CN117486751A - 采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域，公开了一种采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，所述方法采用反相高效液相色谱法对奥马环素异构体进行分离，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其中，所述高效液相色谱法以磷酸盐缓冲液‑乙腈为流动相，流动相A相为磷酸盐缓冲液，流动相B相为乙腈。实现奥马环素与奥马环素异构体的完全分离，奥马环素与异构体的分离度大于3.0，有效的保证后续制药过程中反应物的异构体质量可控，并为奥马环素质量标准的制订及制备工艺的筛选提供数据支持和参考，在生产质量控制方面具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及一种采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法。
背景技术
奥马环素(Omadacycline)是一种新型9-氨甲基环素类药物，其抗菌谱广，与其他类型抗生素无交叉耐药性，对临床常见革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、非典型病原体、厌氧菌等均具有良好的抑菌活性。
经实验结果表明，奥马环素在原料合成、制剂生产和存放等过程中，都有可能降解出相关杂质，尤其是奥马环素异构体杂质，因此，在药物合成过程中是需要严格进行质量控制的。
目前国内还未见有奥马环素异构体分析方法的文献报道，该药物也没有统一的药物标准，因此，为了更好地控制奥马环素产品的质量，需要建立一套简单可靠并稳定有效的方法来进行本品的异构体进行检测，解决合成工艺引入的或者降解及制剂加工过程产生的异构体杂质对产品纯度测定的干扰。
发明内容
为了解决奥马环素在原料合成、制剂生产和存放等过程中降解出的相关杂质，尤其是奥马环素异构体杂质的问题，本发明提供了一种采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，所述方法采用反相高效液相色谱法对奥马环素异构体进行分离，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其中，所述高效液相色谱法以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，流动相A相为磷酸盐缓冲液，流动相B相为乙腈。
进一步地，所述反相高效液相色谱法采用下列条件进行奥马环素异构体分离：
| 时间min | 流动相A％V/V | 流动相B％V/V |
| 0.0 | 85 | 15 |
| 35.0 | 65 | 35 |
| 45.0 | 35 | 65 |
| 50.0 | 35 | 65 |
| 50.1 | 85 | 15 |
| 60.0 | 85 | 15 |
。
进一步地，所述磷酸盐缓冲液为含33mmol/L磷酸氢二钾及2mmol/L乙二胺四乙酸二钠的混合溶液。
进一步地，所述反相高效液相色谱法采用下列条件进行：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶Welch Utimate XB-C18；流动相的流速：0.8～1.2ml/min；柱温：37～43℃；检测器：紫外检测器。
进一步地，所述流动相的流速为1.0ml/min。
进一步地，所述柱温为40℃。
进一步地，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4-7.6。
进一步地，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.5。
进一步地，对所述奥马环素异构体进行分离时，通过下述步骤计算获取奥马环素异构体的含量：
配置适用性溶液、供试品溶液及空白稀释剂，各取相同容积含量注入液相色谱仪中并记录色谱图，再根据色谱图采用面积归一法计算出供试品中奥马环素异构体的含量。
进一步地，所述适用性溶液的配置，包括：
分别量取适量的奥马环素及奥马环素异构体，加稀释剂制成含奥马环素1.3mg/ml、奥马环素异构体19.5μg/ml的混合溶液，将所述混合溶液作为适用性溶液。
进一步地，所述供试品溶液的配置，包括：
量取适量的奥马环素，加稀释剂配制成1.3mg/ml的溶液，将所述溶液作为供试品溶液。
进一步地，所述稀释剂为纯水。
本发明的有益效果至少包括：采用本发明提供的高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，实现奥马环素与奥马环素异构体的完全分离，奥马环素与异构体的分离度大于3.0，有效的保证后续制药过程中反应物的异构体质量可控，并为奥马环素质量标准的制订及制备工艺的筛选提供数据支持和参考，在生产质量控制方面具有重要的意义。
附图说明
图1为实施例1空白溶剂色谱图。
图2为实施例1系统适用性溶液测定的色谱图。
图3为实施例1奥马环素供试品溶液测定的色谱图。
图4为实施例6系统适用性溶液测定的色谱图。
图5为实施例6奥马环素供试品溶液测定的色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域谱通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
奥马环素的化学结构式如下：
本发明提供了一种采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，所述方法采用反相高效液相色谱法对奥马环素异构体进行分离，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其中，所述高效液相色谱法以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，流动相A相为磷酸盐缓冲液，流动相B相为乙腈。
本发明提供的最优分析条件如下：
检测器：紫外检测器；
