CN112697893A - 一种红霉素菌渣中红霉素a残留效价的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法，包括以下步骤：制备供试品溶液；制备对照品溶液；测定红霉素A残留效价：取供试品溶液和对照品溶液，利用高效液相色谱法测定峰面积；高效液相色谱法的色谱条件为：流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为磷酸盐缓冲溶液，所述流动相B为乙腈，流动相A与流动相B的体积比为55:45，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱,流速为0.8‑1.2mL/min，柱温为25‑40℃，检测波长为215nm，进样量10μL；根据对照品和供试品的峰面积计算得到红霉素A残留效价。本发明检测方法灵敏度高、分离效率高、选择性好、重复性好、准确度高。
Description
技术领域
本发明属于测定菌渣残留效价技术领域，涉及一种红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法。
背景技术
我国是红霉素的生产大国，红霉素菌渣是在发酵生产硫氰酸红霉素提取后产生的废弃物，产生量非常巨大，菌渣中红霉素A的残留，将会导致畜禽和生态环境微生物的耐药性，从而对人类健康产生潜在的耐药风险，因此，我国明确规定红霉素菌渣不能直接用作饲料和肥料并将其列入危险废弃物。
红霉素A的结构具有一内酞胺环，母核为一氨基红霉素A烷酸，分子式为C37H67NO13，分子量为733.92700，结构式如下：
迄今为止，国内外尚没有一种检测红霉素菌渣中红霉素A残留效价的标准方法，故不能准确的检测红霉素菌渣中残留红霉素A的含量，无法确定其对环境可能的危害和影响，严重的制约了菌渣的资源化再利用，因此建立红霉素菌渣中红霉素A残留效价测定方法，明确判断与放行标准，排除红霉素菌渣中红霉素A残留对环境可能带来的负面影响，显得十分必要且具有极其重大的现实意义，为解决红霉素菌渣处理处置提供理论了依据。
红霉素菌渣中红霉素A残留效价较低，而且菌渣机质复杂，干扰物较多，因此，需要对待测物进行有效的提取分离，最大程度减小检测误差，以保证检测结果的准确性。因此，如何提供一种灵敏度高、分离效率高、选择性好、重复性好、准确度高的红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种准确的红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取待测红霉素菌渣，研磨，加入甲醇进行提取，离心，取上清液，得供试品溶液；
(2)制备对照品溶液：将红霉素A溶于甲醇中，得对照品溶液；
(3)测定红霉素A残留效价：取步骤(1)所得供试品溶液和步骤(2)所得对照品溶液，利用高效液相色谱法测定峰面积；
所述高效液相色谱法的色谱条件为：流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为磷酸盐缓冲溶液，所述流动相B为乙腈，流动相A与流动相B的体积比为50:50-60:40，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱,流速为0.8-1.2ml/min，柱温为25℃-40℃，检测波长为215nm，进样量10μL；
根据对照品和供试品的峰面积计算得到红霉素A残留效价。
进一步，步骤(1)中，所述红霉素菌渣为灭活的喷雾干燥红霉素菌渣固体或红霉素菌渣液体；
所述红霉素菌渣固体研磨后的粒径为D97≤300μm；
所述红霉素菌渣液体研磨后的粒径为D97≤50μm。
进一步，步骤(1)中，所述红霉素菌渣固体的添加量为每25ml甲醇添加红霉素菌渣固体2-10g,优选为红霉素菌渣固体的添加量为每5ml甲醇添加红霉素菌渣固体1g；所述红霉素菌渣液体的添加量为每25ml甲醇添加红霉素菌渣液体5-15g；优选为红霉素菌渣液体的添加量为每5ml甲醇添加红霉素菌渣液体2g。
进一步，步骤(1)中，所述提取为超声提取，所述超声提取的频率为40KHz，所述超声提取的时间为5-50min，优选为10min。
进一步，步骤(1)中，所述离心转速为3000-5000rpm，优选为4500rpm，所述离心时间为5-30min，优选为10min。
进一步，步骤(2)中，所述红霉素A的添加量为每1mL甲醇添加4mg红霉素A。
进一步，步骤(3)中，所述流动相A的浓度为0.001-0.01mol/L，优选为0.025mol/L。
