CN101173912A - 化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特点在于：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C8柱或C18柱；采用紫外检测器或二极管阵列检测器在190－380nm处进行检测；以磷酸二氢铵溶液－乙腈缓冲液或磷酸二氢铵溶液－甲醇缓冲液为流动相；样品经无水甲醇或乙腈萃取，超声提取20min，再12000rpm/min离心约5min，取上清液作为供试样液，如有必要可再用0.45μm滤膜过滤备用；根据样品的保留时间和光谱图进行定性分析，根据其峰面积进行定量分析。该发明的优点在于：分辨率、灵敏度高，重现性、选择性好，样品预处理方法简单快捷，适宜化妆品中红霉素的微量分析。

Description

化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法

技术领域

本发明是一项利用高效液相色谱仪检测化妆品中红霉素的新技术，尤其适用于化妆品中微量抗生素-红霉素的定性及定量分析。

背景技术

红霉素(Erythromycin)是一种碱性抗生素，为大环内酯类抗菌药物，作为一种广谱高效的抗菌药物被广泛应用到药品、饲料、和化妆品中。红霉素对革兰阳性菌，如葡萄球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌等有较强的抑制作用；对革兰阴性菌，如淋球菌、螺旋杆菌、百日咳杆菌、以及流感嗜血杆菌也有相当的抑制作用；此外，对支原体、放线菌、螺旋体、立克次体、衣原体、少数分枝杆菌和阿米巴原虫都有抑制作用。由于其广谱高效的抑菌作用，红霉素被一些化妆品生产厂家，添加到祛痘类产品以达到消炎、祛痘、除螨及抗粉刺的目的。但这种药物同时也存在着很多不良反应，《中国药典》规定红霉素针剂仅能静脉内给药，严禁肌肉注射。若药液不慎漏入皮下或肌肉组织，轻者可引起局部剧烈的疼痛刺激，严重者可导致大片皮肤坏死、粘连，愈合后常形成疤痕；此外还可阻挠性激素类的肠肝循环；过量的红霉素能引起腹泻、恶心、呕吐、胃绞痛、口舌疼痛等，更严重的是长期接触此类药物会导致许多病原微生物产生抗药性，不利于疾病的治疗。因此，为保护化妆品消费者的健康安全，建立灵敏、准确、快速的化妆品中红霉素的检测方法是十分紧迫和必要的。

据各种文献报道，目前药品中红霉素的检测方法主要有抗生素微生物检定法、紫外分光光度法、液相色谱法、薄层色谱法、化学发光分析、二阶导数差示脉冲极谱法。抗生素微生物检定法是《中国药典》(2000年版)规定的检测药品中红霉素的方法，该方法周期长，操作繁琐，影响因素较多，精密度低。紫外分光光度法是比较经典的方法，但灵敏度不高，专属性差，不适于成分复杂样品的分析。薄层色谱法灵敏度高、选择性好，但重复性差，且检测步骤繁琐。化学发光分析、二阶导数差示脉冲极谱法虽然检测灵敏度高，但存在着仪器昂贵，设备不易普及等因素。高效液相色谱方法是目前检测红霉素药品较常用的方法，但也仅仅局限于各种红霉素药品制剂的含量检测，而化妆品、饲料、肉类中的红霉素含量的检测还没有出台相关的标准或方法，由于药品组分较少，基质简单，干扰因素较少，且样品预处理操作简便，目标检测物损失小，因此红霉素药品的含量易于检测。与药品不同，化妆品种类繁多，基质复杂，各成分的理化性质差别较大，干扰因素较多，尤其是红霉素作为化妆品禁用成分添加到化妆品中，其含量较低，以上所述各种方法很难准确的检测出化妆品中微量的红霉素成分，而且使用高效液相色谱检测化妆品中的红霉素的方法还没有文献报道。针对以上现有技术的不足，我们设计了一种用高效液相色谱方法检测化妆品中红霉素的方法，该方法专属性好，灵敏度高，且操作简单。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测化妆品中红霉素的分析方法，该项技术利用高效液相色谱仪不仅可以对化妆品中的红霉素进行准确的定性分析，而且还可以进行微量的定量分析。

本发明是用无水甲醇或乙腈提取化妆品中的红霉素，经超声萃取、离心、过滤等一系列操作，滤除固体杂质，直至滤液澄清，取制备好的样液上机，用磷酸二氢铵-乙腈缓冲液或磷酸二氢铵-甲醇缓冲液进行洗脱分离，在190-380nm波长下采集数据进行分析。所用高效液相色谱仪的主要配置包括十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱C8柱或C18柱，检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器。

本发明方法的主要分析步骤如下：

1样品预处理

称取一定量的化妆品(乳、膏、霜或水剂)于10ml刻度离心管中，加入3-7ml无水甲醇或乙腈，涡旋混匀使基质充分分散，定容至刻度，再超声提取15-30min，将提取液转移至Eppendorf管中，12000rpm/min离心5min，如果有必要可以再用0.45μm滤膜过滤备用。