色谱柱：Welch Utimate XB-C18；
流动相：A相：33mmol/L磷酸氢二钾与2mmol乙二胺四乙酸二钠混合溶液，pH为7.5；B相：乙腈，流动相比例如下；
| 时间min | 流动相A％V/V | 流动相B％V/V |
| 0.0 | 85 | 15 |
| 35.0 | 65 | 35 |
| 45.0 | 35 | 65 |
| 50.0 | 35 | 65 |
| 50.1 | 85 | 15 |
| 60.0 | 85 | 15 |
流速：1.0ml/min；
柱温：40℃；
磷酸盐缓冲液的pH调节剂为磷酸。
实施例1
本实施例为专属性的试验，通过以下步骤：
稀释剂：纯水；
供试品溶液配制：取供试品32.5mg，精密称定，置于25ml量瓶中，用稀释剂稀释至25ml，摇匀，即得供试品溶液；
异构体定位溶液：取异构体适量，精密称定，置于量瓶中，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含异构体19.5μg的溶液，作为异构体定位溶液；
系统适用性溶液：分别精密量取奥马环素及奥马环素异构体，用稀释剂稀释制成每1ml含奥马环素约1.3mg，奥马环素异构体19.5μg的混合溶液；
实验测定：取空白溶剂，供试品溶液、异构体定位溶液和系统适用性溶液各10μl，注入高效液相色谱仪；
色谱条件：
色谱柱：Welch Utimate XB-C18，4.6*250mm 5um；
检测波长：280nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：40℃；
进样量：10μl；
流动相：磷酸盐缓冲液，乙腈，流动相比例如下；
| 时间min | 磷酸盐缓冲液％V/V | 乙腈％V/V |
| 0.0 | 85 | 15 |
| 35.0 | 65 | 35 |
| 45.0 | 35 | 65 |
| 50.0 | 35 | 65 |
| 50.1 | 85 | 15 |
| 60.0 | 85 | 15 |
磷酸盐缓冲液：取磷酸氢二钾三水化合物7.5g，乙二胺四乙酸二钠0.68g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH至7.5；
记录色谱图：结果见图1-图3；
结果表明：空白无干扰，主成分与异构体之间分离度大于3.0，专属性良好。
实施例2
本实施例为检测限和定量限的确定，检测限(LOD)，又称为检出限，指由基质空白所产生的仪器背景信号的3倍值的相应量，或者以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差；定量限(LOQ)，是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度，定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。
具体实施步骤包括以下：
溶液配制：取奥马环素异构体适量，精密称定，用稀释剂逐级稀释成一系列溶液，并将定量限溶液平行配制6份分别测试，在实施例1所述的色谱条件下进样分析，考察峰面积的RSD，确认方法在定量限浓度下的精密度，采用信噪比(S/N)法分别确定本品定量限(LOQ)和检测限(LOD)；
以信噪比S/N≥10:1计算，对应供试品浓度为定量限；以信噪比S/N≥3:1计算，对应供试品浓度为检测限，结果如表1和表2所示：
表1定量限结果
表2检测限结果
| 名称 | 定量限浓度 | 峰面积 | S/N |
| 奥马环素异构体 | 0.269μg/ml | 1742 | 3.16 |
结果表明：奥马环素异构体定量限峰面积的RSD不大于10.0％；以供试品浓度1.3mg/ml计算，异构体定量限检测限度为0.05％，异构体检出限度为0.02％。结果证明，该方法灵敏度高，可以充分满足奥马环素异构体检测的要求。
实施例3
本实施例为获取奥马环素与奥马环素异构体的线性关系，通过下述步骤实施：
稀释剂：纯水；
溶液配制：取奥马环素和奥马环素异构体适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成含各组分浓度为限度浓度至限度浓度200％的系列线性溶液。精密量取上述线性溶液各10μl，注入液相色谱仪，在实施例1所述的色谱条件下进样分析，记录色谱图，以浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。结果见表3：
表3线性试验结果
结果表明：奥马环素在浓度0.574～70.585μg/ml、奥马环素异构体在浓度0.672～41.297μg/ml范围内与峰面积称良好的线性关系，其相关系数r均不小于0.999，奥马环素异构体相对奥马环素的相对响应因子为1.04，可认为其响应相当。
实施例4
本实施例通过下述步骤验证本发明提供的方法的准确度，包括：
溶剂：纯水；
供试品溶液：取奥马环素化合物约32.5mg，精密称定，置于25ml量瓶中，用溶剂稀释至25ml，摇匀；
异构体贮备液：取异构体适量，精密称定，置于量瓶中，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含异构体0.26mg的溶液，作为异构体贮备液；
异构体定量限贮备液：取异构体适量，精密称定，置于量瓶中，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含异构体6.8μg/ml的溶液，作为异构体定量限贮备液；
LOQ％准确度溶液：取奥马环素化合物约32.5mg，精密称定，置于25ml量瓶中，精密加入异构体贮备液2.5ml，加稀释剂稀释至25ml，摇匀，同法配制三份；
100％准确度溶液：取奥马环素化合物约32.5mg，精密称定，置于25ml量瓶中，精密加入异构体贮备液2ml，加稀释剂稀释至25ml，摇匀，同法配制三份；
200％准确度溶液：取奥马环素化合物约32.5mg，精密称定，置于25ml量瓶中，精密加入异构体贮备液4ml，加稀释剂稀释至25ml，摇匀，同法配制三份；
