 0.14％ |
| 纯度 | 99.9％ | 99.7％ | 99.3％ | 99.7％ | 98.7％ |
Claims (1)
1.一种同时测定β-烟酰胺单核苷酸中α-异构体和其他有关物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用Ultimate Amino Acid色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，按照HPLC方法进行分离检测，色谱分离条件：流动相A：0.01mol/L的磷酸二氢钾缓冲液溶液，调节pH值至6.0；流动相B：乙腈，流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长为260nm；进样体积10μL，按照下表进行梯度洗脱：
步骤2：系统适用性溶液配制：取β-烟酰胺单核苷酸α-异构体、烟酰胺氧化物、三磷酸腺苷ATP、二磷酸腺苷ADP、单磷酸腺苷AMP、烟酰胺与β-烟酰胺单核苷酸对照品各适量，加水溶解并稀释制成每1ml含α-异构体、烟酰胺氧化物、ATP、ADP、AMP、烟酰胺各3.0μg与β-烟酰胺单核苷酸1.5mg的混合溶液；
步骤3：β-烟酰胺单核苷酸储备液配制：取β-烟酰胺单核苷酸对照品12mg，精密称定，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为β-烟酰胺单核苷酸储备液；
步骤4：杂质储备液配制：精密称取α-异构体、烟酰胺氧化物、ATP、ADP、AMP与烟酰胺各10mg，各置于20ml容量瓶中，加入纯化水，溶解、稀释至刻度，作为各杂质储备液；
步骤5：对照品溶液：精密称取步骤(3)和步骤(4)各储备液3ml，置于100ml容量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，摇匀；
步骤6：β-烟酰胺单核苷酸供试品溶液配制：精密称取β-烟酰胺单核苷酸样品75mg，置于50ml容量瓶，加入纯化水溶解、稀释至刻度，加水溶解并稀释制成每1ml中含1.5mg的溶液；
步骤7：加标供试品溶液配制：精密称取烟酰胺单核苷酸约75mg，置于50ml容量瓶中，然后加入精密量取的上述步骤(4)对照品溶液3ml，加入纯化水稀释至刻度；
步骤8：测量记录：精密量取空白溶液，加标供试品溶液、对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入HPLC色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算。
Priority Applications (1)
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