2色谱条作

(1)色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱C8或C18柱；

(2)检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器；

(3)检测波长：选用190-380nm波长作为检测波长；

(4)流动相：采用0.01-1.00mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值为4.0-8.0)∶乙腈＝40～80％∶60～20％缓冲溶液或采用0.01-1.00mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值为4.0-8.0)∶甲醇＝40～80％∶60～20％缓冲溶液作为流动相，平衡色谱柱约20min，使基线平稳，该条件下保留时间适合，峰形对称，分离度好(R＞1.5)。

(5)流速：0.5～1.5ml/min；

(6)柱温：15～35℃。

3浓度计算方法

用红霉素标准物质配制成一定梯度浓度的标准液，20μl体积进样，按外标法，以峰面积-进样浓度作线性回归，得出线性回归方程，利用该方程和样品中红霉素的峰面积计算样品中的红霉素含量。

4样品检测

(1)按照1中的方法进行样品预处理，取处理好的样品20μl进样；然后再取适当浓度的红霉素标准溶液20μl进样。

(2)依照2中的色谱条件进行检测，分别得到样品的色谱图和红霉素标准品的色谱图；将样品的色谱图和标准品的色谱图进行比较，样品色谱图中与标准品保留时间相近(误差范围：标准品保留时间±0.5分钟)的色谱峰即为相应的红霉素成分，为了确保检测结果的准确性，可对初步确定的色谱峰进行光谱分析(光谱分析仅适用于二极管阵列检测器)，若与红霉素标准品的最大吸收波长及光谱图特征相似，可进一步确定样品中的红霉素成分。

(3)将样品中红霉素的色谱峰面积带入3中的线性回归方程中，计算样品中红霉素的浓度。

由于化妆品种类繁多、基质复杂，不能完全排除干扰成分与红霉素在同一时间出峰的可能。采用二极管阵列检测器可获得红霉素的紫外吸收光谱图，与标准品的光谱图对照，通过分析二者的最大吸收波长和光谱图特征，可进一步进行确认。

本发明的分析方法简便、快捷，灵敏度高，选择性、重复性好，适用于任何膏霜剂、乳剂、及水剂等各种剂型的化妆品中红霉素的检测。

附图说明

图1样品色谱图

图2红霉素标准品色谱图

图3样品光谱图

图4红霉素标准品光谱图

图5红霉素标准曲线图

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明：

1材料

1.1仪器

岛津自动进样高效液相色谱系统：Hypersil-ODS(150mm×4.6mm，5μm，柱号E1720574)色谱柱，SPD-M20A紫外可见光检测器，SPD-M20A二极管阵列检测器，LC-20AB二元高压梯度泵，SIL-20A自动进样系统，CTO-20A柱温箱及LCSolution色谱工作站。

1.2试剂和样品

乙腈(色谱纯)、无水甲醇(色谱纯)为Merck公司产品；磷酸二氢铵(分析纯)、三乙胺(分析纯)为天津科密欧试剂厂产品；超纯水由Milli-Q system制取。

红霉素标准品购于中国生物制品检定所，批号为130307-200215。

供试样品为碧颜抑痘精华、雪肌柔肤水(不含红霉素)。

1.3标准品储备液

精密称取40.00mg红霉素标准品置于10ml容量瓶中，加少许无水甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为4mg/ml的标准液作为储备液，于4℃冰箱中存放备用。

2方法

2.1色谱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)

检测器：SPD-M20A二极管阵列检测器

流动相：采用0.1mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值为5.90)∶乙腈＝60∶40缓冲溶液作为流动相。磷酸二氢铵溶液-乙腈缓冲体系的基线噪音比磷酸二氢铵溶液-甲醇的基线噪音小，且在pH值为5.90时峰性对称，分离度好。

检测波长：210nm。经190-380波长扫描，红霉素在197nm处有最大吸收，考虑到200nm接近末端吸收，溶剂吸收较强，干扰较大，而210nm波长处溶剂吸收相对较小，故选择210nm作为检测波长。

流速：1ml/min

柱温：25℃

2.2样品预处理

称取1.00g的化妆品(碧颜抑痘精华)于10ml刻度离心管中，加入5ml无水甲醇，涡旋混匀使基质充分分散，再超声提取20min，将提取液转移至Eppendorf管中，12000rpm/min离心5min，如果有必要可以再用0.45μm滤膜过滤，制成供试样品溶液。

2.3标准曲线

用无水甲醇将1.3中红霉素储备液稀释成如下梯度浓度的标准系列：0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml，取各浓度的标准溶液20μl进样，按2.1的色谱条件进行测定，得到各浓度的峰面积，作峰面积-浓度标准曲线，得到其线性回归方程(由高效液相色谱工作站完成计算工作)。