进一步，步骤(3)中，所述流动相A与流动相B的体积比为55:45，流速为1.0mL/min，柱温为35℃。
流速低会使运行时间过长，流速高会导致峰型不好，柱温过高会导致样品保留时间不稳，柱温过低分离时间会延长。
进一步，步骤(3)中，所述红霉素A残留效价是通过下式计算得到：
式中：x-红霉素A残留效价,μg/g；m对—对照品的质量，mg；m样—样品质量，g；P—对照品中红霉素A的百分含量,％；A对—对照品的峰面积；A样—样品的峰面积；D样—样品的稀释倍数；D对—对照品的稀释倍数；1000—单位换算系数。
本发明的有益效果是：本发明基于红霉素A的特性，采用甲醇对菌渣进行提取，降低复杂基质对目标分析物的干扰，提高检测结果的准确度，本发明利用高效液相色谱法测定红霉素菌渣中红霉素A残留效价，本发明检测方法具有灵敏度高、分离效率高、选择性好、复性好、准确度高的优点，检测限可达0.0085μg/ml，定量限可达0.0425μg/ml。
附图说明
图1为实施例1中FAS-1910043批红霉素A残留效价图谱；
图2为实施例2中FAL-1910050批红霉素A残留效价图谱；
图3为实验例5中红霉素A残留效价测定方法定量限图谱；
图4为实验例5中红霉素A残留效价测定方法检测限图谱；
图5为实验例3中红霉素A对照品图谱；
图6为实验例6中0.38mg/ml的加标浓度红霉素A回收率图谱。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
1)材料与试剂
红霉素A(欧标)
2)主要仪器及试剂
磷酸氢二钾：级别：AR 厂家：国药集团化学试剂有限公司；
乙腈：级别：HPLC 厂家：国药集团化学试剂有限公司；
甲醇：级别：HPLC 厂家：天津市科密欧化学试剂有限公司；
超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；
高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；
高效液相色谱仪Agilent1260(安捷伦科技有限公司)；
色谱柱(型号：X-Bridge规格：4.6*250mm*5um厂家：沃特世科技有限公司)；
容量瓶(规格：100ml、1000ml厂家：天津市天科玻璃仪器制造有限公司)。
实施例1
固体喷雾干燥灭活红霉素菌渣中红霉素A残留效价测定
1)流动相的配制
流动相A为0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液；流动相B为乙腈；流动相A：流动相B为55:45。
2)固体红霉素菌渣的提取分离
取喷雾干燥灭活的固体红霉素菌渣样，使用中等力度用研磨钵研磨300圈以上，研磨至细腻均一的粉状，使其粉末粒度为D97＝218.01μm；称取喷雾灭活红霉素菌渣研磨样5g(精确至0.1mg)，于50ml容量瓶中，加入适量甲醇，涡旋振荡1min，超声辅助提取10min，以4500rpm离心10min，取上清液。
3)红霉素残留效价检测
a、色谱条件
色谱柱为Waters X-Bridge C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相A为0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液；流动相B为乙腈；流动相A：流动相B为55:45；
流速为1.0ml/min；
柱温35℃；
波长为215nm；
进样量10μl。
b、系统适用性溶液的配制
称取红霉素标准品约40mg两份，精密称定，分别置于两个10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照溶液。每份对照溶液进样2次，完成系统适用性实验。红霉素峰(指吸收峰，下同)与相邻杂质峰间的分离度应大于1.5，理论塔板数不得低于3600，拖尾因子不得过2.5。
c、根据上述色谱条件，取待测液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，用外标法进行计算，公式如下：
由上式可推导公式如下：
式中：x—红霉素A残留效价,μg/g；m对—对照品的质量，mg；m样—样品质量，g；P—对照品中红霉素A的百分含量,％；A对—对照品的峰面积；A样—样品的峰面积；D样—样品的稀释倍数；D对—对照品的稀释倍数；1000—单位换算系数。
4)一批固体喷雾干燥灭活红霉素菌渣中红霉素残留测定结果数据
系统适用性试验及两批批喷雾干燥灭活红霉素菌渣中红霉素A残留的测定结果见图1和表1。