精密量取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，按实施例1的色谱条件测定，记录色谱图。试验结果见表4。
表4回收率试验结果
结果表明：在奥马环素异构体的定量限浓度至限度浓度200％范围内，异构体回收率均在80％～120％之间，回收率RSD均小于10.0％，方法准确度良好。
实施例5
本实施例通过下述步骤验证本发明提供的方法的重复性，包括：
溶剂：纯水；
供试品溶液：同实施例4中100％水平准确度溶液，平行配制6份；
精密量取上述各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算各杂质的含量。结果见表6：
表6重复性试验结果
结果表明：6份加样供试品溶液中，各杂质含量RSD均小于10.0％，该方法重复性良好。
实施例6
本实施例通过下述步骤对样品进行测定，具体包括：
供试品溶液配制：取奥马环素化合物约32.5mg，精密称定，置于25ml量瓶中，用稀释剂稀释至25ml，摇匀；
异构体定位溶液：取异构体适量，精密称定，置于量瓶中，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含异构体19.5μg的溶液，作为异构体贮备液；
系统适用性溶液：分别精密量取奥马环素及奥马环素异构体。用稀释剂稀释制成每1ml含奥马环素约1.3mg，奥马环素异构体19.5μg的混合溶液；
实验测定：取空白溶剂，供试品溶液、异构体定位溶液和系统适用性溶液各10μl，注入高效液相色谱仪；
色谱条件：
色谱柱：Welch utimate XB-C18，4.6*250mm 5um；
检测波长：280nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：40℃；
进样量：10μl；
流动相：磷酸盐缓冲液，乙腈，流动相比例如下；
| 时间min | 磷酸盐缓冲液％V/V | 乙腈％V/V |
| 0.0 | 85 | 15 |
| 35.0 | 65 | 35 |
| 45.0 | 35 | 65 |
| 50.0 | 35 | 65 |
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磷酸氢二钾缓冲液：取磷酸氢二钾三水化合物7.5g，乙二胺四乙酸二钠0.68g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH至7.5；
测定方法：分别取上述各溶液10μl，按照上述色谱条件测定，记录色谱图，结果如图4-5。
本发明通过提供的采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，实现奥马环素与奥马环素异构体的完全分离，且主成分与异构体的分离度大于3.0；同时通过检测分析化合物奥马环素异构体，有效保证后续制药过程中反应物的异构体质量可控，并且为奥马环素质量标准的制订及制备工艺的筛选提供数据支持和参考，在生产及质量控制方面具有重要的现实意义；达到更好地控制奥马环素产品的质量，建立一套简单可靠并稳定有效的方法来进行奥马环素有关物质的检测，解决合成工艺引入的或者降解及制剂加工过程中产生的异构体杂质对产品纯度测定的干扰。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，其特征在于：所述方法采用反相高效液相色谱法对奥马环素异构体进行分离，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其中，所述高效液相色谱法以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，流动相A相为磷酸盐缓冲液，流动相B相为乙腈。
2.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱法采用下列条件进行奥马环素异构体分离：
。
3.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液为含33mmol/L磷酸氢二钾及2mmol/L乙二胺四乙酸二钠的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱法采用下列条件进行：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶Welch Utimate XB-C18；
流动相的流速：0.8～1.2ml/min；
柱温：37～43℃；
检测器：紫外检测器。
5.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4-7.6。
6.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，其特征在于：对所述奥马环素异构体进行分离时，通过下述步骤计算获取奥马环素异构体的含量：
配置适用性溶液、供试品溶液及空白稀释剂，各取相同容积含量注入液相色谱仪中并记录色谱图，再根据色谱图采用面积归一法计算出供试品中奥马环素异构体的含量。
7.根据权利要求6所述的采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，其特征在于：所述适用性溶液的配置，包括：
分别量取适量的奥马环素及奥马环素异构体，加稀释剂制成含奥马环素1.3mg/ml、奥马环素异构体19.5μg/ml的混合溶液，将所述混合溶液作为适用性溶液。
8.根据权利要求6所述的采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，其特征在于：所述供试品溶液的配置，包括：
量取适量的奥马环素，加稀释剂配制成1.3mg/ml的溶液，将所述溶液作为供试品溶液。
9.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法分离奥马环素异构体的方法，其特征在于：所述稀释剂为纯水。
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