2.4精密度

取浓度为0.4mg/ml的红霉素标准溶液，每次进样20μl，连续进样5次，按2.1的色谱条件进行测定，记录峰面积，计算精密度。

2.5稳定性

取浓度为0.4mg/ml的红霉素标准溶液，在室温下放置，分别在0h、5.5h、8h、14h、25h进样，每次进样20μl，按2.1的色谱条件进行测定，比较测定结果的稳定性。

2.6重现性

取碧颜抑痘精华样品1.00g，按2.2中的方法处理样品，共做5个平行样，按2.1的色谱条件进行测定，计算相对标准偏差，比较重现性。

2.7加样回收率

精密称取不含红霉素的雪肌柔肤水样品5份各1.00克，每份加入2.0mg/ml的红霉素标准溶液各2ml，按2.2的样品预处理方法进行样品预处理，在2.1的色谱条件下进行测定，计算红霉素的回收率。

2.8样品检测

取20μl供试液进样，利用2.1中的色谱条件进行检测，获得样品的色谱图(图1)和光谱图(图3)；再取1.3中的红霉素标准品储备液稀释至为0.60mg/ml浓度，20μl进样，同样检测条件下，得到红霉素标准品的色谱图(图2)和光谱图(图4)。

3结果分析

按2.3的方法测定的红霉素各标准溶液0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml的峰面积分别为48.13030mm²、98.08345mm²、193.37650mm²、295.77676mm²、396.01746mm²、502.53531mm²、1032.63623mm²，作峰面积-浓度标准曲线(见图5)，得到其线性回归方程(由高效液相色谱工作站完成计算工作)：A(area)＝517.74C-5.274，R²＝0.9999，可见红霉素在0.1-2.0mg/ml的浓度范围内线性良好。

精密度试验的5次进样的峰面积分别为193.45709mm²、193.05008mm²、192.76521mm²、192.95746mm²、193.34682mm²，根据峰面积计算其相对标准偏差为0.15％，表明该方法精密度良好；稳定性试验的5次进样的峰面积分别为193.58943mm²、192.63081mm²、191.09543mm²、191.34327mm²、189.63548mm²，由峰面积计算其相对标准偏差为0.79％，表明红霉素甲醇溶液在室温下放置24小时比较稳定；重现性试验的5次进样的峰面积分别为248.56813mm²、237.06579mm²、239.64186mm²、235.35687mm²、230.98452mm²，以峰面积计算相对标准偏差为2.74％，说明该方法具有良好的重现性；加标回收率试验的5份平行样品的标准品回收量和回收率见表1，由此计算得到的相对标准偏差为1.80％。

由红霉素标准品的色谱图(图2)可以看出，利用2.1中的色谱检测条件得到红霉素标准品的保留时间为5.089min，将样品的色谱图(图1)和标准品的色谱图(图2)进行比较，可见样品色谱图中在5.127min处有一色谱峰与红霉素标准品色谱峰的保留时间5.089min相近，误差在±0.5分钟范围之内，因此可以初步确定样品色谱图中5.127min处的色谱峰为红霉素，该峰面积为239.79056mm²。将样品色谱图中5.127min处峰的光谱图(图3)与红霉素标准品的光谱图(图4)进行对比，可以发现样品的光谱图与标准品的光谱图的最大吸收波长及光谱图特征均相似，可进一步确定样品中保留时间为5.127min的组分为红霉素。

将样品中红霉素的色谱峰面积239.79056mm²代入线性回归方程中，即可得到样品处理液中红霉素的含量(由高效液相色谱工作站完成计算工作)，经计算可得碧颜抑痘精华样品中红霉素的含量为4.73mg/g。

该发明具有高分辨率，高灵敏度，重现性、选择性好且样品预处理方法简单的特点，适宜化妆品中红霉素的定性、定量分析。

本发明以大量实验和理论分析，找到了一种利用高效液相色谱仪检测化妆品中红霉素的分析方法，填补了化妆品中红霉素液相色谱分析方面的研究空白。

Claims (8)

1.一种化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用紫外检测器或二极管阵列检测器，使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱，以磷酸二氢铵-乙腈缓冲溶液或磷酸二氢铵-甲醇为流动相，采用190-380nm的检测波长，样品预处理采用无水甲醇或乙腈溶解样品，超声萃取，0.45μm滤膜过滤，以外标法定量计算样品中红霉素浓度。

2.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用紫外检测器或二极管阵列检测器。

3.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱。

4.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于流动相采用0.01-1.00mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值为4.0-8.0)∶乙腈＝40～80％∶60～20％或0.01-1.00mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值为4.0-8.0)∶甲醇＝40～80％∶60～20％，最佳流动相选择为0.1mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值为5.90)∶乙腈＝60％∶40％。

5.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用190-380nm波长进行检测，最佳检测波长为210nm。

6.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于所用流速为0.5-1.5ml/min，柱温为20-30℃，进样体积为20μl；其中最佳流速为1ml/min，最佳柱温为25℃。

7.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于样品预处理采用无水甲醇或乙腈溶解萃取，超声提取15-25min，0.45μm滤膜过滤。

8.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于样品分析后根据其保留时间和光谱图进行定性分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。

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