由系统适用性实验，即由对照溶液的液相色谱图可得出：对照品红霉素的保留时间为15.395min；红霉素峰面积为1783.75495[mAU*s]，结合图1中红霉素峰面积可计算得到红霉素残留效价，具体见表1。
表1实施例1中固体喷雾干燥灭活红霉素菌渣中红霉素残留测定结果
实施例2
液体灭活红霉素菌渣中红霉素A残留效价测定
1)流动相的配制
同实施例1中的步骤1)。
2)一批液体红霉素菌渣提取分离
取液体灭活红霉素菌渣样，称取液体灭活红霉素菌渣样5g(精确至0.1mg)，于50ml容量瓶中，加入适量甲醇，涡旋振荡1min，超声辅助提取30min，加甲醇稀释至刻度，以4500rpm离心10min，取上清液。
3)红霉素残留效价检测
同实施例1中的步骤3)。
4)一批液体灭活红霉素菌渣中红霉素A残留测定结果数据
系统适用性试验以及一批液体灭活红霉素菌渣中红霉素残A留测定结果见图2和表2。
由系统适用性实验，即由对照溶液的液相色谱图可得出：对照品中红霉素A峰的保留时间为15.154min；红霉素峰面积为1785.27130[mAU*s]，结合两批批液体灭活红霉素菌渣中红霉素A的峰面积(15.45156、7.61945)可计算得到红霉素残留效价，具体见表2。
表2实施例2中液体灭活红霉素中红霉素残留测定结果
以下用实验例的方式说明本发明的有益效果。
实验例3重复性实验
精密称取红霉素对照品约40mg两份，精密称定，分别置于两个10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀并按分析方法的色谱条件重复测定6次，结果见表3。
表3重复性实验
| 序号 | 红霉素保留时间(min) | 红霉素峰面积(mAU*s) |
| 1 | 15.469 | 1804.61218 |
| 2 | 15.459 | 1806.45020 |
| 3 | 15.443 | 1801.22144 |
| 4 | 15.430 | 1796.55554 |
| 5 | 15.417 | 1799.17029 |
| 6 | 15.408 | 1809.18335 |
| RSD | 0.036％ | 0.33％ |
结论：连续进样6次，保留时间的RSD为0.036％，峰面积的RSD为0.33％，表明重复性良好。
实验例4线性实验
精密称取红霉素A对照品约40mg于10ml容量瓶中，用纯甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，待用。
分别精密量取0.1ml、0.2ml、0.5ml对照溶液到100ml容量瓶中，用纯甲醇稀释至刻度分别得：1号约4.0mg/L、2号约8.0mg/L、3号约20.0mg/L的溶液，分别精密量取0.1ml、0.2ml、1.0ml对照溶液到10ml容量瓶中，用纯甲醇稀释至刻度分别得：4号约40.0mg/L、5号约80.0mg/L、6号约400.0mg/L的溶液。按分析方法的色谱条件进样，每个浓度进1针，记录色谱图。以浓度为纵坐标，红霉素A的峰面积为横坐标做线性回归，得到回归方程，结果见表4。
表4线性实验
结论：线性回归方程R2为0.99997，表明线性良好。
实验例5检测限与定量限
精密称取红霉素标准品约40mg于10ml容量瓶中，用纯甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，待用。精密量取0.1ml标准溶液到100ml容量瓶中，用纯甲醇稀释至刻度,摇匀后精密量取0.2ml于10ml容量瓶中，用纯甲醇稀释至刻度，再逐级稀释，进样，观察色谱图，以红霉素信噪比为10:1时相应浓度确定定量限，以红霉素信噪比为2-3:1时相应浓度确定检测限，结果见图3、图4和表5。
表5检测限和定量限测定结果
| 项目 | 浓度(μg/ml) | 信噪比 |
| 定量限 | 7.68 | 9.9 |
| 检测限 | 3.84 | 2.8 |
结论：检测限为3.84μg/ml，定量限为7.68μg/ml，能够满足测定要求。
实验例6回收率
精密称取红霉素标准品约40mg，用纯甲醇溶解并稀释至刻度，配成浓度约为4mg/ml的溶液，作为标准品溶液。
1)固体红霉素菌渣回收率
称取5g(精确至0.1mg)用研钵研磨至细腻均一粉状的喷干灭活的固体红霉素菌渣样于50ml容量瓶中，加入适量纯甲醇，涡旋振荡1min，超声提取30min，以4500rpm离心10min，取上清液做为供试品溶液。
精确吸取1.0ml的供试品溶液，9份，每3份分别加入0.2ml、0.5ml、1.0ml的对照品溶液至10ml容量瓶中，加纯甲醇定容，每份进样一次，结果见表6以及图5、图6，其中图5为红霉素标准品图谱，图6为固体红霉素菌渣浓度为0.38mg/ml的加标浓度红霉素回收率图谱。
表6固体红霉素菌渣回收率测定结果
1)液体红霉素菌渣回收率
称取5g(精确至0.1mg)用研钵研磨至细腻均一糊状的喷干灭活的液体红霉素菌渣样于50ml容量瓶中，加入适量纯甲醇，涡旋振荡1min，超声提取30min，以4500rpm离心10min，取上清液做为供试品溶液。
精确吸取1.0ml的供试品溶液，9份，每3份分别加入0.2ml、0.5ml、1.0ml的对照品溶液至10ml容量瓶中，加纯甲醇定容，每份进样一次，结果见表7。
表7液体红霉素菌渣回收率测定结果
结论：回收率在95.9％-101.5％之间，固体红霉素菌渣回收率9针的RSD值为1.3％，液体红霉素菌渣回收率9针的RSD值为2.2％，证实了该方法具有良好的回收率。
综上，本发明利用高效液相色谱法测定红霉素菌渣中红霉素残留效价，本发明检测方法具有灵敏度高、分离效率高、选择性好、复性好、准确度高的优点，检测限可达3.84μg/ml，定量限可达7.68μg/ml。
以上内容是结合具体的优先实施方式对本发明所作的进一步说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法，其特征在于,包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取待测红霉素菌渣，研磨，加入甲醇进行提取，离心，取上清液，得供试品溶液；
(2)制备对照品溶液：将红霉素A溶于甲醇中，得对照品溶液；
(3)测定红霉素A残留效价：取步骤(1)所得供试品溶液和步骤(2)所得对照品溶液，利用高效液相色谱法测定峰面积；
所述高效液相色谱法的色谱条件为：流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为浓度为磷酸盐缓冲溶液，所述流动相B为乙腈，流动相A与流动相B的体积比为55:45，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱,流速为0.8-1.2mL/min，柱温为25℃-40℃，检测波长为215nm，进样量10μL；
根据对照品和供试品的峰面积计算得到红霉素A残留效价。
2.根据权利要求1所述的一种红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述红霉素菌渣为灭活的喷雾干燥红霉素菌渣固体或红霉素菌渣液体；
所述红霉素菌渣固体研磨后的粒径为D97≤300μm；
所述红霉素菌渣液体研磨后的粒径为D97≤50μm。
3.根据权利要求1或2所述的一种红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述红霉素菌渣固体的添加量为每25ml甲醇添加红霉素菌渣固体2-10g；
所述红霉素菌渣液体的添加量为每25ml甲醇添加红霉素菌渣液体5-15g。
4.根据权利要求1所述的一种红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取为超声提取，所述超声提取的频率为40KHz，所述超声提取的时间为20-50min。
5.根据权利要求1所述的一种红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心转速为3000-5000rpm，所述离心时间为5-30min。
6.根据权利要求1所述的一种红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述红霉素A的添加量为每1mL甲醇添加4mg红霉素A。
7.根据权利要求1所述的一种红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述流动相A的浓度为0.001-0.01mol/L。
8.根据权利要求1所述的一种红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，流速为1.0mL/min，柱温为35℃。
9.根据权利要求1所述的一种红霉素菌渣中红霉素A残留效价的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述红霉素A残留效价是通过下式计算得到：
式中：x—红霉素A残留效价,μg/g；m对—对照品的质量，mg；m样—样品质量，g；P—对照品中红霉素A的百分含量,％；A对—对照品的峰面积；A样—样品的峰面积；D样—样品的稀释倍数；D对—对照品的稀释倍数；1000—单位换算系数。
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